可以同时检测尿液和血清样本中α1-微球蛋白的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体地说涉及一种可以同时检测尿液和血清样本 中α?-微球蛋白的试剂盒。
【背景技术】
[0002] -微球蛋白（alpha-1-microglobulin'i-MG)是人体内的一种相对分子量较小的 糖蛋白。主要由人体肝细胞和淋巴细胞产生，广泛分布于包括血液、尿液、唾液等在内的各 种体液中，以游离性和高分子量结合型存在。在血液中 〇1-微球蛋白主要以游离型〇1-微球蛋 白、与免疫球蛋白IgA结合形式、与白蛋白结合形式存在。游离型^-微球蛋白能自由通过肾 小球滤过膜，在近曲小管几乎全部被重吸收并分解代谢，而高分子量的结合型~-微球蛋白 则不能通过肾小球滤过，故正常人尿液中仅存在游离型^-微球蛋白，若肾小球滤过膜受 损，结合型aHt球蛋白亦可出现于尿液中，因此血清 αι_微球蛋白能敏感地反应肾小球滤过 功能的改变。而正常情况下，通过肾小球滤过膜的游离型^-微球蛋白约99.9%被肾小管重 吸收，仅有微量排除体外，当近端小管功能受损时，重吸收效率降低，使得尿中-微球蛋白 排泄量急剧增加。因此，尿W-微球蛋白被认为是近端小管功能轻微损伤的敏感指标。人血 清中α :-微球蛋白的正常参考值为18.7±4.3mg/L，人尿中αι-微球蛋白的正常参考值为 2.14±1.2mg/L，当肾小球滤过功能受损时，血中w-微球蛋白年度可升高数倍，最高可升高 十余倍，当肾小管重吸收功能受损时，尿中W-微球蛋白亦可升高数倍。 Ql-微球蛋白在肾功 能检查中，作为早期肾病的敏感指标，在门诊、健康诊断等领域中被广泛使用。
[0003] 目前临床上广泛使用的〇1-微球蛋白检测方法是酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫 比浊法。酶联免疫吸附法检测耗时且操作繁琐，不能满足大型医院对大批量样本快速检测 的要求;免疫比浊法因其适用于全自动生化分析仪，操作方便，适合大批量样本的快速检测 而得到广泛应用。目前免疫比浊法多采用纳米颗粒增强法和胶体金增强法。
[0004] 中国国家知识产权局网站上公开了一种αι-微球蛋白检测试剂盒及其制备，基于 多克隆抗体胶体金增强免疫比浊法，具有灵敏度高等优点，但其检测线性范围仅为〇-40.0mg/L(详见专利说明书中第3/10页[0023]段），而存在线性范围窄的问题，无法满足对 W-微球蛋白浓度为40mg/L以上的高值病理临床样本检测的要求。中国国家知识产权局网 站上还公开了一种纳米微球免疫比浊法检测<^-微球蛋白的试剂盒，采用多克隆抗体纳米 颗粒增强免疫比浊法，用于血清中W-微球蛋白的检测(详见专利说明书[0001]段），但是却 不能用于人尿液中W-微球蛋白的检测。
[0005] 另外，多克隆抗体较单克隆抗体特异性差，而且类风湿因子异常的病人易造成检 测样本的假阳性和假阴性，影响检测结果的准确度。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的问题是针对现有技术的不足而提出一种具有高灵敏度、宽线 性、特异性更好、抗干扰能力强，且可以同时检测尿液和血清样本中^-微球蛋白的检测试 剂盒。
[0007] 本发明所采用的技术方案为：一种可以同时检测尿液和血清样本中^-微球蛋白 检测试剂盒，包括试剂1(R1)和试剂2(R2)，所述的试剂1为含有抗人类风湿因子(RF)抗体和 促凝剂的缓冲液;所述的试剂2为含有包被有抗人 Ql-微球蛋白单克隆抗体的大粒径聚苯乙 烯纳米颗粒(胶乳颗粒)的缓冲液。
[0008] 本发明所述抗人类风湿因子抗体是含有功能部位的完整抗体或抗体片段，为兔抗 人多克隆抗体或羊抗人多克隆抗体，或，兔抗人单克隆抗体或羊抗人单克隆抗体;均为市售 产品。
[0009] 本发明所述促凝剂为聚乙二醇(PEG)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的一种或几种。 [0010] 作为优选，本发明所述的试剂1组成为:50~200mmol/L Tris-HCl缓冲液，0~30g/ L聚乙二醇(PEG)，5~30g/L氯化钠，0.5~1 g/L叠氮化钠，0.1~1 g/L抗人类风湿因子抗体。 [0011]本发明通过使用聚苯乙烯纳米颗粒标记的抗人αι-微球蛋白单克隆抗体来测定人 αι_微球蛋白。
[0012] 进一步地，所述的聚苯乙稀纳米颗粒为粒径在150~500nm之间的聚苯乙稀纳米颗 粒。
[0013] 进一步地，所述聚苯乙稀纳米颗粒为粒径在200~350nm之间的聚苯乙稀纳米颗 粒。
[0014] 作为优选，所述抗人αι-微球蛋白单克隆抗体为含有能与人αι-微球蛋白特异性结 合的Fab功能部位的单克隆完整抗体或抗体片段。
[0015] 作为优选，所述试剂2的组成为:包被有抗人^-微球蛋白单克隆抗体(抗人αι-微球 蛋白单克隆抗体为通过^_微球蛋白免疫小鼠取得的脾细胞与骨髓细胞融合，筛选取得能 永久产生^_微球蛋白抗体的杂交瘤细胞，并将此杂交瘤细胞培养分离纯化获得目标鼠单 克隆抗体；为行业常规技术）的聚苯乙烯纳米颗粒0.5~5g/L，50~200mmol/L ρΗ7.5的 Tris-HCl缓冲液，2-20g/L BSA(牛血清白蛋白）、2-40g/L蔗糖、0 · 5-2g/L叠氮化钠。
[0016] 本发明的单克隆抗体致敏的大粒径纳米颗粒增强免疫检测方法的反应原理是:先 将含有抗人RF抗体和促凝剂的缓冲液的试剂1即R1与样本混合，使样本中的类风湿因子抗 原与R1中的抗人RF抗体结合成抗原抗体复合物并凝集成大颗粒，将类风湿因子抗原清除。 再将含有包被了高特异性的抗人cn-微球蛋白单克隆抗体的大粒径聚苯乙烯纳米颗粒的缓 冲液即试剂2(R2)，与R1中相应的 〇1-微球蛋白抗原发生特异性结合，在促凝剂作用下形成 不溶性的聚苯乙烯纳米颗粒-抗原-聚苯乙烯纳米颗粒复合物乳浊液，产生一定的浊度，其 浊度高低与样本中的w-微球蛋白抗原浓度成正比关系，在一定波长下进行浊度测定，即可 测得样本中被检测αι-微球蛋白的含量。由于大粒径纳米颗粒比小粒径纳米颗粒浊度变化 比大，相应具有高灵敏度特性;单克隆抗体由于具有和抗原表面单一位点亲和的特点，与具 有和抗原表面多位点亲和的多克隆抗体相比，其线性范围更宽且特异性更高。
[0017] 本发明中，选取的浊度测定的检测波长为340~800nm，优选500-600nm。
[0018] 采用本发明所述的试剂盒测定血清、血浆或尿液中〇1_微球蛋白时，先将样本与试 剂1混匀后孵育5分钟，然后加入试剂2,立即读取第一点吸光度值(A1)，计时反应5分钟后， 读取第二点吸光度值(A2)，计算两点吸光度差值，根据校准曲线得到样本中 αι-微球蛋白的 含量。
[0019] 本发明采用6点定标法，以样条函数作为计算模式，绘制出校准曲线。
[0020] 本发明所述的试剂盒与现有技术相比，具有以下优点和有益效果:采用了高特异 性单克隆抗体致敏的纳米颗粒增强免疫检测方法，具有抗干扰能力强、特异性好、灵敏度高 和线性范围宽、既可适用于人尿样本也可以适用于人血清样本中的检测，检测灵敏度为 0.5mg/L，检测范围在0.5-140mg/L以上，可以同时满足临床对^-微球蛋白低值和异常高 值样本检测的要求。
【附图说明】
[0021] 图1:本发明试剂盒检测αι-微球蛋白线性范围；
[0022] 图2:本发明试剂盒测〇1_微球蛋白与用于检测αι-微球蛋白的某进口试剂盒相关 性。
【具体实施方式】
[0023] 以下实施例用来详细的说明本发明，但本发明不限于此。
[0024] 实施例1
[0025]试剂Rl:100mmol/L Tris-HCl缓冲液，15g/L聚乙二醇(PEG)，20g/L氯化钠，lg/L叠 氮化钠，〇. 8g/L抗人类风湿因子抗体。
[0026]试剂R2:标记有抗人w-微球蛋白单克隆抗体的胶乳颗粒的制备:将粒径为198nm 的胶乳颗粒(JSR公司产，code No. :P0113;聚苯乙烯纳米颗粒），用50mmol/L MES，pH6.0缓 冲液稀释胶乳颗粒到3g/L，每ml溶液中加入EDAC 0.5mg，室温反应1小时，20000rpm转速下 离心30min，去上清(上清液），将沉淀悬浮于50mmol/L、pH6.0的MES缓冲液中，超声分散;再 次20000rpm转速下离心30min，去上清，将沉淀悬浮于50mmol/L、pH6.