0061] 阿魏酸：25 ~52yg/mL;
[0062] 川陈皮素：2.1~7.8yg/mL;
[0063] 绿原酸：38 ~65yg/mL;
[0064] 木尾草昔：12 ~39yg/mL;
[0065] 橙皮苷:230 ~600yg/mL;和，
[0066] 芍药苷：905 ~1500yg/mL。
[0067] 也优选本发明第六方面的益肝明目口服液的指纹图谱相似度值超过0.915。
[0068] 在第七方面，本发明提供了本发明第六方面的益肝明目口服液在制备益肝明目的 药物中的应用。
[0069] 优选在本发明第七方面的应用中，所述益肝明目的药物包括治疗神经衰弱和/或 青少年近视的药物。
[0070] 本发明的有益效果在于，本发明的测定方法操作简便、专属性强、稳定性好、精密 度高、重现性好、加样回收率高而且成本低，可以一次性得出6种成分的有效结果，也可获得 指纹图谱，用于全面检测益肝明目口服液的质量，尤其可用于改进益肝明目口服液的制备 工艺;根据改进的制备工艺制备的益肝明目口服液减少了各批次间成分的不均一性，提高 了稳定性，尤其能明显提高疗效，十分有利于推广应用。
【附图说明】
[0071] 图1为实施例中益肝明目口服液中色谱峰和参照峰标定中对照品和供试品的色谱 图，A为对照品HPLC色谱图，B为供试品色谱图。其中，峰1为绿原酸(保留时间为27.6min)，峰 2为芍药苷(保留时间为35.9min)，峰3为阿魏酸(保留时间为43.4min)，峰4为木犀草苷(保 留时间为46.6min)，峰5为橙皮苷（保留时间为50.5min)，峰6为川陈皮素（保留时间为 73·3min)〇
[0072] 图2为实施例指纹图谱采用不同梯度的乙腈-0.05%磷酸进行HPLC分析的图谱，其 中A、B、C、D分别为按照表5-1、5-2、5-3、5-4所示梯度洗脱的HPLC色谱图。
[0073]图3为实施例含量测定采用不同梯度的乙腈-0.05%磷酸进行HPLC分析的图谱，其 中A、B分别为按照表6-1、6-2所示梯度洗脱的HPLC色谱图。
[0074] 图4为实施例指纹图谱相似度评价结果色谱图，其中A为参照图谱，B为15批次的指 纹图谱叠加。
【具体实施方式】
[0075] 下面将通过实施例的方式进行说明。
[0076]实施例1样品的处理
[0077]益肝明目口服液样品（用于测定指标成分）：精密量取益肝明目口服液(可购自广 西慧宝源制药有限责任公司）lmL，置10mL容量瓶中，加甲醇稀释至10mL，摇勾，称重，超声处 理lOmin(功率100W，频率40kHz，温度20°C)，静置至室温后，称重，甲醇补足损失的重量，即 得供试品溶液(所有供试品在制备后24h内检测）。
[0078]益肝明目口服液样品（用于测定指纹图谱）：取益肝明目口服液5mL，加入体积比2 倍量的水饱和正丁醇萃取，萃取3次，合并萃取液，减压回收溶剂，甲醇复溶，转移至10mL量 瓶中，甲醇定容至刻度，微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
[0079] 指标成分样品：分别取阿魏酸、绿原酸、川陈皮素、橙皮苷、苟药苷、木犀草苷对照 品适量，加甲醇稀释，摇匀，分别得浓度为415yg · ml/1的阿魏酸对照品溶液，浓度为222yg · ml/1的绿原酸对照品溶液，浓度为192yg · ml/1的川陈皮素对照品溶液，浓度为966yg · ml/1 的橙皮苷对照品溶液，浓度为494yg · ml/1的芍药苷对照品溶液，浓度为19.Oyg · ml/1的木 犀草苷对照品溶液。
[0080] 实施例2检测条件的确定
[0081] -，检测波长的确定 [0082] 1.各指标成分的测定波长
[0083] 高效液相色谱法进行检测各指标成分:色谱柱：Inertsil 0DS-SP色谱柱(250mmX 46mm，5μπι);流动相A乙腈，流动相B 0.05% (v/v)磷酸水溶液，梯度洗脱，洗脱梯度见表3;流 速0 · 8mL · min-1;柱温35°C。
[0084]表 3 [00oc1
[0086] 实验结果
[0087] 通过二极管阵列检测器对对照品溶液进行检测，结果发现:绿原酸、阿魏酸、川陈 皮素在325nm处有强吸收，木犀草苷在348nm处有强吸收，橙皮苷在284nm处有强吸收，芍药 苷在230nm处有强吸收。二极管阵列检测器可以进行全波长检测，故确定检测不同成分，采 用不同检测波长。
[0088] 2.益肝明目口服液指纹图谱的测定波长
[0089] 高效液相色谱法进行检测：色谱柱：Inertsil 0DS-SP色谱柱(250mmX46mm，5ym); 流动相A乙腈，流动相B 0.05%磷酸水溶液，梯度洗脱;洗脱梯度见表4;流速0.8mL · mirT1; 柱温35°C。
[0090] 表 4
[0091]
[0092] 实验结果:采用二极管阵列检测器对供试品溶液进行检测，结果发现在230nm波长 下，所提供的信息量最丰富，各峰的高度比例合适，故选择230nm作为益肝明目口服液指纹 图谱的检测波长。
[0093]二，峰保留时间的确定
[0094] 高效液相色谱法进行检测:分别将指标成分样品的混合物和益肝明目口服液样品 进入高效液相色谱仪中进行检测，进样量为l〇yL，其它条件同实施例1的含量测定液相方 法。检测波长分别为绿原酸、阿魏酸、川陈皮素325nm，木犀草苷348nm，橙皮苷284nm，苟药苷 230nm。
[0095] 实验结果:各指标成分和益肝明目口服液样品的色谱图分别如图1A和1B所示。其 中，根据单独检测各指标成分所示的峰保留时间，峰1为绿原酸(保留时间为27.6min)，峰2 为芍药苷(保留时间为35.9min)，峰3为阿魏酸(保留时间为43.4min)，峰4为木犀草苷(保留 时间为46.6min)，峰5为橙皮苷（保留时间为50.5min)，峰6为川陈皮素（保留时间为 73·3min)〇
[0096] 三，洗脱条件的确定
[0097] 1.益肝明目口服液指纹图谱的洗脱条件
[0098] 色谱柱为Inertsil 0DS-SP(4.6_X 250_，5μηι)，流动相A为乙腈，流动相B为体积 百分比0.05 %的磷酸水溶液，进行梯度洗脱，梯度洗脱表如表5-1、表5-2、表5-3和表5-4所 示，柱温为35°C，检测波长分别为230nm。色谱图分别如图2A、2B、2C、2D**。
[0099] 表5-1
[0100]
[010^-由图2A、2B、2C'2D可知，流动相的梯度变化比例对益肝明目口服液各色谱峰1的分 离度有较大的影响，在230nm波长下，在表5-4梯度洗脱条件下，各峰均有较好的分离度，最 终将其确定为益肝明目口服液的指纹图谱色谱条件流动相洗脱梯度。
[0108] 2.益肝明目口服液各指标成分的洗脱条件
[0109] 色谱柱为Inertsil 0DS-SP(4.6_X 250_，5μηι)，流动相A为乙腈，流动相B为体积 百分比0.05%的磷酸水溶液，对益肝明目口服液样品进行梯度洗脱，梯度洗脱表如表6-1和 表6-2所示，柱温为35°C，检测波长分别为230nm、284nm、348nm和325nm。色谱图分别如图3A、 3B所示。
[0110] 表6-1 [01111
[0112]表6-2
[0113]
[0114] 由图3A、3B可知，流动相的梯度变化比例对益肝明目口服液各色谱峰的分离度有 较大的影响，在表6-2梯度洗脱条件下，待测成分得到较好的分离度，最终将其确定为益肝 明目口服液的含量测定色谱条件流动相洗脱梯度。
[0115] 实施例3益肝明目口服液各指标成分的含量测定的研究
[0116] 在实施例2确定的高效液相色谱法(HPLC)测定条件的基础上，对益肝明目口服液 各指标成分的测定进行深入研究。
[0117] 1.标准曲线及线性范围
[0118] 将各指标成分样品分别按照表7-1~7-6所示浓度稀释，HPLC进行检测，数据结果 见表7-1~7-6,绘制标准曲线见表8。
[0119] 表7-1绿原酸标准曲线数据
[0120]
[0121] 表7-2芍药苷标准曲线数据
[0122]
[0123] 表7-3阿魏酸标准曲线数据
[0124]
[0125] 表7-4木樨草苷标准曲线数据 1
[0127 ]表7-5橙皮苷标准曲线数据 [0128]
[0129]表7-6川陈皮素标准曲线数据 [0130]
[0134]其中，X为相应成分在相应检测波长处检测得到的吸光度(A)。
[0135] 2.精密度考察
[0136] 检测波长分别为绿原酸、阿魏酸、川陈皮素325nm，木犀草苷348nm，橙皮苷284nm， 芍药苷230nm，同一益肝明目口服液样品连续进样6次，HPLC检测，测定峰面积，以峰面积计 算RED。结果见