酸HAe的提取:取上步NaOH无法提取的烘干残余物，磨样并过2 mm的筛;再次用NaOH溶液进行提取，提取方法与游离胡敏酸HAf提取相似，提取至提取液颜色很浅时，再次烘干-磨样-提取，至首次NaOH提取的提取液几乎无色。该步骤中所有提取液合并为一个样品，提取液中加6 mol/L的HCl溶液调pH约至1.0，静置一段时间；将沉淀与上清液分离，必要时离心分离;沉淀即为包裹胡敏酸HAe;离心瓶及其中NaOH无法提取的残余物放入烘箱中65 °C烘干。
[0015]c.结合胡敏酸HAi的提取:取上步NaOH无法提取的烘干残余物，磨样并过2 mm的筛，再次放入同一离心瓶中；向离心瓶中加入6 mo 1/L的HCl溶液200 mL，于水浴锅中60弋加热20 h;离心瓶放入离心机中3600 rpm离心lOmin，去除上清液，留沉淀;6 mol/L的HCl溶液处理重复一次，沉淀用mi 11 i Q水清洗4次，65 °C烘干。再次用NaOH溶液进行提取，提取步骤与包裹胡敏酸HAe相似。该步骤所有的提取液合并为一个样品，向提取液中加6 mol/L的HCl溶液调PH约至1.0，静置一段时间;将沉淀与上清液分离，必要时离心分离;该沉淀即为结合胡敏酸HAi。
[0016]上述步骤a、b、c中，得到的三种不同保存形式的胡敏酸均分别再进行进一步的纯化处理，去除粘粒物质。
[0017]对提取的上述三种不同形式的胡敏酸进行元素分析，结果显示三种胡敏酸的元素组成差异显著，游离胡敏酸碳含量最低，结合胡敏酸碳含量最高，说明土壤中确实存在三种不同形式的胡敏酸。测试的所有土壤均可分离出相对比例不同的三种胡敏酸组分，大多数土壤三种保存形式的胡敏酸的量按照游离胡敏酸，包裹胡敏酸和结合胡敏酸的顺序显著减少;但部分土壤包裹胡敏酸含量相对较高，甚至与游离胡敏酸相似。
[0018]该分析方法所用试剂(Na0H、HCl)少，实验仪器简单(离心机、烘箱、水浴、摇床)，大多实验室均可进行操作。三种不同保存形式的胡敏酸分别在不同的土壤扰动下释放，当土壤物理结构遭到破坏时可能释放HAe;当土壤处于酸雨等矿物淋溶环境时可能释放HAi。利用该技术分离的三种胡敏酸的C/N原子比分别约为HAf (12)、HAe (18)和HAi (30 )，说明三种胡敏酸的对微生物的敏感性逐步增加，因此当土壤受到扰动而释放HAe和HAi时，易于被微生物分解利用。鉴于土壤胡敏酸对稳定土壤结构具有重要的作用，利用该分离技术对土壤三种保存形式的胡敏酸的含量及相对分布进行研究，在一定程度上可反映土壤抗扰动能力的强弱。
[0019]以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
【主权项】
1.从土壤中连续提取三种不同保存形式胡敏酸的方法，其特征在于，所述提取方法主要以下包括三个步骤: a.游离胡敏酸HAf的提取:将研磨后的土样置于离心瓶中，加入浓度为0.5 mol/L的NaOH溶液，在犯保护下搅拌约Imin;静置约30 s后，再将离心瓶及样品放入摇床中摇晃;离心分离，并收集上清液;如此反复用NaOH溶液进行提取，至NaOH提取液接近无色;合并提取液，用HCl溶液调pH约至1.0，静置分层;将沉淀与上清液分离，该沉淀即为游离胡敏酸HAf;将上述步骤中NaOH溶液无法提取的残余物放入烘箱中65 °C烘干； b.包裹胡敏酸HAe的提取:取上述步骤a中NaOH溶液无法提取的烘干残余物，磨样并过2mm的筛;再次用NaOH溶液进行提取，提取方法与上述游离胡敏酸HAf提取相似;提取至提取液颜色接近无色时，再次烘干-磨样-提取，至首次NaOH提取的提取液接近无色;合并所有提取液，用HCl溶液调pH约至1.0，静置分层；将沉淀与上清液分离，该沉淀即为包裹胡敏酸HAe;将上述步骤中NaOH溶液无法提取的残余物放入烘箱中65 °C烘干； c.结合胡敏酸HAi的提取:取上述步骤b中NaOH溶液无法提取的烘干残余物，磨样并过2mm的筛，放入离心瓶中；向离心瓶中加入HCl溶液，于60 °C下加热20h;离心分离，去除上清液，留沉淀;再用HCl溶液重复处理一次，沉淀用milli Q水清洗4次，65°C下烘干;然后再次用NaOH溶液进行提取，提取步骤与上述包裹胡敏酸HAe的提取相似;合并所有的提取液，用HCl溶液调pH约至1.0，静置分层;将沉淀与上清液分离，该沉淀即为结合胡敏酸HAi。2.根据权利要求1所述的从土壤中连续提取三种不同保存形式胡敏酸的方法，其特征在于:所述步骤a中，摇床的转速为115 rpm，摇晃时间为4h;离心分离的转速为3600 rpm，离心时间为10 min。3.根据权利要求1所述的从土壤中连续提取三种不同保存形式胡敏酸的方法，其特征在于:所述步骤a、b、c中，用于调节PH值的HCl溶液的浓度为6 mol/L;所述步骤c中，用于残余物除盐处理的HCl溶液的浓度也为6 mol/L。4.根据权利要求1所述的从土壤中连续提取三种不同保存形式胡敏酸的方法，其特征在于:所述步骤a、b、c中，得到的三种不同保存形式的胡敏酸均分别再进行进一步的纯化处理，去除粘粒物质。
【专利摘要】本发明公开了一种从土壤中连续提取三种不同保存形式胡敏酸的方法，包括三个步骤：a.游离胡敏酸HAf的提取：将研磨后的土样反复用NaOH溶液进行提取至提取液接近无色；合并提取液，用HCl溶液调pH约至1.0，静置分层，该沉淀即为HAf；b.包裹胡敏酸HAe的提取：取上述步骤a中NaOH溶液无法提取的烘干残余物，磨样并过2mm的筛；再次用NaOH溶液进行提取，提取方法与上述游离胡敏酸HAf提取相似；得到HAe；c.结合胡敏酸HAi的提取：取上述步骤b中NaOH溶液无法提取的烘干残余物，磨样并过2mm的筛，加入HCl溶液除盐；然后再次用NaOH溶液进行提取，得到HAi。本发明采用的试剂和实验仪器较少，易操作，提取效率和纯度较高；在一定程度上可反映土壤抗扰动能力的强弱。
【IPC分类】G01N1/34
【公开号】CN105606429
【申请号】CN201510976084
【发明人】邸欣月, 肖保华, 安显金, 董慧, 汤海明, 夏雪敏, 苏献伟
【申请人】中国科学院地球化学研究所
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2015年12月23日