cm端下测粘贴样品垫，在PVC底板下方距离1.0 cm的地方粘贴焚光标记结合垫(焚光标记结合垫与样品垫重合I mm)在PVC底板中间2.5 cm处粘贴硝酸纤维素膜(上面喷涂有T线和C线，硝酸纤维素膜和荧光标记结合垫重合I _)。在PVC底板上方2 cm处粘贴吸水垫(硝酸纤维素膜和吸水垫重合I mm)。将组装好的板条切成宽4_的小条状，装在塑料卡里面备用。
[0026]c.试纸的灵敏性检测:配制Ong/mL、I Ong/mL、20ng/mL、40ng/mL、60ng/mL、80ng/mL、100ng/mL的羊毛角蛋白抗原溶液，分别取20 yL滴加到样品垫上；20min后，将试纸置于免疫荧光定量检测仪中进行检测，得到检测线荧光强度和羊毛角蛋白抗原溶液浓度之间的标准曲线和回归方程;分别测定15组空白样品(不含羊毛角蛋白抗原的PBS缓冲液)的荧光强度，其平均值18500作为阳性样品荧光强度的最高阈值;根据回归方程计算该阈值对应的最低羊毛角蛋白抗原检测浓度40ng/mL，即检测下限，作为试纸灵敏性的标准。
[0027]d.古代羊毛的特异性免疫检测:取2mg古代羊毛微痕迹样品，研磨均匀，溶解于2mLPBS (pH 7.4)缓冲溶中，搅拌均匀，0.5h后取一滴上清液滴在组装好的试纸条的样品垫上；20 min后，将试纸置于免疫荧光定量检测仪中进行检测，得到检测线荧光强度与步骤c中的阳性样品荧光强度的最高阈值18500进行比较，如果荧光强度低于18500，说明样品中含有羊毛角蛋白，该微痕迹样品为羊毛微痕迹;如果荧光强度高于18500，说明样品中不含羊毛角蛋白，该微痕迹样品不是羊毛微痕迹。
[0028]实施例3
一种古代羊毛的特异性免疫检测方法，采用以下步骤:
a.焚光标记特异性羊毛抗体的制备:分别加入Iyg铕标记聚苯乙稀纳米球、10 uL 3mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和30 uL lmg/mL特异性羊毛抗体到10 mL的20 mmo I /L的I3BS (pH 7.4 )缓冲液中；在室温条件下搅拌反应2.5小时后，得到的产物用10mmol/L的PBS缓冲液洗涤，重新分散于含有0.l%(w/v)牛血清蛋白的40mmol/L的Tris-HCl溶液中封闭未反应的羧酸盐。采用离心法收集荧光标记特异性羊毛抗体，于4°C冰箱中保存备用。
[0029]b.试纸的组装:将荧光标记特异性羊毛抗体喷涂在玻璃纤维素膜上(喷涂量为I μL/cm)，然后将其置于380C下干燥。将羊毛角蛋白抗原(4.8 mg/ml)和山羊抗兔抗体(二抗，
1.5mg/ml)分别划在硝酸纤维素膜的检测线(T)和质控线(C)上(划膜仪，用量为lyL/cm)，并置于38°C下干燥。在PVC底板长1.5 cm端下测粘贴样品垫，在PVC底板下方距离1.0 cm的地方粘贴焚光标记结合垫(焚光标记结合垫与样品垫重合I mm)在PVC底板中间2.5 cm处粘贴硝酸纤维素膜(上面喷涂有T线和C线，硝酸纤维素膜和荧光标记结合垫重合I _)。在PVC底板上方2 cm处粘贴吸水垫(硝酸纤维素膜和吸水垫重合I mm)。将组装好的板条切成宽4_的小条状，装在塑料卡里面备用。
[0030]c.试纸的灵敏性检测:配制Ong/mL、I Ong/mL、20ng/mL、40ng/mL、60ng/mL、80ng/mL、100ng/mL的羊毛角蛋白抗原溶液，分别取20 yL滴加到样品垫上;30 min后，将试纸置于免疫荧光定量检测仪中进行检测，得到检测线荧光强度和羊毛角蛋白抗原溶液浓度之间的标准曲线和回归方程;分别测定25组空白样品(不含羊毛角蛋白抗原的PBS缓冲液)的荧光强度，其平均值18500作为阳性样品荧光强度的最高阈值;根据回归方程计算该阈值对应的最低羊毛角蛋白抗原检测浓度40ng/mL，即检测下限，作为试纸灵敏性的标准。
[0031]d.古代羊毛的特异性免疫检测:取2mg古代羊毛微痕迹样品，研磨均匀，溶解于2mL PBS (pH 7.4)缓冲溶中，搅拌均匀，1.5h后取一滴上清液滴在组装好的试纸条的样品垫上;30 min后，将试纸置于免疫荧光定量检测仪中进行检测，得到检测线荧光强度与步骤c中的阳性样品荧光强度的最高阈值18500进行比较，如果荧光强度低于18500，说明样品中含有羊毛角蛋白，该微痕迹样品为羊毛微痕迹;如果荧光强度高于18500，说明样品中不含羊毛角蛋白，该微痕迹样品不是羊毛微痕迹。
[0032]本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备;本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0033]以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
【主权项】
1.一种古代羊毛的特异性免疫检测方法，其特征在于采用以下步骤: a.荧光标记特异性羊毛抗体的制备:采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺介导法偶联铕标记聚苯乙烯纳米球和特异性羊毛抗体，制得荧光标记特异性羊毛抗体； b.试纸的组装:将上述制备的荧光标记特异性羊毛抗体喷涂在玻璃纤维素膜上，然后置于36-38Γ下干燥;将羊毛角蛋白抗原和山羊抗兔抗体分别划在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上，并置于36-38°C下干燥;分别将样品垫、荧光标记结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组装在PVC底板上，将组装好的板条切成条状，制得检测试纸，备用； c.试纸的灵敏性检测:配制梯度浓度的羊毛角蛋白抗原溶液，分别取等量滴加到样品垫上，进行荧光检测，得到试纸的检测线荧光强度和羊毛角蛋白抗原溶液浓度之间的标准曲线和回归方程;分别测定15-25组空白样品的荧光强度，其平均值作为阳性样品荧光强度的最高阈值;根据回归方程计算该阈值对应的最低羊毛角蛋白抗原检测浓度，即检测下限，作为试纸灵敏性的标准； d.古代羊毛的特异性免疫检测:取古代羊毛微痕迹样品，研磨均匀，溶于pH7.4的PBS缓冲液中使古代羊毛微痕迹样品浓度为lmg/mL，搅拌均匀，0.5-1.5h后取一滴上清液滴在检测试纸的样品垫上;20-30min后，进行荧光检测，得到检测线荧光强度与步骤c中的阳性样品荧光强度的最高阈值进行比较，如果荧光强度低于阈值，说明样品中含有羊毛角蛋白，该微痕迹样品为羊毛微痕迹;如果荧光强度高于阈值，说明样品中不含羊毛角蛋白，该微痕迹样品不是羊毛微痕迹。2.如权利要求1所述的一种古代羊毛的特异性免疫检测方法，其特征在于，所述荧光标记特异性羊毛抗体的制备方法具体为:分别将铕标记聚苯乙烯纳米球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和特异性羊毛抗体加入到20 mmol/L的I3BS缓冲液中；在室温条件下搅拌反应1.5-2.5h后，将得到的产物用10 mmol/L的PBS缓冲液洗涤，然后重新分散于含有0.l%(w/v)牛血清蛋白的40 mmol/L的Tris-HCl溶液中封闭未反应的羧酸盐;最后采用离心法收集得到荧光标记羊毛检测抗体，将抗体于4 °C下保存备用。3.如权利要求2所述的一种古代羊毛的特异性免疫检测方法，其特征在于，所述铕标记聚苯乙烯纳米球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和羊毛检测抗体的质量比为1:30:30 ο4.如权利要求1所述的一种古代羊毛的特异性免疫检测方法，其特征在于，在步骤b中荧光标记羊毛检测抗体的喷涂量为I yL/cm。5.如权利要求4所述的一种古代羊毛的特异性免疫检测方法，其特征在于，在步骤b中羊毛角蛋白抗原的浓度为4.8mg/mL ；山羊抗兔抗体的浓度为1.5mg/mL;羊毛角蛋白抗原和山羊抗兔抗体的用量为I yL/cm。6.如权利要求4所述的一种古代羊毛的特异性免疫检测方法，其特征在于，所述检测试纸的具体组装方法为:在PVC底板长1.5 cm端下侧粘贴样品垫，在PVC底板下方距离Icm处粘贴焚光标记结合垫，所述焚光标记结合垫与样品垫重合1mm，在PVC底板中间2.5 cm处粘贴上述硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜和荧光标记结合垫重合I mm，在PVC底板上方2cm处粘贴吸水垫，硝酸纤维素膜和所述吸水垫重合I mm;将组装好的板条切成条状，制得检测试纸，装于塑料卡中备用。7.如权利要求1所述的一种古代羊毛的特异性免疫检测方法，其特征在于，步骤b中切成条状后的检测试纸的宽度为4_。8.如权利要求1所述的一种古代羊毛的特异性免疫检测方法，其特征在于，步骤c中所述空白样品为不含羊毛角蛋白抗原的PBS缓冲液。9.如权利要求1所述的一种古代羊毛的特异性免疫检测方法，其特征在于，步骤c中羊毛角蛋白抗原溶液的梯度浓度分别为0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、60ng/mL、80ng/mL、100ng/mLo
【专利摘要】本发明涉及文物检测技术领域，公开了一种古代羊毛的特异性免疫检测方法，采用以下步骤：a.荧光标记特异性羊毛抗体的制备；b.试纸的组装；c.试纸的灵敏性检测；d.古代羊毛的特异性免疫检测。利用本发明方法制备的检测试纸对古代羊毛微痕迹进行检测时，具有快速、准确、高灵敏性的特点。
【IPC分类】G01N33/533, G01N33/558, G01N33/68
【公开号】CN105699660
【申请号】CN201610102038
【发明人】王秉, 游秋实, 刘意, 刘杨
【申请人】浙江理工大学
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年2月24日