一种多指标检测心肌梗塞的快速免疫荧光定量检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种多指标检测心肌梗塞的快速免疫荧光定量检测试剂盒。
[0002]
【背景技术】
[0003]急性心肌梗塞(AMI)严重威胁人类健康，而对于此类疾病的尽早诊断和治疗是降低病人死亡率的重要手段之一。心肌梗死(myocardial inf arct 1n，MI)是冠状动脉闭塞，血流中断，使部分心肌因严重的持久性缺血而发生局部坏死的病症。临床症状有剧烈而较持久的胸骨后疼痛，发热、白细胞增多、红细胞沉降率加快，血清心肌酶活力增高及进行性心电图变化，可发生心律失常、休克或心力衰竭。心肌梗死是属于冠状动脉粥样硬化性的一种心脏病。心脏标志物是指在血液中可测定出的一系列生物化学物质，它们能够敏感、特异的反映心肌损伤(异常)及其严重程度，因而可用作心肌损伤的筛查、诊断、评定预后和治疗效果的监测标志。心脏标志物在人体正常情况下主要存在于心脏，发生异常时由心肌细胞大量释放进入血液。2000年AMI全球定义提出检测cTnl、MY0、CK-MB作为诊断AMI的第一标准，2007和2012年欧美和全球AMI指南中cTn I做为临床诊断依据。三联检测可使AMI的检测时间窗达到最大，并且具有更高的敏感性和较强的特异性(避免假阳性)。当前国内医院多用单独检测cTnl、My0，CKMB。单独指标不能早、中、晚全程判断AMI，目前市场也开始应用多指标试剂，常见多采用以胶体金纳米颗粒结合抗体形成复合物，用来检测标志物。胶体金纳米颗粒与抗体蛋白之间通过范德华力进行结合，其结合力不牢固，易造成检测灵敏度不稳和下降、产品批内和批间一致性较低，差异达不到小于15%要求。免疫荧光定量检测技术作为一种新的免疫学方法，其发展十分迅速，在生物医学各研究领域，特别是在医学检验中得到了日益广泛的应用。免疫荧光定量检测已成为继荧光素、放射同位素和酶之后，在免疫标记技术中较为常用的一种非放射性检测方法。免疫荧光定量检测是由利用荧光颗粒的高敏感性，并用表面特异化学基团对可以产生免疫反应的相应蛋白进行化学交联而产生免疫荧光颗粒，此方法远比其他静电吸附等方法得到的颗粒稳定和灵敏度高，它还具有能与多种生物大分子结合的特点。当这些免疫荧光标记物物在相应的配体处大量聚集时，在激发光源照射下，产生特定波长下可由光学传感器获取的信号，经过数据处理，得到定量的快速免疫检测结果。由于免疫荧光定量检测试剂盒与放免、酶标试剂盒相比，具有操作使用安全、简便、易单人份检测和快速等优点，因此近几年来免疫荧光定量诊断试剂盒正日益流行，已逐渐替代了放免、酶标试剂盒等。层析技术(immunochromatography)是近十年来兴起的一种快速诊断技术，具有精确、快速和操作简单等优点。其利用荧光颗粒的免疫层析技术已经在临床检验中得到应用，其基本原理是通过荧光标记物与分析物及包被抗体或抗原反应形成免疫荧光复合物，可通过光学检测仪观察检测结果。可以用于抗原或抗体含量极低的样本，是生物检测领域的前沿科学。采用中心包裹荧光素的乳胶颗粒，其表面带有不同修饰基团供和抗体蛋白结合，成为超灵敏和多组分生物化学分析的荧光探针。将荧光乳胶颗粒与抗体结合，配合以荧光检测仪可应用于定量荧光免疫分析和检测。免疫荧光定量免疫层析技术检测是由检测仪对乳胶荧光-抗体-待检测物-抗体的反应方式进行信号收集，通过设定数学模型，优化算法，来决定血液中这些微量物质的变化，为临床提供高灵敏度，高特异性的辅助诊断手段。肌钙蛋白1、肌红蛋白和肌酸激酶同工酶(CK-MB)是心肌的三种特异性蛋白，它们以及它们的复合物在发生心肌梗死后立即释放到血液中，以发生心肌梗死后大约6?8 h直到10?15 d均可检测到较高水平的标记物，肌钙蛋白I(CTnI)、肌红蛋白(Mb)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)都是心肌损伤的敏感性指标，三者联合检测对早期诊断AMI有着较高的临床价值，对评估病危程度，具有床边和现场快速应用等优点。能够实现危险度分层，达到全程监测AMI目标。肌红蛋白是存在于肌肉组织中的一种亚铁血红素蛋白，当肌肉细胞损伤后，由于分子量小，肌红蛋白迅速释放到血液中，2小时可异常增高。肌红蛋白虽不够特异但灵敏度很高，是目前心肌受损后最早发生异常的心血管标志物，并具有很高的阴性排除价值。肌红蛋白是一种细胞浆蛋白质，存在于心脏和骨骼的横纹肌中，具有转运氧气和储存氧气的功能，分子量17.8KD，由于分子量较小，当肌细胞受损时，肌红蛋白很快被释放进入血液循环中。1、检测及红蛋白是诊断急性心肌梗死，早期再度梗死以及观察溶栓治疗后成功再灌注的重要指标。急性心梗后最早(I 一 2h)出现升高，梗死发生后4-12小时，肌红蛋白的血浓度达到最高值。24小时后恢复到正常值水平成“多峰”现象，灵敏度优于CK-MBο 2、灵敏度高，最早排除AMI;阴性预测率为99 %。3、多种肌病(如急性肌损伤、肌营养不良、肌萎缩、多发性肌炎等)升高。4、急慢性肾功能极度衰竭、严重充血性心力衰竭、长期休克等会升高。CK是由两种不同亚基(M和B)组成的二聚体，这样正常人体组织主要含3种同工酶，即CK-MM、CK-BB，CK-MB。CK-MM主要存在于肌肉细胞中，CK-BB主要存在于脑细胞中，CK-MB主要存在于心肌细胞中XK-MB是目前常用的心肌损伤标志物，曾一度被视为诊断AMI的“金标准”。CK-MB在急性心肌梗死发病后48h内增高，24h达峰值，两三天恢复正常。检测血液CK-MB含量是诊断心肌缺血性损伤的重要指标，如:急性心肌梗死、心肌炎等。症状发生3-8小时就可在血中测到，并可根据病情维持可测水平至较长一段时间。其他一些临床情况，如横纹肌溶解和中风，CK-MB也可以升高就实验室诊断而言，检测CK-MB、TNT和肌红蛋白就能够对以上疾病作鉴别诊断。CK-MB检测的灵敏度取决于标本采集的时间，因此，系列动态检测具有实际意义。测定含量与测定活性方法相比，其优点是灵敏度和特异性高，不受体液中其他物质的影响，特别是抑制剂和激活剂的影响，有利于疾病诊断和科学研究。因而肌酸激酶同工酶MB (CKMB )含量测定对疾病的诊断价值高。心肌肌钙蛋白是由cTn 1、cTnC以及cTnT组成的复合物，在肌肉收缩和舒张过程中起重要调节作用。其中，cTnC没有心肌特异性，较少用于心肌损伤的检查。在正常状态下，cTnl和cTnT均不能透过细胞膜进入血液循环，故健康人血内不含或含极低量的cTnl、肌红蛋白；当心肌细胞受损后，cTnl及肌红蛋白弥散进人细胞间质，较早的出现在外周血中。通常，心肌肌钙蛋白在发病后35h即可升高，1524h达高峰，持续时间久，510天后降至正常。cTnl在心肌中无其它亚型，特异性高于肌红蛋白，此外其分子量亦小于肌红蛋白，在AMI发病时，更早被释放于血液中，因此cTnl更优于肌红蛋白，可谓目前诊断心肌梗死最好的心肌损伤标志物。中国专利申请号CN200510025494.X和CN200520041211.6公布了一种心血管疾病的诊断和预测多指标蛋白芯片检测试剂盒，该试剂盒利用化学发光在蛋白芯片上进行心肌肌钙蛋白1、肌红蛋白等八项指标同时定性检测。此法虽较敏感、准确，但存在着操作繁琐，检测耗时较长等缺点。中国专利申请号CN200720140932.1公布了一种人肌红蛋白/肌酸激酶同工酶/心肌钙蛋白I诊断试纸，该试纸利用颜色颗粒(如胶体金颗粒、染料颗粒)在常规试纸条进行三项指标的定性检测。胶体金免疫层析法虽然具有简便快速便宜的优势，然而当样本中抗原或抗体含量极低时，胶体金的颜色将很浅，很难用肉眼来判断结果，容易出现误判，灵敏度较低，且三项指标同时检测时，有一定的交叉干扰，易产生假阳性。中国专利申请号CN 102520192 B公布了一种定量检测肌钙蛋白i/肌酸激酶同工酶/肌红蛋白的荧光免疫层析试剂盒，该专利利用了量子点，由于量子点尺寸极小，常常有CV问题，所以难以稳定生产。
[0004]现有技术中检测多项生化标志物灵敏度低和标志物间相互干扰。
[0005]
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种多指标检测心肌梗塞的快速免疫荧光定量检测试剂盒，旨在解决现有技术中检测多项生化标志物灵敏度低和标志物间相互干扰的问题。
[0007]本发明是这样实现的，一种多指标检测心肌梗塞的快速免疫荧光定量检测试剂盒，所述多指标检测心肌梗塞的快速免疫荧光定量检测试剂盒包括硝酸纤维素膜，在硝酸纤维素膜的一端设置有样品垫，在硝酸纤维素膜的另一端设置有吸水垫，所述硝酸纤维素膜的位于吸水垫和样品垫之间的区域内分别包被有抗肌钙蛋白I，肌红蛋白，CK-MB的