从患有类风湿性关节炎的患者中检测自身抗体的方法、肽和检测试剂盒的制作方法
【专利说明】从患有类风湿性关节炎的患者中检测自身抗体的方法、肽和 检测试剂盒
[0001]本申请是申请日为2002年12月11日、发明名称为"从患有类风湿性关节炎的患者 中检测自身抗体的方法、肽和检测试剂盒"的中国发明专利申请No. 02824647.0的分案申 请。
技术领域
[0002] 本发明涉及一种通过使用包含瓜氨酸残基或其类似物的肽来从患有类风湿性关 节炎的患者中检测自身抗体的方法。
【背景技术】
[0003] 该方法由国际专利申请PCT/NL97/00624已知。该文献中描述了来源于丝聚蛋白 的，包含瓜氨酸或其类似物的肽用于从患有类风湿性关节炎的患者中检测自身抗体的应 用。因此，所用的肽适于诊断应用，并且与当时采用的方法相比，使更可靠的检测成为可能。 更特别的，该方法能降低假阳性率，也就是具有更高的特异性。此外，其敏感性也相对较高。 一种被称为cfcl的肽，被36%的来自患有类风湿性关节炎的患者的血清识别。该肽的环状 变异体表现出被更好地识别(63 % )。
[0004] 前言所述的方法还由国际专利申请PCT/FR00/01857已知。该文献中描述了来源于 纤维蛋白或纤维蛋白原的，包含瓜氨酸或其类似物的肽用于从患有类风湿性关节炎的患者 中检测自身抗体的应用。
[0005] PCT/EP98/07714中描述了来源于丝聚蛋白（原）的合成肽在诊断类风湿性关节炎 中的应用。该申请中还记载了来源于人波形纤维蛋白，细胞角蛋白1，细胞角蛋白9以及其他 中间纤丝蛋白的合成肽。
[0006] 然而，上述提到的方法仍只能从全部类风湿性关节炎患者中检测出有限数目的患 者。因此，强烈需要一种可实现敏感性增加而同时保持实质上相等或甚至提高的特异性的 方法。
【发明内容】
[0007] 为了达到该目的，本发明提供了一种如前言所述的方法，该方法的特征在于所述 的自身抗体与含有XG基序的肽单元和含有XnonG基序的肽单元接触，其中X为瓜氨酸残基或 其类似物，G为甘氨酸，而nonG为除甘氨酸以外的氨基酸。
[0008] 下述实验显示，获自患有类风湿性关节炎的患者的血清中含有两种不同的抗体 群。其中一群抗体与诸如上文提到的已出版文献中公开的XG肽单元反应。该群抗体可通过 已公开的XG肽单元部分地检测到，当采用本发明所述的肽单元时，则能检测到更大部分的 该群抗体。另一群抗体与XnonG肽单元反应。直到目前为止，在已出版的文献中还没有观察 到这群抗体。如下文更详细的记载，来自于患有类风湿性关节炎患者的大多数血清都含有 这两群抗体。因此，这些血清可以通过包括XG或XnonG肽单元的诊断测试来检测。然而看来 似乎相当大一部分患有类风湿性关节炎的患者的血清只含有两群抗体中的一种。因此，采 用上述已出版公开的文献中描述的诊断测试，无法检测或仅能检测极小一部分的仅含有对 XnonG肽单元的抗体的血清。如今，如果诊断测试中包括XnonG肽单元，贝lj可以检测大部分的 这类血清。因而本发明所述的改进诊断方法包括至少一种XG和一种XnonG肽。因此与已出版 公开文献中记载的测试相比，本发明所述的诊断测试可达到20%更为敏感。
[0009]当所述的具有XnonG基序的肽单元包括一非来源于天然蛋白如人类丝聚蛋白 (原），纤维蛋白，或纤维蛋白原，以及相关的蛋白波形纤维蛋白，及细胞角蛋白1和细胞角蛋 白9,或其他相关的中间纤丝蛋白的部分时，可以获得特别好的结果。
[0010]令人惊奇的是，结果显示，当将该非来源于天然蛋白的XnonG肽与本发明所述的XG 肽组合时，可得到一更加改进的诊断方法。更特别的，这种肽单元组合在本发明所述的方法 中的应用提供了一种敏感性非常高，且保持优异的特异性的诊断方法。由于上述提到的公 开文献仍然是基于下述观念，即来自于RA患者的自身抗体与来源于天然存在的蛋白，例如 丝聚蛋白（原），纤维蛋白，纤维蛋白原，波形纤维蛋白，细胞角蛋白1或细胞角蛋白9的肽特 别好地发生反应，因此这就更让人惊讶了。例如，PCT/EP98/07714中记载了一种丝聚蛋白来 源的XnonG肽（IPG1249)。它与3.3%的SLE患者血清交叉反应，且与丝聚蛋白有82%的同源 性。
[0011]当所述的具有XnonG基序的肽单元包含一种三肽时，则可获得较好的结果，其中三 肽的中间氨基酸为瓜氨酸或其类似物，其优选选自XXK，XXY，KXI，MXR，RXY，WXK，MXH，VXK， NXR，WXS，RXW，YXM，IXX，XXF，RXH，TXV，PXH，AXF，FXR，YXF，LXM，LXY，YXP，HXS和PXW。
[0012] 优选的，nonG为选自!1，1，1，5，1?，1(，￥^，^，(：^或其类似物的氨基酸。如下述实 验所示，这类XnonG肽单元非常有效。
[0013] 包括XG基序的肽单元，可来源于或不来源于丝聚蛋白（原），纤维蛋白，纤维蛋白 原，波形纤维蛋白，细胞角蛋白1或细胞角蛋白9,并且有效地是由PCT/NL97/00624中已知的 cfcl 〇
[0014] 在本文的上下文中，术语氨基酸包括天然的和非天然的氨基酸，和具有D-构型或 L-构型的氨基酸。
[0015] 在本申请中，非天然氨基酸应理解为该类的氨基酸存在于反一倒位肽，反向肽，其 中侧链位于肽骨架的酰胺氮原子上的肽，和其中肽骨架上的C0被2,3或优选单一-CH 2-基团 所替代的肽(假肽）中。
[0016] 氨基酸还可被修饰。例如，羧酸基团可以被酯化或可被转化为酰胺，同时氨基基团 可被烷基化，例如，甲基化。可选的，肽上的功能基团可以提供有保护基团或标记(例如荧光 或放射性标记）。肽中的氨基基团和羧酸基团可以以通过使用酸或碱而形成的盐的形式存 在。如果采用合成肽，则很容易制备可以使用的本发明范围内的所有种类的变异体。例如， 芳族侧链基团，如来源于苯丙氨酸和酪氨酸，可被一个或多个卤素原子卤化。肽模拟 (peptidomimetic)和有机模拟(organomimetic)的实施方案也落在本发明的范围内，及其 在本发明所述方法中的应用。还可采用其类似物来代替Cit残基，例如那些在图1中列出的 氨基酸形式的类似物。这种类似物及其制备方法为本领域的普通技术人员所公知。例如， Sonke et al.在 Stereoselective Biocatalysis(2000)，pp.23_58 中有记载，以及在 Greene:Protective groups in Organic synthesis(ffiley,New York 1999)中。
[0017]依照有利的实施方案，所述的瓜氨酸类似物的侧链具有如下通式(I):
[0019] 其中
[0020] Q = NH2，CH3，NHCH3SN(CH3)2;
[0021] Y = 〇，NH，或 NCH3;
[0022] 2 = 0，順或〇12;和
[0023] n = 2,3或 4;
[0024] 条件是如果Q = NH2和Z = NH，则Y不为NH。
[0025] 在本文上下文中，肽单元应理解为长度至少7个氨基酸的肽。肽单元可以具有一个 或多个侧链。同时，肽单元或肽单元的末端可以彼此相互独立地被乙酰化，糖基化，烷基化， 或磷酸化。
[0026] 本文上下文中所述的肽单元是指非来源于丝聚蛋白（原），纤维蛋白，纤维蛋白原， 波形纤维蛋白，细胞角蛋白1或细胞角蛋白9,和其他中间纤丝蛋白，如果与这些蛋白的同源 性(氨基酸序列的相似性)低于80%，更优选的低于75%，如低于70%或65%，最优选的低于 60%，例如低于55%或50%。所述的肽单元列于表5中，其非来源于丝聚蛋白（原），纤维蛋 白，纤维蛋白原，波形纤维蛋白，细胞角蛋白1和细胞角蛋白9,且同源性介于15 - 45%。关于 同源性检查，精氨酸、瓜氨酸和瓜氨酸类似物被认为是等同的（同一的）。
[0027]包括XG和XnonG的肽单元可以是或不是相同分子的一部分。随后将对此进行叙述。 为了进行检测试验，所述的肽单元可以与一载体相连，并可选地提供有标记。得到的复合物 可以通过本领域普通技术人员公知的任何方式检测。所述的复合物可以间接检测，例如在 竞争试验的情况下，其中复合物本身不标记。与两个肽单元的反应可以同时或相继地并在 相同容器(例如微量滴定板的孔)或不同容器中发生。
[0028] 本申请不旨在作为教导如何成为本领域普通技术人员的教育出版物。因此，本申 请仅限于提供了使本领域普通技术人员能够理解发明，实施发明和理解本发明要求保护的 范围的充分信息。
[0029] 优选的，所述的肽单元被确认患有RA的患者的100份随机血清中的至少2份所识 另IJ。很明显，优选采用能被显著更高百分比的，优选至少30%的血清识别的肽单元。本发明 所述方法中的肽单元的数目优选为2或大于2。
[0030] 优选的，本发明涉及上述的一种方法，其中具有XG基序的肽单元和具有XnonG基序 的肽单元被至少10%的患者系列血清同时识别。毫无疑问，优选那些导致更高敏感性的肽 单元组合。采用本文所述的一些肽单元组合，诊断测试可以获得40,60,70,80或甚至85和高 于90 %的敏感性。
[0031] 已显示，如果其中的至少一种肽单元为环状肽单元，则检测的敏感性可以进一步 提尚。
[0032] 具有XG基序的肽单元和具有XnonG的肽单元优选为多肽(multipeptide)的一部 分。根据本发明的上下文，多肽为包括至少2个抗原性肽单元的分子，也就是，可以或可以不 通过共价键连接的肽单元的组合。这种多肽可以由线性的，分枝状的，环状的肽单元或这些 的组合来组成。多肽既可以由具有相同氨基酸序列的肽单元组成，也可由具有不同氨基酸 序列的肽单元组成。根据本发明所述的多肽包括至少7个，优选至少10个氨基酸，也就是所 述的肽单元可以重叠。理所当然的，XG和XnonG基序不能重叠。
[0033]本发明还涉及对于本发明所述方法非常有用的XnonG肽单元，其包括具有如下通 式(Π)的序列：
[0034] (Al-A2-A3-A4-A5)-Cit-(A6)-(A7-A8-A9-A10-All)(II)
[0035] 其中，A1-A2-A3-A4-A5为选自下述的氨基酸序列
[0036] -RHGRQ
[0037] -IRCitYK
[0038] -HGRQCit
[0039] -GRQCitCit
[0040] -FQMCitH
[0041] -CitffRGM
[0042] -ARFQM
[0043] -QCitYKff
[0044] -KPYTV
[0045] -RNLRL
[0046] -RRRCitY
[0047] -RFKSN
[0048] -RGKSN
[0049] -RffVSQ
[0050] -MKPRY [0051 ] -KSFVff
[0052] -YSFVff
[0053] -FQMRH
[0054] -RNMNR
[0055] -RMGRP
[0056] 及其同源序列；
[0057] A7为除甘氨酸之外的氨基酸；
[0058] A7-A8-A9-A10-A11为选自下述的氨基酸序列
[0059] -KYIIY
[0060] -TNRKF
[0061] -KffCitKI
[0062] -CitRAVI
[0063] -RCitGHS
[0064] -CitGRSR
[0065] -CitYIIY
[0066] -CitRLIR
[0067] -IERKR
[0068] -FMRKP
[0069] -FMRRP
[0070] -ERNHA [0071 ] -AVITA
[0072] -TPNRff
[0073] -TYNRff
[0074] -RTPTR
[0075] -RIVVV
[007