抗癌剂感受性的判定方法
【专利说明】
[0001 ](本申请是2010年10月29日递交的发明名称为"抗癌剂感受性的判定方法"的申请 2〇1〇8〇0492〇8·2的分案申请）
技术领域
[0002] 本发明涉及用于判定作为对象的患者的癌对于欲使用的抗癌剂是否具有治疗反 应性的抗癌剂感受性判定标记及其应用。
【背景技术】
[0003] 抗癌剂，有烷基化剂、钼制剂、代谢拮抗剂、抗癌性抗生素、抗癌性植物生物碱等种 类。这些抗癌剂中，根据癌的种类不同，有时显示效果，有时不显示效果。但是，已知即使是 认为有效的种类的癌，也因各个患者而异有时显示效果，有时不显示效果。这种抗癌剂对于 各个患者的癌是否显示效果称为抗癌剂感受性。
[0004] 奥沙利铂（SP-4-2)-[(lR，2R)_环己烷-1,2-二胺-κΝ,κΝ'][乙二酸络（2-)-1001^ 02]钼（（SP-4_2)-[ (1R，2R)-cyclohexane_l，2_diamine-K：N，K：N' ] ，κ 02]platinum，IUPAC)是第3代铂配位化合物类抗恶性肿瘤药。据认为，其作用机理与先前的 药剂顺铂(CDDP)和卡铂(CBDCA)同样，通过与DNA碱基形成交联而导致DNA合成抑制、蛋白合 成抑制，但奥沙利铂(L-OHP)即使对于CDDP和CBDCA无效的大肠癌而言也表现出抗肿瘤效 果，表现出和以往的铂配位化合物类抗恶性肿瘤药不同的抗肿瘤谱。美国已经在2004年1月 承认其与氟尿嘧啶(5-FU)/左亚叶酸盐(LV)的并用作为转移性结肠-直肠癌的第一线治疗， 在日本，在2005年4月在国民健康保险的药价中也收载了对于"不能切除治愈的晚期、复发 的结肠-直肠癌"，其与左亚叶酸盐和氟尿嘧啶的静脉内持续给药法的并用(F0LF0X4法）。对 于晚期复发大肠癌的治疗而言，在二十世纪90年代前半叶之前一直采用的5-FU/LV疗法的 生存率是10~12个月，与此相对，加入了奥沙利铂的F0LF0X疗法的生存期为19.5个月，达到 几乎2倍。并且，在2009年8月，相同的通过与左亚叶酸盐和氟尿嘧啶的静脉内持续给药法的 并用所进行的"结肠癌中的术后辅助化学疗法"追加了效能、效果，是能够在大肠癌患者中 扩大使用并能够期待有益性的药剂。
[0005] 但是，尽管如此，F0LF0X疗法对于晚期复发的大肠癌发挥的效率也仅为50%左右， 换言之，意味着接受治疗的患者中有半数得不到效果。另外，因奥沙利铂的使用而导致中性 粒细胞减少症，此外呈现高频率的末梢神经损伤，尽管这些并不是致死的副作用，但都是导 致难以继续治疗的因素。因此，在治疗开始前，利用能够预测可以期待效果的患者(反应)和 不能期待效果的患者(无反应)而早期诊断治疗反应性的生物标记，就能够实现有效性和安 全性高的化学疗法。
[0006] 关于对铂类药物的化学疗法的感受性/耐性因子的报告有很多，但是这些多是以 顺铂为对象的，对于结构、功能上相关联的奥沙利铂的治疗反应性，认为主要与下述1)~3) 等相关，作为在以大肠癌患者为对象的奥沙利铂+5-FU并用疗法中的治疗反应性和预后预 测因素，正在进行与1)~3)相关的研究。
[0007] 1)奥沙利铂引起损伤的DNA的切除、修复能力的增强、
[0008] 2)在细胞内的奥沙利铂(活性体)的失活(解毒）、
[0009] 3)奥沙利铂的细胞内积蓄量的降低。
[0010] 关于1)，对于在核苷酸切除修复(nucleotide excision repair:NER)中发挥重要 作用的切除修复交叉互补基因1 (Excision repair cross-complementing group 1， ERCCl)而言，有报告肿瘤内ERCCl的基因表达量是预后因素(非专利文献1)，对于作为ERCCl 的单核苷酸多态性(SNP)之一的C118T而言，有报告具有C/C纯合子的患者比具有至少1个以 上的T等位基因的患者具有良好的生存率（非专利文献2)。有报告在着色性干皮病基因D (xeroderma pigmentosum D，XPD，也作为ERCC2已知）中，伴有Lys751Gln的氨基酸突变的遗 传多态性与肿瘤缩小率和生存期相关(非专利文献2、3)。有报告报告了 X射线修复交叉互补 基因 l(X-ray repair cross-complementing group 1，XRCC 1)的伴有Arg399Gln的氨基酸 突变的遗传多态性与肿瘤缩小效果的关系，其中，该X射线修复交叉互补基因1编码据认为 在碱基切除修复(base excision repair:BER)中与有效修复因暴露于烷基化剂等形成的 DNA单链切断的蛋白质相关(非专利文献4)，但是有报告，根据以同一个患者为对象的后续 分析，其对临床预后没有影响（非专利文献2)。尽管据认为DNA错配修复（DNAmismatch repair: MMR)也参与对顺钼的感受性下降，但是有报告，在体外（in vitro)的研究中，MMR不 参与由奥沙利铂导致的DNA损伤部位的修复(非专利文献5)。
[00?1 ] 关于2)，谷胱苷肽硫转移酶(Glutathione-S_transferase，GST)是承担解毒、代谢 的第Π相反应的酶之一，通过催化DNA铂加成物与谷胱苷肽形成抱合体而将药剂失活。有报 告在GST亚型中，GSTP1在大肠癌中的表达量增高，伴随Ilel05Val的氨基酸突变的遗传多态 性与生存期相关(生存期中间值：Ile/Ile为7.9个月、116八 &1为13.3个月、￥&1八&1为24.9 个月）（非专利文献6)。
[0012] 关于3)，有报告在使用培养细胞进行的研究中，有机阳离子转运体(OCTs)与奥沙 利铂向细胞内输送和感受性相关(非专利文献7)，此外，也有报告ATP7A、ATP7B等与铜或重 金属的输送相关的转运蛋白与感受性的相关(非专利文献8、9)。但是，关于它们的表达与奥 沙利钼治疗反应性的关联，尚未进彳丁临床研究。
[0013] 在以接受了F0LF0X疗法的晚期大肠癌患者为对象的最近的临床研究中，报告了 ERCCl的遗传多态性(Asnll8Asn)和XPD的遗传多态性(Lys751Gln)独立地与无进展生存期 (PFS)相关，但对于GSTPl(Ilel05Val)而言，没有发现与PFS的关联，而确认与奥沙利铂诱发 神经毒性关联的倾向（非专利文献10)。
[0014] 在体外（in vitro)研究中，关于铂配位化合物类的先前药剂顺铂的耐性相关因素 有大量报告，关于奥沙利铂，也报告了与FAS/FASL、Bcl-xL等凋亡相关因素的关联(非专利 文献11、12)。但是，除了奥沙利铂因癌种类而异而表现出与顺铂不同的治疗反应性以外，癌 细胞对于担负奥沙利铂的细胞损伤活性的铂DNA加成物的细胞应答几乎尚未阐明，能够预 测对于使用奥沙利铂的化学疗法的治疗反应性的明确的生物标记尚未确立。
[0015] 氟尿嘧啶，是1957年开发的氟化嘧啶类抗癌剂，现在为消化器官癌化学疗法的基 本药剂。进入癌细胞的氟尿嘧啶通过下述作用机理发挥杀细胞效果，即，主要通过活性代谢 物一磷酸氣代脱氧尿苷(fluorodeoxyuridine-5' -monophosphate，FdUMP)引起胸苷酸合酶 (thymidylate synthase，TS)抑制，从而引起DNA合成抑制，此外，通过作为相同的活性代谢 物的5-氟尿苷三磷酸（5-fluorouridine triphosphate，FUTP)引起RNA功能抑制等。
[0016]对于氟化嘧啶类抗癌剂的治疗反应性的预测，至今为止进行了很多研究，特别是 对作为氟尿啼啶的分解酶的双氢啼啶脱氢酶(dihydropyrimidine dehydrogenase，DPD)和 作为活性代谢物的标的酶胸苷酸合酶（thymidylate synthase，TS)的报告很多。有报告在 氟尿嘧啶异化代谢的限速酶DPD高表达的肿瘤中表现为氟尿嘧啶耐性(非专利文献13)，但 是使用临床检测体的验证报告并不多。对于TS表达而言，有报告指出不论采用酶活性、蛋白 质水平还是RNA水平等的测定方法，其多寡均为氟化嘧啶类抗癌剂的治疗效果决定因子(非 专利文献14、15)。但是，这些所有的报告中，没有得到必然一致的结果，并且不知道在治疗 早期预测对氟尿嘧啶的治疗反应性的明确的生物标记。
[0017]此外，也有报告，在氟尿嘧啶耐性的转移性大肠癌患者中，肿瘤内ERCC1和TS的 mRNA表达量是5-FU/L-OHP并用疗法的治疗反应性预测因子(非专利文献16)。但是最近，在 以晚期大肠癌患者为对象的化学疗法的治疗反应性生物标记相关的大规模临床试验 (FOCUS Trial)的报告中，ERCC1不是5-FU/L-OHP并用疗法的有意义的效果预测因子，只有I 型拓扑异构酶(Topoisomerase-1，Topol)显示了弱的关联性(非专利文献17)。这表示尚未 确立能够可靠发现可以期待由5-FU/L-OHP并用疗法带来高治疗效果的患者的生物标记。并 且，通常，癌化学疗法的治疗疗程是长期进行的，在治疗过程中，对抗癌剂感受性的经时监 控能够判断是否继续治疗，不仅从患者负担和降低副作用方面出发，而且从医疗经济的观 点出发也是有用的。为了实现预测各个患者的治疗反应性并早期诊断，选择适宜的药剂和 治疗方法进行"个别化治疗"，确立能够进行5-FU、L-OHP和5-FU/L-OHP并用时的效果预测或 治疗反应性的早期诊断的生物标记是当务之急。
[0018] 现有技术文献
[0019] 非专利文献
[0020] 非专利文献 l:J.Clin.Oncol.l9,4298_43〇4( 2〇01)
[0021] 非专利文献2:Br.J.Cancer 91,344-354(2004)
[0022] 非专利文献3:Cancer Res 61，8654_8658(2〇01)
[0023] 非专利文献4:Anticancer Res.2l，3〇75_3〇79( 2〇01)
[0024] 非专利文献5:Cancer Res.56,4881-4886( 1996)
[0025] 非专利文献6: J.Natl .Cancer Inst.94,936-942(2002)
[0026] 非专利文献7:Cancer Res.66,8847-8857(2006)
[0027] 非专利文献8 :Mol ·Pharmacol · 66,25-32(2004)
[0028] 非专利文献9:Clin.Cancer Res. 10,4661-4669(2004)
[0029] 非专利文献 10: J.Clin.Oncol. 25,1247-1254(2007)
[0030] 非专利文献 11 :Clin.Cancer Res. 11,4770-4774(2005)
[0031] 非专利文献 12: J.Biol.Chem. 279,46113-46121 (2004)
[0032] 非专利文献l3:European Journal of Cancer 2004;40:939_95〇·
[0033] 非专利文献 14:Cancer Treatment Reviews 2002;28:27-47
[0034] 非专利文献 15:J Clin Oncol 2004;22:529-536
[0035] 非专利文献 16:J Clin Oncol 2001;19:4298-4304
[0036] 非专利文献 17:J Clin Oncol 2008;26:2690-2698.
【发明内容】
[0037] 发明要解决的课题
[0038] 本发明的目的在于提供一种能够判别各个患者的治疗反应性的抗癌剂感受性判 定标记和利用其的新的癌症治疗方法。
[0039]用于解决课题的方法
[0040]为此，本发明的发明人培养人癌细胞株，使用表面增强激光解析电离飞行时间型 质量分析仪(SELDI-T0F MS)对药剂暴露后的细胞内蛋白质的经时表达变化进行网罗式分 析，由此，进行抗癌剂感受性判定标记的探索。对于对5-FU、L-OHP、和两者并用（5-FU/L-0ΗΡ)表现出高感受性、低感受性的2种人大肠癌细胞，暴露于5-FU单剂、L-OHP单剂、5-FU/L-0ΗΡ并用，研究药剂暴露后的细胞内蛋白质的经时表达变化。其结果，在5-FU暴露后，发现在 高感受性细胞中细胞内观察到表达水平上升的峰，该峰发现是在质量分析仪中，本体或其 片段是作为m/z 5300~5400的峰被检测出的蛋白质、作为m/z 6130~6230的峰被检测出的 蛋白质、作为m/z 7000~7080的峰被检测出的蛋白质、作为m/z 7840~7920的峰被检测出 的蛋白质、作为m/z 17100~17270的峰被检测出的蛋白质、作为m/z 18290~18470的峰被 检测出的蛋白质、作为m/z 24660~24750的峰被检测出的蛋白质、作为m/z35980~36290的 峰被检测出的蛋白质、作为m/z 9100~9200的峰被检测出的蛋白质、钙结合蛋白质 S100A10〇
[00411同样，在L-OHP暴露后，发现在高感受性细胞和低感受性细胞中观察到细胞内表达 水平的不同的经时变化的峰，该峰发现是在质量分析仪中，本体或其片段是作为m/z 5300 ~5400的峰被检测出的蛋白质、作为m/z 6130~6230的峰被检测出的蛋白质、作为m/z 7000~7080的峰被检测出的蛋白质、作为m/z 7840~7920的峰被检测出的蛋白质、作为m/z 12440~12560的峰被检测出的蛋白质、作为m/z 17100~17 270的峰被检测出的蛋白质、作 为m/z 18290~18470的峰被检测出的蛋白质、作为m/z 24660~24750的峰被检测出的