一种利用免疫荧光测定古代羊毛织品的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及文物检测技术领域，尤其涉及一种利用免疫荧光测定古代羊毛织品的检测方法。
【背景技术】
[0002]羊毛织品是古代北方地区主要的纺织原料，是中国的宝贵遗产。但由于北方地区的环境因素以及羊毛蛋白纤维的性质，腐朽文物大都化为痕迹，如何采用科学的手段鉴定羊毛成了燃眉之急。常用的检测方法受样品、杂质等影响较大，结果准确性不高，所以一种更加简便、直观的科学方法迫切需要。
[0003]申请号为201010577180.1的中国专利公开了一种物理法细化羊毛纤维与羊绒、羊毛混纺纤维含量分析方法，是利用纤维照相技术把所有物理细化绵羊毛纤维工艺生产的拉伸绵羊毛进行分类拍照建成图谱库，把物理细化绵羊毛纤维工艺技术得到的拉伸羊毛纤维整纤维长度上的鳞片变化形态、特点分类说明。采取对比、分类比对综合观测分析方法定性，用投影显微镜根据国家方法标准GB/T16988-1997《特种动物纤维与绵羊毛混和物含量的测定》检测不同纤维混纺比例。该方法的实施，解决了物理细化绵羊毛纤维与绵羊毛、羊绒等特种动物纤维形成的二组分或多组分混纺产品的纤维含量测定没有相应的国家标准的问题，测定准确率100%，检验结果均在国家产品标准的误差范围内。
[0004]但是上述方法只是适用于现代羊毛织品中的羊毛含量检测，对于羊毛织品文物并不适用。
【发明内容】
[0005]为了解决上述技术问题，本发明提供了一种利用免疫荧光测定古代羊毛织品的检测方法。本发明采用免疫荧光的方法对古代羊毛织品进行了检测，一方面灵敏度高，操作简单，成本低，结果直观，易于分析。另一方面能够避免来自其它蛋白的干扰，特异性强。
[0006]本发明的具体技术方案为:一种利用免疫荧光测定古代羊毛织品的检测方法，采用如下步骤:
A)取三块大小一致的文物样并分别放置于三个打孔皿中，并将打孔皿分别标记为A、B、C;用pH 7.4的I3BS缓冲液对文物样进行洗涤直至文物样表面无附着物;接着向A中加入10-50体积份的兔抗羊毛角蛋白抗体稀释液，向C中加入10-50体积份的pH7.4的PBS溶液，B不作处理；分别将A、B、C冷藏10-14h;然后分别向各打孔皿中加入1500-2500体积份的pH7.4的PBS溶液，浸泡4-6min，洗涤三次，每次2_4min。
[0007]B)分别向A、B中加入10-50体积份的绿色荧光素标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体稀释液，向C中加入10-50体积份的pH 7.4的PBS溶液;然后分别将A、B、C放置于底层铺有湿毛巾的盒子中，用锡箔纸将盒子密封，36-38°C避光孵育0.5-2h;然后分别向各打孔皿中加入1500-2500体积份的pH 7.4的PBS溶液，浸泡4_6min，洗涤三次，每次2_4min。
[0008]C)分别向A，B，C中加入8-12体积份的缓冲甘油进行封片。
[0009]D)将A，B，C放置于激光共聚焦显微镜下进行观察;若B，C未发出绿色的荧光，而A发出了绿色的荧光，说明文物样与兔抗羊毛角蛋白抗体发生了特异性结合，证明文物样为羊毛织品O
[0010]本发明采用免疫荧光的方法对古代羊毛织品进行了检测，将兔抗羊毛角蛋白抗体浸渍于文物样表面，洗涤干净后，加入绿色荧光素标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体，形成抗原-一抗-二抗复合物，然后洗涤干净将文物样放在激光共聚焦显微镜下观察。可根据样品是否发出绿色荧光进行定性分析。
[0011 ] 作为优选，所述pH7.4的PBS缓冲液配制方法如下:称取KCl0.2g, KH2PO40.27g，NaCl8.0g,Na2HPO41.42g，用800mL蒸馏水溶解并定容至100mL，调节pH至7.4。
[0012]作为优选，步骤C)中所述缓冲甘油的配制方法如下:称取Na2CO30.1 5g，NaHCO30.29g，用800mL蒸馏水溶解并定容至lOOOmL，调节pH至9.6 ；将pH 9.6的I3BS缓冲液和丙三醇按照体积比1:1混合。
[0013]作为优选，所述兔抗羊毛角蛋白抗体稀释液的制备方法为:用质量浓度为1%的牛血清白蛋白溶液将初始浓度为lmg/mL的兔抗羊毛角蛋白抗体稀释10-200倍。
[0014]作为优选，所述绿色荧光素标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体稀释液的制备方法如下:用质量浓度为1%的牛血清白蛋白溶液将绿色荧光素标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体溶液稀释50-500倍。
[0015]作为优选，绿色荧光素山羊抗兔IgG(H+L)抗体溶液的制备方法如下:向每2.5-3.5mL pH为5.5的PBS缓冲液中依次加入0.14-0.16mg的绿色荧光微球、2.6-2.8yL的现配的浓度为4_6mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和8-12yL的浓度为lmg/mL的山羊抗兔IgG(H+L)抗体溶液，得到混合液，将所述混合液在室温下搅拌1.5-2.5h，用1被％的牛血清蛋白溶液封闭25-35min后在8000-10000 r/min、4°C条件下离心处理8_12min，移除上清液，将沉淀加入到体积为山羊抗兔IgG(H+L)抗体溶液I倍pH为5.5的PBS缓冲液中复溶、混匀，制得绿色荧光素标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体溶液。
[0016]与现有技术对比，本发明的有益效果是:本发明采用免疫荧光的方法对古代羊毛织品进行了检测，一方面灵敏度高，操作简单，成本低，结果直观，易于分析。另一方面能够避免来自其它蛋白的干扰，特异性强。
【具体实施方式】
[0017]下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
[0018]实施例1
一种利用免疫荧光测定古代羊毛织品的检测方法，采用如下步骤:
原料制备:
ρΗ7.4的PBS缓冲液:称取KCl0.2g，KH2PO40.27g，NaCl 8.0g,Na2HPO4I.42g，用800mL蒸馏水溶解并定容至1000mL，调节pH至7.4。
[0019]缓冲甘油:称取Na2CO30.15g,NaHCO30.29g，用800mL蒸馏水溶解并定容至100mL，调节pH至9.6;将pH 9.6的PBS缓冲液和丙三醇按照体积比1:1混合。
[0020]兔抗羊毛角蛋白抗体稀释液:用质量浓度为1%的牛血清白蛋白溶液将初始浓度为lmg/ mL的兔抗羊毛角蛋白抗体稀释100倍。
[0021]绿色荧光素标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体稀释液:向3mLpH为5.5的I3BS缓冲液中依次加入0.15mg的绿色焚光微球、2.7yL的现配的浓度为5mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和1yL的浓度为lmg/mL的山羊抗兔IgG(H+L)抗体溶液，得到混合液，将所述混合液在室温下搅拌2h，用lwt%的牛血清蛋白溶液封闭30min后在9000 r/min、4 °C条件下离心处理1min，移除上清液，将沉淀加入到体积为山羊抗兔IgG(H+L)抗体溶液I倍pH为5.5的PBS缓冲液中复溶、混匀，制得绿色荧光素标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体溶液。用质量浓度为1%的牛血清白蛋白溶液将绿色荧光素标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体溶液稀释300倍。
[0022]A)取三块大小一致的文物样并分别放置于三个打孔皿中，并将打孔皿分别标记为A、B、C;用pH 7.4的PBS缓冲液对文物样进行洗涤直至文物样表面无附着物;接着向A中加入30yL的兔抗羊毛角蛋白抗体稀释液，向C中加入30yL的pH7.4的PBS溶液，B不作处理;分别将八、8、(:冷藏1211;然后分别向各打孔皿中加入2000yL的pH7.4的I3BS溶液，浸泡5min，洗涤三次，每次3min。
[0023]B)分别向A、B中加入30yL的绿色荧光素标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体稀释液，向C中加入30yL的pH 7.4的PBS溶液;然后分别将A、B、C放置于底层铺有湿毛巾的盒子中，用锡箔纸将盒子密封，37°C避光孵育1.25h;然后分别向各打孔皿中加入2000yL的pH 7.4的PBS溶液，浸泡5min，洗涤三次，每次3min。
[0024]C)分别向A，B，C中加入1yL的缓冲甘油进行封片。
[0025]D)将A，B，C放置于激光共聚焦显微镜下进行观察;结果B，C未发出绿色的荧光，而A发出了绿色的荧光，说明文物样与兔抗羊毛角蛋白抗体发生了特异性结合，证明文物样为羊毛织品。
[0026]实施例2
一种利用免疫荧光测定古代羊毛织品的检测方法，采用如下步骤:
原料制备:
ρΗ7.4的PBS缓冲液:称取KCl0.2g，KH2PO40.27g，NaCl 8.0g,Na2HPO4I.42g，用800mL蒸馏水溶解并定容至1000mL，调节pH至7.4。
[0027]缓冲甘油:称取Na2CO30.15g,NaHCO30.29g，用800mL蒸馏水溶解并定容至100mL，调节pH至9.6;将pH 9.6的PBS缓冲液和丙三醇按照体积比1:1混合。
[0028]兔抗羊毛角蛋白抗体稀释液:用质量浓度为1%的牛血清白蛋白溶液将初始浓度为lmg/mL的兔抗羊毛角蛋白抗体稀释1倍。
[0029]绿色荧光素标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体稀释液:向2.5mL pH为5.5的PBS缓冲液中依次加入0.14mg的绿色焚光微球、2.6yL的现配的浓度为4mg/m