L的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和8yL的浓度为lmg/mL的山羊抗兔IgG(H+L)抗体溶液，得到混合液，将所述混合液在室温下搅拌1.5h，用lwt%的牛血清蛋白溶液封闭25min后在8000 r/min、4°C条件下离心处理8min，移除上清液，将沉淀加入到体积为山羊抗兔IgG(H+L)抗体溶液I倍pH为5.5的PBS缓冲液中复溶、混匀，制得绿色荧光素标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体溶液。用质量浓度为1%的牛血清白蛋白溶液将绿色荧光素标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体溶液稀释50倍。
[0030]A)取三块大小一致的文物样并分别放置于三个打孔皿中，并将打孔皿分别标记为A、B、C;用pH 7.4的PBS缓冲液对文物样进行洗涤直至文物样表面无附着物;接着向A中加入1yL的兔抗羊毛角蛋白抗体稀释液，向C中加入1yL的pH7.4的PBS溶液，B不作处理;分别将A、B、C冷藏1h;然后分别向各打孔皿中加入1500yL的pH7.4的I3BS溶液，浸泡4min，洗涤三次，每次2min。
[0031]B)分别向A、B中加入1yL的绿色荧光素标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体稀释液，向C中加入1yL的pH 7.4的PBS溶液;然后分别将A、B、C放置于底层铺有湿毛巾的盒子中，用锡箔纸将盒子密封，36 °C避光孵育0.5h;然后分别向各打孔皿中加入1500yL的pH 7.4的PBS溶液，浸泡4min，洗涤三次，每次2min。
[0032]C)分别向A，B，C中加入8yL的缓冲甘油进行封片。
[0033]D)将A，B，C放置于激光共聚焦显微镜下进行观察;结果B，C未发出绿色的荧光，而A发出了绿色的荧光，说明文物样与兔抗羊毛角蛋白抗体发生了特异性结合，证明文物样为羊毛织品。
[0034]实施例3
一种利用免疫荧光测定古代羊毛织品的检测方法，采用如下步骤:
原料制备:
ρΗ7.4的PBS缓冲液:称取KCl0.2g，KH2PO40.27g，NaCl 8.0g,Na2HPO4I.42g，用800mL蒸馏水溶解并定容至1000mL，调节pH至7.4。
[0035]缓冲甘油:称取Na2CO30.15g,NaHCO30.29g，用800mL蒸馏水溶解并定容至100mL，调节pH至9.6;将pH 9.6的PBS缓冲液和丙三醇按照体积比1:1混合。
[0036]兔抗羊毛角蛋白抗体稀释液:用质量浓度为1%的牛血清白蛋白溶液将初始浓度为lmg/mL的兔抗羊毛角蛋白抗体稀释200倍。
[0037]绿色荧光素标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体稀释液:向3.5mL pH为5.5的PBS缓冲液中依次加入0.16mg的绿色焚光微球、2.8yL的现配的浓度为6mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和12yL的浓度为lmg/mL的山羊抗兔IgG(H+L)抗体溶液，得到混合液，将所述混合液在室温下搅拌2.5h，用lwt%的牛血清蛋白溶液封闭35min后在10000 r/min、4°(:条件下离心处理12min，移除上清液，将沉淀加入到体积为山羊抗兔IgG(H+L)抗体溶液I倍pH为5.5的PBS缓冲液中复溶、混匀，制得绿色荧光素标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体溶液。用质量浓度为1%的牛血清白蛋白溶液将绿色荧光素标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体溶液稀释500倍。
[0038]A)取三块大小一致的文物样并分别放置于三个打孔皿中，并将打孔皿分别标记为A、B、C;用pH 7.4的PBS缓冲液对文物样进行洗涤直至文物样表面无附着物;接着向A中加入50yL的兔抗羊毛角蛋白抗体稀释液，向C中加入50yL的pH7.4的PBS溶液，B不作处理;分别将八、8、(:冷藏1411;然后分别向各打孔皿中加入2500yL的pH7.4的I3BS溶液，浸泡6min，洗涤三次，每次4min。
[0039]B)分别向A、B中加入50yL的绿色荧光素标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体稀释液，向C中加入50yL的pH 7.4的PBS溶液;然后分别将A、B、C放置于底层铺有湿毛巾的盒子中，用锡箔纸将盒子密封，38°C避光孵育2h;然后分别向各打孔皿中加入2500yL的pH 7.4的PBS溶液，浸泡6min，洗涤三次，每次4min。
[0040]C)分别向A，B，C中加入12yL的缓冲甘油进行封片。
[0041]D)将A，B，C放置于激光共聚焦显微镜下进行观察;结果B，C未发出绿色的荧光，而A发出了绿色的荧光，说明文物样与兔抗羊毛角蛋白抗体发生了特异性结合，证明文物样为羊毛织品。
[0042]本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备;本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0043]以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
【主权项】
1.一种利用免疫荧光测定古代羊毛织品的检测方法，其特征在于采用如下步骤: A)取三块大小一致的文物样并分别放置于三个打孔皿中，并将打孔皿分别标记为A、B、C;用pH 7.4的I3BS缓冲液对文物样进行洗涤直至文物样表面无附着物;接着向A中加入10-50体积份的兔抗羊毛角蛋白抗体稀释液，向C中加入10-50体积份的pH7.4的PBS溶液，B不作处理；分别将A、B、C冷藏10-14h;然后分别向各打孔皿中加入1500-2500体积份的pH7.4的PBS溶液，浸泡4-6min，洗涤三次，每次2_4min ； B)分别向A、B中加入10-50体积份的绿色荧光素标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体稀释液，向C中加入10-50体积份的pH 7.4的PBS溶液;然后分别将A、B、C放置于底层铺有湿毛巾的盒子中，用锡箔纸将盒子密封，36-38°C避光孵育0.5-2h;然后分别向各打孔皿中加入1500-2500体积份的pH 7.4的PBS溶液，浸泡4-6min，洗涤三次，每次2-4min; C)分别向A，B，C中加入8-12体积份的缓冲甘油进行封片； D)将A，B，C放置于激光共聚焦显微镜下进行观察;若B，C未发出绿色的荧光，而A发出了绿色的荧光，说明文物样与兔抗羊毛角蛋白抗体发生了特异性结合，证明文物样为羊毛织品O2.如权利要求1所述的一种利用免疫荧光测定古代羊毛织品的检测方法，其特征在于，所述PH7.4的PBS缓冲液配制方法如下:称取KCl0.2g,KH2PO40.27g，NaCl 8.0g,Na2HPO41.42g，用800mL蒸馏水溶解并定容至100mL，调节pH至7.4。3.如权利要求1所述的一种利用免疫荧光测定古代羊毛织品的检测方法，其特征在于，步骤C)中所述缓冲甘油的配制方法如下:称取Na2CO30.15g,NaHCO30.29g，用800mL蒸馏水溶解并定容至100mL，调节pH至9.6;将pH 9.6的PBS缓冲液和丙三醇按照体积比1:1混合。4.如权利要求1所述的一种利用免疫荧光测定古代羊毛织品的检测方法，其特征在于，所述兔抗羊毛角蛋白抗体稀释液的制备方法为:用质量浓度为1%的牛血清白蛋白溶液将初始浓度为lmg/mL的兔抗羊毛角蛋白抗体稀释10-200倍。5.如权利要求1所述的一种利用免疫荧光测定古代羊毛织品的检测方法，其特征在于，所述绿色荧光素标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体稀释液的制备方法如下:用质量浓度为1%的牛血清白蛋白溶液将绿色荧光素标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体溶液稀释50-500倍。6.如权利要求5所述的一种利用免疫荧光测定古代羊毛织品的检测方法，其特征在于，绿色荧光素山羊抗兔IgG(H+L)抗体溶液的制备方法如下:向每2.5-3.5mL pH为5.5的I3BS缓冲液中依次加入0.14-0.16mg的绿色焚光微球、2.6-2.8yL的现配的浓度为4_6mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和8-12yL的浓度为lmg/mL的山羊抗兔IgG(H+L)抗体溶液，得到混合液，将所述混合液在室温下搅拌1.5-2.5h，用lwt%的牛血清蛋白溶液封闭25-35min后在8000-10000 r/min、4°C条件下离心处理8_12min，移除上清液，将沉淀加入到体积为山羊抗兔IgG(H+L)抗体溶液I倍pH为5.5的PBS缓冲液中复溶、混匀，制得绿色荧光素标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体溶液。
【专利摘要】本发明涉及文物检测技术领域，公开了一种利用免疫荧光测定古代羊毛织品的检测方法，包括：A）将三块文物样放于A、B、C三个打孔皿中；用PBS缓冲液对文物样进行洗涤；向A中加入兔抗羊毛角蛋白抗体稀释液，C中加入PBS溶液；冷藏后向各打孔皿中加入PBS溶液，浸泡、洗涤；B）向A、B中加入绿色荧光素标记山羊抗兔IgG（H+L）抗体稀释液，C中加入PBS溶液；将A、B、C避光孵育；然后向各打孔皿中加入PBS溶液，浸泡，洗涤；C）向A，B，C中加入缓冲甘油进行封片；D）将A，B，C放置于激光共聚焦显微镜下进行观察检测。本发明方法灵敏度高，操作简单，成本低，结果直观，易于分析。
【IPC分类】G01N33/68, G01N33/533
【公开号】CN105699642
【申请号】CN201610092565
【发明人】游秋实, 王秉, 刘杨, 刘意
【申请人】浙江理工大学
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年2月19日