一种浮游植物细胞粒径分布的检测分析方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于浮游植物细胞粒径分布的检测分析方法，1）对含有浮游植物细胞的样品进行预处理，将细胞浓度调至适宜范围；2）根据叶绿素a自发荧光，经流式细胞仪分析，筛选出浮游植物细胞；3）在相同测试条件下利用不同粒径的荧光微球拟合前向散色信号强度值（FSC）与颗粒粒径值Φ的Φ-FSC标准曲线，获将FSC信号强度转化为粒径值的拟合函数；4）在步骤2）基础上，生成筛选后浮游植物细胞进样颗粒数量分布同FSC分布的峰图，在步骤3）基础上，计算进样样品中细胞计数均值所对应的颗粒粒径，获得浮游植物细胞粒径分布情况。本发明操作简单，能得到统计意义上的浮游植物粒径分布，可用以开展浮游植物群体粒径组成、生态结构等研究。
【专利说明】
一种浮游植物细胞粒径分布的检测分析方法
技术领域
[0001] 本发明属于生态环境研究领域，具体涉及采用流式细胞术检测分析浮游植物细胞 的粒径分布，尤其是快速获得统计意义上的粒径分布。
【背景技术】
[0002] 浮游植物是在水中以浮游方式生活的微小植物的统称，广泛分布于全球海洋与淡 水水体中，是水生态系统中最主要的初级生产者和能量转换者。在对浮游植物研究的众多 参量中，粒径是一个非常重要的参数，浮游植物的新陈代谢、光合作用、能量利用等生理特 征都与粒径有关，不同粒径的浮游植物对水生态系统的初级生产力的贡献不同。
[0003] 近年来，在水生态学与生物地球化学领域中，广泛开展了对浮游植物粒径组成、影 响因素，以及浮游植物的生物、化学过程粒径效应等研究工作，这对揭示水生态环境中浮游 植物群落结构与功能，以及生物、化学过程的作用机理等具有重要的科学意义。
[0004] 目前测量浮游植物粒径的方法主要包括显微测微计法、图像分析法、叶绿素a粒 级分离法、库尔特计数法等。显微测微计法和图像分析法都具有直观的优点，但其工作量 大，耗时多，难以实现有统计学意义上的多个细胞测量，无法直接给出其粒径分布。叶绿素 a粒级分离法采用网筛和滤膜进行粒级分离，精度不高，方法也较为繁琐。库尔特法可以通 过测量细胞的等效球径和表面积，直接得到细胞体积及其分布，但此方法无法将浮游植物 与泥沙等其他颗粒区分开，因此测量之前需要事先将浮游植物分离出来。
[0005] 近年来，有研究采用流式细胞术，借助于浮游藻类细胞的叶绿素自发荧光对浮游 植物丰度、群落结构组成、种群动态等方面进行检测分析，尤其是针对水体中微型藻类（原 绿球藻、聚球藻）或超微型真核生物，通常多直接通过散色光及荧光信号强弱直接辨识与 计数，获得该类型（微型或超微型）藻类在整个种群中所占比重。因缺乏有效的检测分析 方法，目前还未见采用流式细胞术对浮游植物粒径分布情况进行检测，亦无法获取具有统 计意义的水样中浮游植物细胞粒径分布谱图。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术的不足，本发明提供一种用于浮游植物粒径分布的检测分析方法， 该方法操作简单，样品需求量少，分级效率高，能将浮游植物与泥沙等其他杂质区分开来， 并快速得到浮游植物的粒径分布，绘制水样中浮游植物粒径分布谱图。
[0007] 为了实现上述目的，本发明提供的一种用于浮游植物粒径分布的检测分析方法，
[0008] 1)、采用流式细胞仪，对预处理后的待测样品进行检测，筛选出浮游植物细胞；
[0009] 2)、在相同测试条件下利用不同粒径的荧光微球拟合前向散色信号强度值（FSC) 与颗粒粒径值Φ的Φ-FSC标准曲线，获将FSC信号强度转化为粒径值的拟合函数；
[0010] 3)、生成筛选后浮游藻类细胞颗粒数量分布同FSC的峰图，根据拟合函数关系，确 定浮游植物细胞粒径分布。
[0011] 本发明的具体技术方案如下：
[0012] 1)样品预处理
[0013] 用50 μ m筛絹对含有浮游植物的水样进行过滤，去除50 μ m以上的杂质颗粒，浮游 动物、碎肩、泥沙等。根据样品细胞浓度多寡，选择稀释或浓缩样品，达到理想样品所含细胞 浓度：1X10 5~100X 10 5cells/ml。
[0014] 若样品中存在群体生长的浮游植物，如微囊藻、鱼腥藻、束丝藻等，可用超声波细 胞粉碎机，选择特定的功率、时间和超生频率，对浮游植物群体进行超声分散，使成为单细 胞分散状态，以便于进样分析。
[0015] 若为实验室纯种样品，因杂质含量较少，可直接进样。
[0016] 2)采用流式细胞术筛选浮游植物
[0017] 根据样品调试测试条件，调整PerCP-PE双色荧光补偿，利用逻辑门框选出含叶绿 素a (PerCP通道检测呈阳性）的细胞，即为样品中浮游植物，同时得到浮游植物在样品中的 数量百分比。
[0018] 3)颗粒粒径Φ同前向角散射强度值（FSC)标准曲线绘制
[0019] 因颗粒粒径同前向角散射强度值（FSC)呈正相关关系，故在步骤2)相同的测试条 件下，以FITC通道检测标准粒径荧光微球（如：0. 5μπι、1 μπι、2μπι、6μπι)的FSC强度均值， 拟合出颗粒粒径Φ-FSC的标准曲线，获得Φ-FSC拟合函数，将该条件下的FSC信号强度转 化为粒径值。
[0020] 4)浮游植物细胞粒径分布分析
[0021] 在步骤2)基础上，以FSC强度值为横坐标，筛选后浮游植物细胞计数情况 (counts)为纵坐标，生成筛选出的浮游植物细胞数量分布同FSC强度分布的峰变化图。
[0022] 根据研究需要，在流式细胞仪分析软件中，将横坐标FSC值截分成若干区段，确定 每个区段FSC强度均值和对应的细胞计数均值，并在步骤3) Φ-FSC曲线拟合函数基础上， 计算进样样品中细胞计数均值所对应的颗粒粒径，获得浮游植物细胞粒径分布情况。
[0023] 若所采用的流式细胞仪及配套软件能够自动提供每个进样颗粒的FSC信号强度， 则可直接在步骤3) Φ-FSC曲线拟合函数基础上，直接换算每个进样浮游藻类细胞的粒径 值，并获得浮游植物细胞粒径分布情况与分布谱图。
[0024] 本发明分级效率高，样品需求量少，操作简单，能将浮游植物与其他杂质颗粒区 分，避免杂质颗粒对实验结果的干扰，并且能够快速处理多个样品，得到统计意义上的浮游 植物粒径分布，可以满足科学、高效开展浮游植物群体粒径组成、生态结构等实验研究的相 关要求。
【附图说明】
[0025] 图1显示为本发明的检测分析方法的流程图。
[0026] 图2为实施例2中框选出的浮游植物细胞群体。
[0027] 图3为荧光微球流式细胞测试分析结果。
[0028] 图4为荧光球颗粒粒径同FSC值得标准曲线。
[0029] 图5浮游植物细胞进样颗粒分布与FSC信号强度峰变化。
【具体实施方式】
[0030] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书 所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实 施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0031] 实施例1
[0032] 流式细胞仪最早应用于生物医学研究领域。当单个带有荧光素标记物或具有自发 荧光色素的细胞通过激光照射区时，受激发产生散色光和荧光信号，其中前向散射光（FSC) 信号强弱与所检测细胞的粒径有关，而荧光信号可以用来区分浮游植物与泥沙等其他杂 质。
[0033] 浮游植物都含有光合色素，受激光激发能自发产生荧光，并且不同色素的荧光特 性不同。如受488nm激光激发，叶绿素a发出红色荧光（PerCP通道），藻红蛋白则发出橘 黄色荧光（PE通道）。而叶绿素a是浮游植物最基本的光合色素，所有的浮游植物均含有 叶绿素a。故利用PerCP通道检测并筛选出阳性细胞，可将浮游植物与其他杂质区分出来。 再利用流式细胞仪的FSC前向散色光信号，通过标准粒径的荧光微球标定，可得到浮游植 物的粒径分布。
[0034] 根据上述思路，根据附图1所示，本实施例的具体操作步骤为：
[0035] 样品的预处理
[0036] 对于天然水体样品，因样品中颗粒物组成复杂，为保证不堵塞仪器进样孔，上样前 用50 μ m筛絹对含有浮游植物的样品进行过滤，去除50 μ m以上的杂质颗粒。若为实验室 纯种样品，因杂质含量较少，可直接进样。
[0037] 流式细胞仪进样的理想样品细胞浓度为1X105~100X 10 5cells/ml，根据 样品的实际浓度多寡，如果大于l〇〇Xl〇5cells/ml，则用纯水对样品进行稀释，若小于 1 X 105cells/ml，则用离心法对样品进行浓缩，离心转速约2000rad/min，离心10_15min，以 达到理想浓度。
[0038] 对于样品中存在群体生长的浮游植物，如微囊藻、鱼腥藻、束丝藻等，可用超声波 细胞粉碎机，选择特定的功率、时间和超生频率，对浮游植物群体进行超声分散，使成为单 细胞分散状态，以便于进样分析。
[0039] 利用流式细胞仪筛选浮游植物
[0040] 以BD公司生产的FACS Verse型号流式细胞仪为例。取0.5-2ml经预处理的样 品，置于流式细胞仪中，选用488nm激光激发，Detectors/Amps(信号器/高压）窗口确认 FSC、SSC为LIN (线性放大），其他FL1-3为LOG (对数放大），在Threshold (阀值）窗口确 认FSC为设阀参数，初步确认预设阀值52, Compensation (荧光补偿）窗口中所有预设数值 皆为零。观察FSC-SSC、FSC-PerCP、FSC-PE、PerCP-PE等各二维散点图中的散点的位置，根 据样品上机情况调整各探测器电压，原则在于得到相互独立、离散的细胞族群，尽量不出现 族群、细胞碎片之间有重叠现象。
[0041] 在浮游植物细胞内，常含有叶绿素、藻红蛋白以及辅助色素等多种细胞色素，而它 们的荧光发射光谱相互重叠，因而流式细胞仪的每个光电倍增管实际检测到的都是两种或 几种荧光之和，只不过是以某一种物质的荧光为主。荧光补偿的作用就是使每一个荧光检 测器只检测一种物质的荧光，这样才能获得细胞内某一种色素含量（一种荧光强度）的准 确结果。
[0042] 本发明利用488nm激光激发出样品本身的两种自发荧光，即叶绿素a(PerCP通道 检测），藻红蛋白（PE通道检测），不存在绝对的阴性样本。因此在调荧光补偿时主要依照 "横平竖直"的原则，在PerCP-PE二维散点图中，通过调整FL2-% FL1，FL1-% FL2,将单阳 及双阳的类群调整至各自的区域。
[0043] 在上述条件下，设定储存细胞总数10000个（在计算机运算能力允许条件下，可适 当扩大细胞总数，以保证取样量和准确度），收集实验数据。在PerCP-FSC二维散点图中利 用逻辑门框选出含叶绿素a(PerCP检测呈阳性）的细胞，视为样品中的浮游植物，同时可以 得到它们在样品中所占的数量百分比。
[0044] 3)颗粒粒径Φ同前向角散射强度值（FSC)标准曲线绘制
[0045] 由于流式细胞仪的前向散色光（FSC)信号仅反应检测细胞的相对粒径，因此实验 需要利用标准粒径的焚光微球对细胞的绝对粒径进行标定。本发明选用美国Polyscience 公司生产的黄绿色荧光的标准微球，粒径分别为0. 5 μ m、l μ m、2 μ m、6 μ m，利用FITC通道 进行检测并收集数据。
[0046] 荧光微球标准液的制备：由于荧光微球标准液本身的浓度不同，需要采用高纯水 将标准液稀释至前述进样样品适宜的浓度范围（1X10 5~l〇〇Xl〇5cells/ml)，待测。
[0047] 分别取0. 5~1ml各种粒径的荧光微球标准液，保证步骤2的测试条件不变，在 FITC-FSC二维散点图中，不同粒径的荧光微球会各自聚成一团，找到并框选出它们，读取不 同粒径荧光微球的FSC均值及变异系数，拟合出荧光颗粒粒径Φ-FSC的回归曲线，获得拟 合函数关系，将该条件下的FSC信号强度转化为粒径值。
[0048] 4)浮游植物细胞粒径分布分析
[0049] 在步骤2)基础上，以FSC强度值为横坐标，筛选后浮游植物细胞样品计数情况 (counts)为纵坐标，在流式细胞仪分析软件上（仪器自带分析软件或其他常用分析软件， 如Flowjo)生成步骤2)筛选出的浮游植物细胞进样颗粒数量分布同FSC强度分布的峰变 化图。
[0050] 根据研究需要，将横坐标FSC值截分成若干区段（截分区段越细，则获得的细胞颗 粒粒径信息越丰富），确定每个区段FSC强度均值和对应的细胞计数均值，并根据步骤3) Φ-FSC曲线拟合函数，计算进样样品中细胞计数均值所对应的颗粒粒径，获得浮游植物粒 径分布情况。
[0051] 若所采用流式细胞仪及其配套软件能够自动提供进样颗粒的FSC值，则可直接在 步骤3) Φ-FSC曲线拟合函数基础上，直接换算每个进样浮游藻类细胞的粒径值，并获得浮 游植物细胞粒径分布情况与分布谱图。
[0052] 实施例2
[0053] 以某水库回水区浮游植物样本为例，根据本发明的方法对淡水样本中的浮游植物 颗粒粒径分布进行检测分析。操作过程及结果如下：
[0054] 1)由于采集的淡水样本浓度与实验要求的1X105~100X 10 5cells/ml相符，因 此直接将样本通过50 μ m筛絹后，上机测试。
[0055] 2)本实施例采用BD公司生产的FACS Verse型号流式细胞仪进行实验。取1ml经 预处理的样品，置于流式细胞仪中，按专利所述方法调整测试条件及荧光补偿后，设定储存 细胞总数10000个，收集实验数据。在PerCP-FSC二维散点图中利用逻辑门框选出含叶绿 素a(PerCP检测呈阳性）的细胞，得到筛选后的浮游植物群体见图2。
[0056] 3)实验选用美国Polyscience公司生产的黄绿色焚光的标准微球，粒径分别为 1 μ m、2 μ m、6 μ m，由于药品本身的浓度不同：1 μ m微球液浓度为1 X 10scells/ml、2 μ m微 球液浓度为1 X 107ce 11 s/ml、6 μ m微球液浓度为2 X 106ce 11 s/ml，为将药品浓度稀释至 4X105cells/ml，则需要将Ιμπι微球液由1滴（约40μ1)稀释至10ml，2ym微球液由1滴 (约40 μ 1)稀释至5ml，6 μm微球液由1滴（约40 μ 1)稀释至4滴。实验按上述配比制备 一定荧光微球标准液，取〇. 5ml，在相同测试条件下上机检测（图3)。
[0057] 实验得到不同粒径荧光微球的FSC值：427. 48，336，671，8917，拟合的颗粒粒径 Φ-FSC 标准曲线函数为：FSC = 345. 3 · Φ2-700. 9 · Φ+691. 6(R2= 1. 000, p < 0· 01，见 图4)。
[0058] 4)将流式细胞分析数据导入分析软件Flowjo. 7. 6. 1. Min中，在软件界面上，以 FSC强度值为横坐标，浮游植物细胞进样样品数量值为纵坐标，得到筛选出的浮游植物细胞 进样颗粒同FSC强度分布的峰变化图（FSC-Count图，见图5)。本实验将浮游植物细胞粒径 分为〈2. 5μπι、2. 5-8μπι、8-16μπι、>16μπι 4个粒径段，并依据步骤3)中FSC信号强度转化 的粒径值，则对应的 FSC 值为〈1097. 5,1097. 5-17183. 6,17183. 6-77874, >77874,反演至浮 游植物FSC-Count峰图中，截取对应的浮游植物细胞群（见图5)，读取该FSC强度范围内浮 游植物在总群体中所占的数量百分比，分别为6. 14%，51.49%，35. 24%，7. 13% (表1)。
[0059] 5)最终得到样本中浮游植物细胞粒径分级的结果见表1。
[0060] 表1浮游植物细胞粒径分布检测分析结果
[0061]
[0062] 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟 悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因 此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完 成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
【主权项】
1. 一种用于浮游植物粒径分布的检测分析方法，其特征在于， 采用流式细胞仪，对预处理后的待测样品进行检测，筛选出浮游植物细胞； 在相同测试条件下利用不同粒径的荧光微球拟合前向散色信号强度值（FSC)与颗粒 粒径值Φ的Φ-FSC标准曲线，获将FSC信号强度转化为粒径值的拟合函数； 生成筛选后浮游藻类细胞颗粒数量分布同FSC的峰图，根据拟合函数关系，确定浮游 植物细胞粒径分布。2. 根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于，待测样品的预处理，待测样品为 杂质较多的天然水体样品，采用50μπι筛絹过滤处理；待测样品为具有群体细胞的样品，进 行超声分散，使成为单细胞分散状态，以便于进样分析。3. 根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于，浮游植物细胞筛选，选择流式细 胞仪的488nm激光激发，调整测试条件，以PerCP、PE通道做双色荧光补偿，在PerCP-FSC二 维散点图中框选PerCP阳性细胞，含有叶绿素 a，得到浮游植物在样品中的数量百分比。4. 根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于，颗粒粒径值Φ同FSC信号的标 准曲线，以FITC通道检测标准粒径荧光微球的FSC强度均值，拟合出颗粒粒径Φ-FSC的标 准曲线，获得Φ-FSC曲线拟合函数，将该条件下的FSC信号强度转化为粒径值。5. 根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于，浮游藻类细胞颗粒数量分布同 FSC的峰图，以FSC强度值为横坐标，筛选后浮游藻类细胞样品计数情况（counts)为纵坐 标，生成筛选出的浮游植物细胞进样颗粒数量分布同FSC强度分布的峰变化图。6. 根据权利要求1所述的检测分析方法，其特征在于，浮游植物细胞粒径分布，在流式 细胞仪分析软件中，将横坐标FSC值截分成若干区段，确定每个区段FSC强度均值和对应的 浮游植物细胞计数均值，并在所述Φ-FSC曲线拟合函数基础上，计算进样样品中细胞计数 均值所对应的颗粒粒径，进而获得浮游植物细胞粒径分布情况。
【文档编号】G01N15/02GK105865988SQ201510033191
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2015年1月23日
【发明人】李哲, 肖艳, 陶思圆, 郭劲松, 张振
【申请人】中国科学院重庆绿色智能技术研究院