湖泊水生植物中有机磷提取及组成分析方法
【专利摘要】本发明公开了一种湖泊水生植物中有机磷提取方法，包括样品采集、磷的基本组成测定、有机磷(Po)的提取、样品测试预处理、液态核磁(31P?NMR)分析和计算步骤。本发明采用0.5mol/L NaOH+25mmol/L EDTA提取剂，水生植物粉末样品与提取剂的固液比为1：60获得最优的Po提取效果；31P?NMR分析测试过程中，设置延迟时间(D1)为5s，扫描分析时间为15h可获得较好的谱图。本发明的水生植物Po的提取方法，总磷(TP)和Po的平均提取率分别在91.4％和88.1％以上，能准确检测出样品中Po的具体种类和含量，准确的反映湖泊中水生植物的Po的组成结构特征。为研究湖泊水生植物中Po的生物地球化学特征及其在水华暴发中所起的贡献提供科学依据。
【专利说明】
湖泊水生植物中有机磷提取及组成分析方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种有机磷的提取及组成分析方法，特别是一种湖泊水生植物中有机 磷提取及组成分析方法。
【背景技术】
[0002] 磷是水生生态系统关键的限制性营养元素之一，是影响湖泊富营养化的重要因 素。外源输入和内源循环是导致湖泊水体磷大幅度增加的主要因素。近年来，包括生活污 水、工农业生产、土壤径流等过程携带的外源磷输入得到了一定的控制，湖泊内源磷的释放 成为引起湖泊水质进一步恶化的关键因素。沉积物释放是湖泊内源磷污染重要的来源之 一，但富营养化湖泊中广泛存在的水生植物，其死亡腐烂分解后的产物可能是湖泊内源磷 另一个重要的来源。例如，太湖是是中国第三大淡水湖，也是典型的富营养大型浅水湖泊， 位于30° 55' 40〃 ~31° 32' 58〃N，119° 52' 32〃 ~120° 36' 10〃E之间，水面面积为2250km2，湖泊 平均水深1.9m，最大水深2.6m。太湖东南部草型湖湾（东太湖)水体表面覆盖着高达东太湖 总面积70%以上的水生植物，这些水生植物死亡腐烂后如果不及时收割，其腐解后的有机 物将会进入水体，其中磷的释放率远高于碳和氮，半个月内磷的释放量就可高达70%，这些 营养元素的释放将会引起湖泊水体的二次污染，危害生态系统健康，进而引起一系列环境 问题。近年来，由于人类活动强度的增加，太湖水质不断恶化，水化学环境也发生了重大的 变化。2007年5月，太湖北部梅梁湾发生大规模水华事件;2008年，太湖北部竺山湾和西部沿 岸湖区发生"黑水团"事件;2009~2010年，监测数据表明太湖水华暴发期间产生大量危害 动植物健康的藻毒素。因此，针对湖泊水生植物来源磷的研究十分重要。有机磷(Organic P，P。）是水生植物中磷的重要组成部分，例如滇池水生植物中的P。可以占到其体内总磷 (Total P，TP)的50%以上。另外，已有研究表明P。在水生生态系统的磷循环中扮演重要角 色，一些P。组分可通过酶水解转化为生物可利用性活性磷酸盐，进而成为富营养化湖泊蓝 藻水华持续暴发的重要磷源。
[0003] 由于分析测试方法的限制，对湖泊水生植物中P。化学结构和形态等的研究还十分 有限，多数研究一般仅限于有机磷总量的分析。然而，自Newman [1]等将液相31P核磁共振 (31P-NMR)技术首次应用土壤提取液中磷的分析，该分析方法很大程度上提高了我们对环境 样品中P。组成结构和特征的认识。目前，该分析方法已成为表征环境中P。组成特征的强有力 工具，但是主要集中于土壤、沉积物及腐殖质等物质的研究。如文献CN101339133A公开了一 种钙质沉积物有机磷的提取及组成分析方法，其特征是先采用偏酸性的乙二胺四乙酸溶液 对沉积物进行冲洗并离心，再结合传统提取方法NaOH加乙二胺四乙酸(EDTA)混合溶液对沉 积物进行振荡提取并离心，然后取部分NaOH+EDTA提取液用光谱仪测定总磷，将剩余提取液 进行浓缩，最后用 31P核磁共振技术(31P_NMR)分析提取液中有机磷的组成。该发明公开的是 沉积物的提取方法，其缺点是提取率不高。CN104614331A公开了一种同时提取及分析水体 沉积物中有机磷和无机磷形态的方法解决现有磷形态提取法不能同时测定出水体沉积物 中有机磷和无机磷含量的问题。该发明的技术方案为:将水体沉积物样品与第一提取液混 合、离心并过滤后，得到第一残渣和第一磷提取液;将第一残渣与第二提取液混合、离心并 过滤后，得到第二残渣和第二磷提取液;将第二残渣与第三提取液混合、振荡、离心并过滤 后，得到第三残渣和第三磷提取液;将第三残渣与第四提取液混合、振荡、离心并过滤后，得 到第四残渣和第四磷提取液;将第四残渣灰化后与第五提取液混合、振荡、离心并过滤，得 到第五磷提取液。该发明能准确反映水体沉积物中各形态有机磷和无机磷含量。但关于湖 泊水生植物中有机磷提取及组成分析方法还鲜有报道，因此，对湖泊中的水生植物中有机 磷的提取及组分分析研究，这对探索湖泊水生植物P。在水华暴发过程中所做的贡献以及湖 泊内源磷循环及机理具有重要科学意义。
[0004] [1]Newman R,Tate K.Soil phosphorus characterization by 31P nuclear magnetic resonance[J].Communications in Soil Science&Plant Analysis,1980,11 (9):835-842.
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种湖泊水生植物中有机磷提取及组成分析方法，优化其 有机磷的提取方法和31p-nmr测定过程中的参数设置，并分析水生植物中磷的组成结构特 征。
[0006] 本发明的技术方案如下。
[0007] -种湖泊水生植物中有机磷提取方法，包括以下步骤：
[0008] (1)样品采集:采集湖泊水生植物全株，装入密封袋冷藏保存，运回实验室进行冷 冻干燥，冷干后充分研磨，过2_筛，得到水生植物粉末样品，-20°C冷冻保存备用；
[0009] (2)磷的基本组成测定:总磷TP、无机磷P4P有机磷P。的测定，
[0010] 取水生植物粉末样品两份，一份于马弗炉中煅烧，样品降至室温后加入HC1振荡， 呙心分尚后分析其中磷浓度，即TP含量；
[0011] 另一份样品置于离心管中，加入HC1振荡，离心后测定磷浓度，SPPi含量；
[0012]水生植物中P。的含量由TP和Pi相减得到；
[0013] (3)P。的提取：取水生植物粉末样品加入提取剂，室温下振荡、离心后，留取上清 液，冷冻干燥形成粉末样品，冷冻保存备用；
[0014] (4)样品测试预处理:将步骤⑶得到的粉末样品用NaOH溶解，离心，加入D20锁定 信号；
[0015] (5)31P-NMR分析：采用BRUKER标准腔5mm BB0探头，31P的共振频率为161.98Hz，测 定温度为20°C，谱峰宽度为5Hz，获取时间AQ为0.21028，匪1?参数中延迟时间01的设置为58， 分析测试时间为15h;
[0016] (6)计算:通过步骤(5)中得到的波谱进行积分及对各磷组分进行定性分析，并根 据步骤(2)得到的TP含量计算水生植物中各磷组分的含量。
[0017]优选的，所述TP的测定具体为:准确称取0.5g水生植物粉末样品一份，3个平行样， 于马弗炉中450°C煅烧3h，降至室温后转移至离心管中，加入20mL3.5mo 1/L HC1振荡16h，离 心分离后，上清液用0.45wii滤膜过滤得提取液，利用5 %过硫酸钾121°C消解30min，分析其 中磷浓度，即TP含量。
[0018]优选的，所述Pi的测定具体为:准确称取0.5g水生植物粉末样品一份，3个平行样， 置于离心管中，加入20mLlmol/L HC1振荡提取16h，离心分离后，上清液用0.45wii滤膜过滤 得提取液，测定磷浓度，即Pi含量。
[0019]优选的，所述了?和?1采用磷钼蓝法进行测定。
[0020] 优选的，所述(3)P。的提取具体为:取水生植物粉末样品0.5g加入提取剂，室温下 振荡提取16h，4°C条件下，8000Xg离心30min后留取上清液，冷冻干燥形成粉末样品，冷冻 保存备用。
[0021] 优选的，所述步骤（4)中NaOH为0.6mL 10mol/LNa0H;所述离心为8000Xg离心 151^11;所述〇2〇为0.21111。
[0022] 优选的，所述提取剂为〇.5mol/L Na0H+25mmol/L EDTA。
[0023] 优选的，所述步骤(3)中，水生植物粉末样品与提取剂的固液比为1:60。
[0024] 优选的，所述水生植物为狐尾藻、芦苇和轮叶黑藻。
[0025]分析得到，水生植物中磷由正磷酸盐、单酯磷、二酯磷以及焦磷酸盐组成，P。占 TP 的34.21%~53.36%，单酯磷为水生植物中P。重要组分，其平均含量占 P。的92%，易降解的 二酯磷在水生植物较少，占 TP的0~6.65%。
[0026] 本发明应用不同的提取剂和固液比提取湖泊水生植物中P。，并进一步采用液态核 磁共振(31P_NMR)技术分析其组成特征。在采用〇.5mol/L Na0H+25m mol/LEDTA提取剂，并控 制水生植物粉末样品与提取剂的固液比为1:60可获得最优的P。提取效果;31P-NMR分析测试 过程中，设置延迟时间D1为5s，扫描分析时间为15h可获得较好的谱图，出峰效果好。本发明 的的提取方法，不论是针对水生植物中的总磷还是P。，本发明的提取率均具有很高的提取 率，TP和P。的平均提取率分别在91.4%和88.1 %以上，能准确检测出样品中P。的具体种类和 含量，准确的反映水体中水生植物P。的情况。为研究水体中P。的组成结构特征及其生物地球 化学行为提供科学依据。
【附图说明】
[0027] 图1.本发明的提取方法对水生植物磷提取的31P-NMR图谱。
[0028]图2.湖泊水生植物TP与本发明NaOH+EDTA提取液TP关系。
[0029]其中，A厂狐尾藻，A2 -芦苇，A3 -轮叶黑藻。
【具体实施方式】
[0030]湖泊水生植物中有机磷提取方法，包括以下步骤：
[0031 ] (1)样品采集:采集水生植物全株，装入密封袋冷藏保存，所采集的样品冷冻干燥 后充分研磨，过2mm筛，得水生植物粉末样品，4°C冷藏保存备用；
[0032] (2)磷的基本组成测定:总磷TP、无机磷Pi和P。的测定，
[0033]准确称取0.5g水生植物粉末样品两份，每份3个平行样，一份于马弗炉中450°C煅 烧3h，降至室温后转移至离心管中，加入20mL3.5mol/L HC1振荡16h，离心分离后，上清液用 0.45M1滤膜过滤得提取液，利用5%过硫酸钾121°C消解30min，分析其中磷浓度，即TP含量； [0034]另一份样品置于离心管中，加入20mLlmol/L HC1振荡提取16h，离心分离后，上清 液用0.45mi滤膜过滤得提取液，测定磷浓度，SPPi含量；
[0035]由TP和Pi相减获得水生植物P。含量；
[0036] 采用磷钼蓝法在Agilent8453紫外分光光度计上测定TP和Pi;
[0037] (3)P。的提取:取水生植物粉末样品0.5g加入提取剂，室温下振荡提取16h，4°C条 件下，8000 X g离心30min后留取上清液，冷冻干燥形成粉末样品，冷冻保存备用；
[0038] (4)样品测试预处理:将步骤(3)得到的粉末样品用0.6mL 10m〇l/LNa0H重新溶解， 以8000 X g离心15min，加入0 ? 2mL D20锁定信号；
[0039] (5)31P-NMR分析:采用BRUKER标准腔5mm BB0探头，31P的共振频率为161.98Hz，测 定温度为20°C，谱峰宽度为5Hz，AQ为0.21028，匪1?参数中延迟时间01的设置为58，分析测试 时间为15h;
[0040] (6)计算:通过步骤(5)中得到的波谱进行积分及对各磷组分进行定性分析，并根 据步骤(2)得到的TP含量计算水生植物中各磷组分的含量。
[0041] 提取剂组成和提取比例对P。提取率影响的研究。表1列出实施例1 -15的所采用的 提取剂和提取比例，按上述步骤进行实验。实施例1-6水生植物的平均提取率见表2,实施例 7-15水生植物的提取率见表3。表4为实施例14水生植物中各个磷组分的含量及占 TP的百分 比。
[0042] 表1.实施例1-15所采用的提取剂和提取比例
[0044] 表2.实施例1-6水生植物的平均提取率
[0046] 表3.实施例7-15水生植物磷的提取率
[0049] 从表2可知，实施例1-3采用1: 30提取比例，提取剂分别为0.1，0.25和0.5mol/L NaOH，TP提取率分别为41.79%，48.27 %和49.18%，P。提取率分别为34.38%，42.60 %和 47.62%。表明采用0.25mol/L和0.5mol/L NaOH作为提取剂，TP和P。提取率明显高于 0?lmol/L〇
[0050] 实施例4-6采用1:60提取比例，提取剂分别为0.1，0.25，0.5mol/L NaOH，则TP提取 率分别高于1:30提取比例下的TP提取率，P。提取率也分别高于于1:30提取比例下的P。提取 率。尤其，实施例5-6的TP提取率明显高于实施例2-3的TP提取率，实施例5-6的P。提取率明 显高于实施例2-3的P。提取率。
[0051 ]另外，固液比为1:30的提取比例会导致提取液过于黏稠，固液分离效果差，当提取 比例为1:70，1:100时，稀释倍数过大导致样品浓度过低，提取效果不好，而提取比例为1:60 时，提取液既能充分与样品粉末融合又不会过于黏稠且易分离，提取率更高，这表明采用固 液比为1:60的提取比例更适合磷组分的提取。因此，湖泊水生植物P。的提取固液比例为1: 60 〇
[0052]另外，从表3可知，实施例7-9表明NaOH与EDTA作为提取剂对水生植物的TP和P。的 提取率明显高于NaOH单独作为提取剂对水生植物TP和P。的提取率。
[0053] 进一步地，实施例10-15表明，当提取剂为0.5mol/L Na0H+25mmol/L EDTA时，水体 中水生植物的TP和P。的提取率最高，分别高达91.4%和88.1 %。
[0054] 如图1所示，采用本发明的提取方法，得到水生植物中磷组分的组成特征，表明水 生植物由正磷酸盐、单酯磷、二酯磷以及焦磷酸盐组成，其中，P。以单酯磷为主要组成部分。
[0055] 表4.实施例14水生植物中各个磷组分的含量(mg/kg)及占总磷的百分比（％ )
[0057] 从表4中可以得出，水生植物Pi占 TP的46.64%~65.79%，P。可达TP总量的34.21% ~53.36 %。其中，水生植物中单酯磷占 TP的31.05%~49.74%，平均含量占 P。的92%。因 此，单酯磷是水生植物中P。的主要组分。焦磷酸盐占水生植物TP的0.91 %~2.08%。
[0058] 如图2所示，采用本发明的方法对水生植物中TP和P。进行提取，NaOH-EDTA提取液 中的TP和水生植物中的TP呈线性关系（R2 = 0.997，P〈0.01)。这表明本发明的提取方法结 合31P-NMR表征可以反映样品的实际情况，进而探讨湖泊水生植物中P。的分布和变化规律。 NaOH-EDTA可提取植物样品中TP的提取率可达82.9%至98.2 %，平均为91.4%。研究结果表 明本发明的方法所用提取液、提取比例以及适合的测试参数后，液态31P_NMR技术可以有效 且可靠的分析湖泊水生植物P。，对于后续研究富营养化湖泊水生植物P。的动力学过程和生 物可利用性有重要意义。
[0059]以上对本发明实施例所提供的湖泊水生植物中有机磷提取及组成分析方法，进行 了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例 的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员， 依据本发明的思想，在【具体实施方式】及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内 容不应理解为对本发明的限制。
【主权项】
1. 一种湖泊水生植物中有机磷提取方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 样品采集:采集湖泊水生植物全株，装入密封袋冷藏保存，运回实验室进行冷冻干 燥，冷干后充分研磨，过2_筛，得到水生植物粉末样品，-20°c冷冻保存备用； (2) 磷的基本组成测定:总磷TP、无机磷PjP有机磷P。的测定， 取水生植物粉末样品两份，一份于马弗炉中煅烧，样品降至室温后加入HCl振荡，离心 分离后分析其中磷浓度，即TP含量； 另一份样品置于离心管中，加入HCl振荡，离心后测定磷浓度，SPP1含量； 水生植物中P。的含量由TP和Pi相减得到； (3) P。的提取:取水生植物粉末样品加入提取剂，室温下振荡、离心后，留取上清液，冷冻 干燥形成粉末样品，冷冻保存备用； (4) 样品测试预处理:将步骤(3)得到的粉末样品用NaOH溶解，离心，加入D2O锁定信号； (5) 31P-NMR分析:采用BRUKER标准腔5mm BBO探头，31P的共振频率为161.98Hz，测定温度 为20°C，谱峰宽度为5Hz，获取时间AQ为0.2102s，NMR参数中延迟时间Dl的设置为5s，分析测 试时间为15h; (6) 计算:通过步骤(5)中得到的波谱进行积分及对各磷组分进行定性分析，并根据步 骤(2)得到的TP含量计算水生植物中各磷组分的含量。2. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述TP的测定具体为:准确称取0.5g 水生植物粉末样品一份，3个平行样，于马弗炉中450°C煅烧3h，降至室温后转移至离心管 中，加入20mL3.5mol/L HCl振荡16h，离心分离后，上清液用0.45μπι滤膜过滤得提取液，利用 5 %过硫酸钾121°C消解30min，分析其中磷浓度，即TP含量。3. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述P1的测定具体为:准确称取0.5g水 生植物粉末样品一份，3个平行样，置于离心管中，加入20mLlmol/L HCl振荡提取16h，离心 分离后，上清液用0.45μπι滤膜过滤得提取液，测定磷浓度，SPP1含量。4. 根据权利要求1-3任一权利要求所述的提取方法，其特征在于，所述TP和?1采用磷钼 蓝法进行测定。5. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(3)Ρ。的提取具体为:取水生 植物粉末样品0.5g加入提取剂，室温下振荡提取16h，4°C条件下，8000 X g离心30min后留取 上清液，冷冻干燥形成粉末样品，冷冻保存备用。6. 根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(4)中NaOH为0.6mL IOmol/ LNaOH;所述离心为8000 X g离心15min;所述D2O为0.2ml。7. 根据权利要求1或5或6所述的提取方法，其特征在于，所述提取剂为0.5mol/LNa0H+ 25mmol/L EDTA08. 根据权利要求1或5或6所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中，水生植物粉末 样品与提取剂的固液比为1:60。9. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述水生植物为狐尾藻、芦苇和轮叶 黑藻。10. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，分析得到，水生植物中磷由正磷酸 盐、单酯磷、二酯磷以及焦磷酸盐组成，P。占 TP的34.21%~53.36%，单酯磷为水生植物中P。 重要组分，其平均含量占 P。的92%，易降解的二酯磷在水生植物较少，占 TP的0~6.65 %。
【文档编号】G01N21/33GK105928964SQ201610289392
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年5月4日
【发明人】冯伟莹, 吴丰昌, 朱元荣, 张琛
【申请人】中国环境科学研究院