一种烫骨碎补配方颗粒特征图谱及其建立方法
【专利摘要】本发明涉及药物分析技术领域，具体为一种烫骨碎补配方颗粒特征图谱及其建立方法。该特征图谱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以0.1 v/v％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为290nm；柱温为20℃；流速为每分钟1.0ml。理论板数按柚皮苷峰计算应不低于50000。供试品特征图谱中应呈现6个特征峰，其相对保留时间应在规定值的±5％之内。规定值为：0.299（峰1）、0.446（峰2）、0.557（峰3）、0.579（峰4）、0.911（峰5）、1.00（峰6）。本方法根据配方颗粒的特点，加强专属性鉴别和多成分、整体质量控制，特建立了该品种的特征图谱，进行全面质量控制。
【专利说明】
一种烫骨碎补配方颗粒特征图谱及其建立方法
技术领域
[0001] 本发明涉及药物分析技术领域，具体为一种烫骨碎补配方颗粒特征图谱及其建立 方法。
【背景技术】
[0002] 骨碎补，为水龙骨科植物槲蕨的干燥根茎，疗伤止痛，补肾强骨，外用消风祛斑，该 药材及其饮片的质量标准收载于《中国药典》2015年版一部。然而，关于烫骨碎补配方颗粒 却缺乏相应的质量标准。
[0003] 目前，公开关于烫骨碎补配方颗粒的测定方法的有《烫骨碎补配方颗粒的提取工 艺优选及其含量测定》，其采用HPLC测定柚皮苷含量，流动相甲醇-乙酸-水(35:4:65 )，检测 波长283nm。结果:最佳提取工艺为浸泡0.5h，加10，8倍量水提取2次，每次0.5h;柚皮苷质量 分数0.77 %，出膏率12.6 %。柚皮苷在0.063-1.575yg与峰面积呈良好线性关系，平均加样 回收率100.70%，RSD 1.2%;暂定本品配方颗粒每lg含柚皮苷彡5.Omg。结论:该提取工艺 和含量测定方法稳定可行，有效成分提取效率高，为烫骨碎补配方颗粒的生产和质量控制 提供参考。但是，该文献是烫骨碎补配方颗粒的提取工艺及含量测定，其含量测定部分仅仅 测定柚皮苷的含量，没有对其他成分进行控制，仅仅对其中的某一个成分进行含量测定，专 属性不强。
【发明内容】
[0004] 本发明正是针对以上技术问题，提供一种烫骨碎补配方颗粒特征图谱及其建立 方法，该方法根据配方颗粒的特点，加强专属性鉴别和多成分、整体质量控制，建立了该品 种的特征图谱，进行全面质量控制。
[0005] 本发明的具体技术方案如下：
[0006] -种烫骨碎补配方颗粒特征图谱的建立方法，包括以下步骤：
[0007] 参照物溶液的制备取5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、柚皮苷对照品适量，加甲醇制成每 lml分别含20yg、80yg、60yg的溶液，即得参照物溶液；
[0008] 供试品溶液的制备取烫骨碎补配方颗粒适量，研细，取0.2g，精密称定，置具塞锥 形瓶中，加入甲醇50ml，密塞，称定重量，加热回流40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减 失的重量，摇匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液；
[0009] 测定分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各lOiil，注入液相色谱仪，按照高效 液相色谱法测定，记录色谱图，即得烫骨碎补配方颗粒特征图谱；
[0010] 其中色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以0. lv/ v%磷酸溶液为流动相B，按规定进行梯度洗脱，检测波长为290nm;柱温为20°C ;流速为每分 钟1?0ml。
[0011] 所述的按规定进行梯度洗脱的条件为：
[0012] O-lOmin，流动相A的体积百分比为2%-15%，流动相B的体积百分比为98%-89% ; 10-15min，流动相A的体积百分比为15%，流动相B的体积百分比为85% ; 15-27min，流动相A 的体积百分比为15%-27%，流动相B的体积百分比为85%-73% ;27-35min，流动相A的体积 百分比为27%-40%，流动相B的体积百分比为73%-60% ; 35-50min，流动相A的体积百分比 为40 %-50 %，流动相B的体积百分比为60 %-50 %。
[0013]烫骨碎补配方颗粒特征图谱，该特征图谱中呈现6个特征峰，其中3个峰应分别与 相应的参照物峰保留时间相同，与柚皮苷参照物峰相应的峰为S峰，计算特征峰与峰6的相 对保留时间，其相对保留时间应在规定值的± 5 %之内。规定值为:峰1，0.299、峰2，0.446、 峰3,0.557、峰4,0.579、峰5,0.911、峰6，1.00。
[0014]本发明的积极效果体现在：
[0015] ( -）、根据配方颗粒的特点，加强专属性鉴别和多成分、整体质量控制，建立了该 品种的特征图谱，进行全面质量控制，
[0016] (二）、烫骨碎补配方颗粒为中药饮片的延伸形式，失去了饮片所特有的性状及显 微特性，本发明提供烫骨碎补配方颗粒整体化学成分的鉴别，专属性强。
【附图说明】
[0017] 图1为实施方式中的对照特征图谱;其中，峰1为5-羟甲基糠醛，峰2为原儿茶酸，峰 6(S)为柚皮苷。
[0018] 图2为实施例1中波长的选择特征图谱。
[0019 ]图3为实施例1中柱温的选择特征图谱。
[0020] 图4为烫骨碎补配方颗粒流动相考察特征图谱。
[0021] 图5为烫骨碎补配方颗粒色谱峰指认特征图谱。
[0022] 图6为烫骨碎补配方颗粒色谱柱的考察特征图谱。
[0023]图7为实施例中7批烫骨碎补配方颗粒特征图谱。
【具体实施方式】
[0024]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合【具体实施方式】对 本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施 例。
[0025]照高效液相色谱法(《中国药典》2015年版一部附录VI D)测定，其中峰6即峰S。
[0026] 烫骨碎补配方颗粒特征图谱的建立方法：
[0027] 参照物溶液的制备取5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、柚皮苷对照品适量，加甲醇制成 每lml分别含20yg、80yg、60yg的溶液，即得参照物溶液。
[0028] 供试品溶液的制备取本品适量，研细，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密 加入甲醇50ml，密塞，称定重量，加热回流40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重 量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
[0029] 测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各lOiil，注入液相色谱仪，测定， 记录色谱图，即得烫骨碎补配方颗粒特征图谱；
[0030] 其中色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶（菲罗门Luna C18(2)100A4.6X 250mm，5Mi)为填充剂；以甲醇为流动相A，以O.lv/v%磷酸溶液为流动相B，按规定进行梯度 洗脱，检测波长为290nm;柱温为20°C;流速为每分钟1.0ml，理论板数按柚皮苷峰计算应不 低于50000。
[0031]其中按规定进行梯度洗脱的条件为：
[0032] 0-10min，流动相A的体积百分比为2%-15%，流动相B的体积百分比为98%-89% ; 10-15min，流动相A的体积百分比为15%，流动相B的体积百分比为85% ; 15-27min，流动相A 的体积百分比为15%-27%，流动相B的体积百分比为85%-73% ;27-35min，流动相A的体积 百分比为27%-40%，流动相B的体积百分比为73%-60% ; 35-50min，流动相A的体积百分比 为40 %-50 %，流动相B的体积百分比为60 %-50 %。
[0033]供试品特征图谱中应呈现6个特征峰，其中3个峰应分别与相应的参照物峰保留时 间相同，与柚皮苷参照物峰相应的峰为S峰，计算特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留 时间应在规定值的±5%之内。规定值为:0.299(峰1)、0.446(峰2)、0.557(峰3)、0.579(峰 4)、0.911 (峰5)、1.00(峰6，也为峰S)，具体对照特征图谱见图1，该烫骨碎补配方颗粒的液 相特征图谱的建立，可作为烫骨碎补配方颗粒的整体质量控制方法。
[0034] 实施例1:
[0035] 1、材料、试剂与仪器
[0036] 1.1实验仪器
[0037] Agilent 1200series 高效液相色谱仪；
[0038] 色谱柱:菲罗门luna 5u C18(2)4.6*250mm(方法学考察）
[0039] 1.2试剂及试药
[0040] 甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
[00411 柚皮苷（中国药品生物制品检定所110722-201312,含量为94.7%)，5_羟甲基糠醛 (中国药品生物制品检定所111626-201509,含量为97.8%)，原儿茶酸（中检所110809-200604)，
[0042]烫骨碎补配方颗粒(批号：新绿色 1501087、1403058、1408098、1404042、1509078、 1404172^1409058)
[0043] 2、供试品溶液的制备
[0044] 照实施方式中供试品溶液的制备方法将以上批号的烫骨碎补配方颗粒制备成供 本实施例检测的供试品溶液。
[0045] 3、色谱条件与系统适用性试验
[0046] 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(菲罗门Luna C18(2)100A 4.6X250mm，5_); 以甲醇为流动相A，以O.lv/v%磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱;检测波 长为290nm;柱温为20 °C;流速为每分钟1.0ml。理论板数按柚皮苷峰计算应不低于50000。流 动性梯度洗脱表见表1。
[0047] 表1流动性梯度洗脱表
[0048]
[0050] 3.1波长选择：比较了检测波长 283nm、263nm、254nm、290nm、300nm、330nm、220nnTf 的色谱峰，而在290nm下的色谱峰分数较多且各峰之间的分离度较好，信息量大，基线平稳， 故检测波长确定为290nm，见图2 〇
[0051 ] 3.2柱温考察：比较了20°C，25°C，30°C的色谱图，结果显示20°C的色谱峰峰形最为 对称，分离度最好，故柱温确定为20°C，见图3。
[0052] 3.3流动相选择:本实验考察了3种不同流动相的分离效果，分别为：1:甲醇-水-醋 酸梯度洗脱(药典方法）；II:乙腈-0.1 % v/V磷酸梯度洗脱；m:甲醇-0. lv/v%磷酸梯度洗 脱。结果表明：
[0053] 流动相III分离条件下色谱峰多，且理论板数、分离度、对称性均更好，故将流动相 III作为烫骨碎补配方颗粒特征图谱测定方法的流动相。结果如图4。
[0054] 4、色谱峰的指认
[0055] 采用柚皮苷、5-羟甲基糠醛、原儿茶酸等对照品进行定位，结果表明：峰1为5-羟甲 基糠醛，峰2为原儿茶酸，峰6为柚皮苷。见图5。
[0056] 5、方法学考察
[0057] 5.1进样精密度试验
[0058] 取烫骨碎补配方颗粒(批号：1501087)供试品溶液，连续进样6次，每次10yl，以峰1 (5-羟甲基糠醛）、峰2(原儿茶酸）、峰3、峰4、峰5作为指标峰，计算同峰6(S)(柚皮苷)的相对 保留时间及相对峰面积，结果相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于2.0%，表明该方法 进样精密度良好。见表2和表3。
[0059] 表2进样精密度考察-特征峰相对保留时间比值
[0060]
[0062] 表3进样精密度考察一特征峰相对峰面积比值[0063]
[0064] 5.2重复性考察
[0065]精密称取烫骨碎补配方颗粒（批号为1501087)6份，按照拟定方法进行制备及测 定，结果各指标特征峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于2.0%，表明该方法重复 性好。见表4和表5。
[0066] 表4重复性考察-特征峰相对保留时间比值
[0068] 表5重复性考察-特征峰相对峰面积比值
[0069]
[0070] 5.3溶液稳定性考察
[0071 ]取同一供试品溶液，分别于0，2，5，8，，15，24h测定，对其中的特征峰进行分析，其 相对应的色谱峰相对保留时间均小于2.0%，特征峰的相对峰面积的RSD均小于2.0%，结果 表明供试品溶液在24h内稳定。见表6和表7.
[0072]表6稳定性考察一特征峰相对保留时间
[0074] 表7稳定性考察一特征峰相对峰面积比值
[0075]
[0076] 5.4耐用性考察
[0077] 5.4.1色谱柱耐用性采用不同品牌和长度的C18色谱柱按照拟定的方法对本品进 行特征图谱检测，结果部分特征峰的相对保留时间超出规定范围，结果表明本方法对不同 品牌及长度色谱柱的耐用性较差，因此应固定色谱柱进行测定。最终标准正文中固定菲罗 门luna 5u C18(2)4.6*250mm这一品牌色谱柱进行检测，见图6。
[0078] 6、特征峰的确定及对照图谱的建立
[0079] 采用拟定的方法对本品7批样品进行特征图谱的测定，根据相对保留时间稳定及 各企业各批次样品均能检出且峰相对较高的原则，共选择了 5个重复性较好的峰作为特征 峰。最终规定:供试品特征图谱中应呈现5个特征峰，其中2个峰应分别与相应的参照物峰保 留时间相同，与柚皮苷参照物峰相应的峰为S峰，计算特征峰与S峰的相对保留时间，其相对 保留时间应在规定值的±5%之内。规定值为:0.446(峰1)、0.557(峰2)、0.579(峰3)、0.911 (峰 4)、1.00(峰 6)。见表 8.
[0080] 表8 7批烫骨碎补配方颗粒相对保留时间
[0081]
[0082] 采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版)对7批样品进行合成，建立了烫 骨碎补配方颗粒特征图谱的对照图谱，见图7。
[0083] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。 对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的 一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明 将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一 致的最宽的范围。
【主权项】
1. 一种烫骨碎补配方颗粒特征图谱的建立方法，其特征在于包括以下步骤： 参照物溶液的制备取5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、柚皮苷对照品适量，加甲醇制成每lml 分别含20yg、80yg、60yg的溶液，即得参照物溶液； 供试品溶液的制备取烫骨碎补配方颗粒适量，研细，取〇. 2g，精密称定，置具塞锥形瓶 中，加入甲醇50ml，密塞，称定重量，加热回流40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的 重量，摇匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液； 测定分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各1〇μ1，注入液相色谱仪，按照高效液相 色谱法测定，记录色谱图，即得烫骨碎补配方颗粒特征图谱； 其中色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相A，以0.1 v/v% 磷酸溶液为流动相Β，按规定进行梯度洗脱，检测波长为290nm;柱温为20°C ;流速为每分钟 1.0ml〇2. 根据权利要求1所述烫骨碎补配方颗粒特征图谱的建立方法，其特征在于所述的按 规定进行梯度洗脱的条件为： 0-10min，流动相A的体积百分比为2%-15%，流动相B的体积百分比为98%-89%; 10-15min，流动相A的体积百分比为15%，流动相B的体积百分比为85%; 15-27min，流动相A的体积百分比为15%-27%，流动相B的体积百分比为85%-73%; 27-35min，流动相A的体积百分比为27%-40%，流动相B的体积百分比为73%-60%; 35-50min，流动相A的体积百分比为40%-50%，流动相B的体积百分比为60%-50%。3. 根据权利要求1所述烫骨碎补配方颗粒特征图谱的建立方法建立的特征图谱，其特 征在于： 特征图谱中呈现6个特征峰，其中3个峰应分别与相应的参照物峰保留时间相同，与柚 皮苷参照物峰相应的峰为S峰，计算特征峰与峰6的相对保留时间，其相对保留时间应在规 定值的 ±5%之内，规定值为：峰1，0.299、峰2,0.446、峰3,0.557、峰4,0.579、峰5,0.911、 峰6,1.00。
【文档编号】G01N30/02GK106053658SQ201610514569
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月29日
【发明人】周厚成, 胡昌江, 周维, 李文兵, 冯健
【申请人】四川新绿色药业科技发展股份有限公司