可用于检测喉癌的标志物及其用图

可用于检测喉癌的标志物及其用图
【专利摘要】本发明提供一种用于确定受试者是否具有或将发展喉癌的标志物，其包括：肌酸、1,3?二氨基丙烷、胸腺嘧啶、3?氨基异丁酸、胞苷酸和腐胺中的一种或多种，诊断灵敏度可达93.33％，特异度为0％。
【专利说明】
可用于检测喉癌的标志物及其用途
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种喉癌标志物，特别地，进一步具体涉及G01N33/68。
【背景技术】
[0002] 近年来，由于环境等多种不同致癌因素的共同作用，喉癌的发病率呈逐渐上升的 趋势。尽管以外科手术为主的综合治疗措施取得较大进展，但是喉癌患者综合治疗后的5年 生存率仍无明显的提高。尽管如此，临床大量数据表明，治疗的早晚对患者预后产生重要的 影响。然而，喉癌因其发生部位比较隐蔽，早期往往无明显症状，早期诊断困难，目前尚没有 可靠的用于早期诊断的特异性指标，因此，临床上亟待寻找喉癌及下咽癌相关的特异性肿 瘤标志物以辅助早期诊断。
[0003] 既往国外研究是将头颈癌（除眼、脑、耳、甲状腺和食道外头颈部任何组织或器官 的肿瘤)作为一个整体进行研究，未对每种头颈癌进行分类研究，研究指标缺乏特异性。国、 内外大多研究未进行肿瘤病理分型，也未进行分级和分期，未对治疗前后疗效判断的对比 研究，尚缺乏对预后判断的指标。目前为止，国内外对喉癌及下咽癌的代谢组学研究报道较 少，尚没有可供用喉癌早期诊断、治疗及预后监测的特异性标志物应用于临床。

【发明内容】

[0004] 针对上述问题，本发明提供用于确定受试者是否具有或将发展喉癌的标志物，其 包括:肌酸、1，3_二氨基丙烷、胸腺嘧啶、3-氨基异丁酸、胞苷酸和腐胺中的一种或多种。
[0005] 本发明的一方面提供用于确定受试者是否具有或将发展喉癌的方法，所述方法包 括：
[0006] 在受试者的样品中测定上述一种或多种标志物的水平；
[0007] 将受试者样品中的一种或多种标志物的水平与对照样品中的一种或多种标志物 的水平相比较，其中与对照样品中的一种或多种标志物的水平相比，受试者样品中的一种 或多种标志物的水平的差异指示所述受试者具有或将发展喉癌。
[0008] 本发明的另一方面提供用于确定具有喉癌的受试者是否将对疗法有反应的方法， 所述方法包括
[0009] 在受试者的样品中测定上述一种或多种标志物的水平；
[0010] 将受试者样品中的一种或多种标志物的水平与对照样品中的一种或多种标志物 的水平相比较，其中与对照样品中的一种或多种标志物的水平相比，受试者样品中的一种 或多种标志物的水平的差异指示所述受试者将对所述疗法有反应。
[0011] 本发明的另一方面提供用于确定受试者是否具有或将喉癌的试剂盒，所述试剂盒 包括用于在受试者样品中上述一种或多种标志物的水平的试剂和确定受试者是否具有或 将发展喉癌的试剂盒使用说明书。
[0012] 本发明的另一方面提供用于确定具有喉癌的受试者是否将对治疗有反应的试剂 盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中上述一种或多种标志物的水平的试剂和确定受试 者是否将对所述治疗有反应的试剂盒使用说明书。
[0013] 本发明的另一方面提供用于确定受试者是否具有或将发展喉癌的方法，所述方法 包括：
[0014] 测定在受试者样品中的所述肌酸的水平；
[0015] 将受试者样品中的肌酸的水平与对照样品中的肌酸的水平相比较，其中受试者样 品中的肌酸的水平高于对照样品中的肌酸的水平，指示所述受试者具有或将发展喉癌。
[0016] 本发明的另一方面提供用于确定具有喉癌的受试者是否将对治疗有反应的方法， 所述方法包括：
[0017] 测定在受试者样品中的肌酸的水平；
[0018] 将受试者样品中的肌酸的水平与对照样品中肌酸的水平相比较，其中受试者样品 中的肌酸的水平高于对照样品中的肌酸的水平，指示所述受试者将对所述治疗有反应。
[0019] 本发明的另一方面提供在具有喉癌的受试者中监测治疗的功效的方法，所述方法 包括：
[0020] 在给予受试者所述治疗的至少一部分之前和之后，测定在受试者样品中的肌酸的 水平;和
[0021] 将在给予所述治疗之前来自受试者样品中的肌酸的水平与在给予所述治疗的至 少一部分之后来自受试者样品中的肌酸的水平相比较，其中与在给予所述治疗之前的样品 中的肌酸的水平相比，在给予所述治疗的至少一部分之后的样品中的肌酸的水平降低表明 所述受试者对所述治疗有反应，从而监测所述治疗的功效。
[0022] 作为一种实施方式，进一步包括测定在受试者样品中上述的一种或多种另外的标 志物的水平。
[0023] 本发明的另一方面提供用于鉴定喉癌标志物的方法，所述方法包括：
[0024] 在稳定状态条件下，鉴定来自两个或更多个物种的两种或更多种的血液，从而产 生标志物的临时列表；
[0025]在功能障碍条件下鉴定临时列表中标志物，在正常条件下鉴定临时列表中标志 物，
[0026] 测定试验样品和对照样品的样品中的标志物的水平，其中与试验样品中的水平相 比，对照样品中标志物的水平的差异鉴定所述标志物为喉癌标志物；
[0027] 其中试验样品来自具有喉癌的受试者；
[0028]其中对照样品来自具有正常的受试者。
[0029] 附图简述
[0030]图1:实施例1，以肌酸为标志物时的R0C图；
[0031]图2:实施例10,以肌酸和腐胺为标志物时的R0C图；
[0032]图3:实施例20,以胸腺嘧啶和胞苷酸为标志物时的R0C图；
[0033]图4:实施例30,以肌酸、胸腺嘧啶和胞苷酸为标志物时的R0C图；
[0034]图5:实施例40,以3-氨基异丁酸、腐胺和胞苷酸为标志物时的R0C图；
[0035]图6:实施例53，以1，3-二氨基丙烷、3-氨基异丁酸、胸腺嘧啶和胞苷酸为标志物时 的R0C图；
[0036]图7:实施例62,以1，3_二氨基丙烷、3-氨基异丁酸、胸腺嘧啶、腐胺和胞苷酸为标 志物时的ROC图；
【具体实施方式】
[0037] 本发明至少部分地基于与喉癌的发展相关的和具有喉癌的受试者对治疗的反应 相关的标志物的发现。因此，本发明通过测量和鉴定特定的标志物或特定的标志物组合，提 供用于预测受试者是否具有或将发展喉癌的方法和试剂盒，以及用于鉴定可减缓喉癌的进 展的化合物的方法，监测某一疗法在减低受试者的喉癌的进展中的功效的方法。
[0038] 因此，在一个方面，本发明提供用于确定受试者是否具有或将发展喉癌的标志物： 肌酸、1，3_二氨基丙烷、胸腺嘧啶、3-氨基异丁酸、胞苷酸、腐胺。
[0039] 在另一方面，本发明提供用于抑制受试者的喉癌的发展的方法。所述方法包括给 予所述受试者有效量的试剂，所述试剂调节本发明的任何一种或多种标志物的表达和/或 活性，从而抑制受试者的喉癌的发展。
[0040] 在一个实施方案中，受试者样品中的水平通过质谱法测定。在一个实施方案中，所 述质谱法是基质辅助的激光解吸/飞行时间(MALDI/T0F)质谱法、液相色谱四重离子捕获电 喷射(LCQ-MS)或表面增强激光解吸电离/飞行时间（SELDI/T0F)质谱法。
[0041] 在另一个实施方案中，受试者样品中的水平通过免疫测定法测定。
[0042] 受试者的样品可以是流体样品或组织样品。
[0043] 在一个实施方案中，所述标志物的水平是标志物的表达水平和/或活性。
[0044] 在一个实施方案中，所述受试者具有发展喉癌的风险。
[0045] 在一个方面，本发明提供用于确定受试者是否具有或将发展喉癌的试剂盒，所述 试剂盒包括用于在受试者样品中上述的一种或多种标志物的水平的试剂和确定受试者是 否具有或将发展喉癌的试剂盒使用说明书。
[0046] 在另一方面，本发明提供用于确定具有喉癌的受试者是否将对治疗有反应的试剂 盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中测定上述中的一种或多种标志物的水平的试剂和 确定受试者是否将对所述治疗有反应的试剂盒使用说明书。
[0047] 在又一方面，本发明提供在具有喉癌的受试者中监测治疗的功效的试剂盒。所述 试剂盒包括用于测定受试者样品中的一种或多种标志物的水平的试剂，和监测所述治疗的 功效的试剂盒使用说明书。
[0048] 在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包括用于从受试者获得样品的试剂。
[0049] 在一个实施方案中，所述试剂盒进一步包括对照样品。
[0050] 在一个方面，本发明提供用于鉴定喉癌标志物的方法，所述方法包括：
[00511在稳定状态条件下，鉴定来自两个或更多物种的两种或更多种的血液，从而产生 标志物的临时列表；
[0052]在功能障碍条件下鉴定临时列表中标志物；
[0053]在正常条件下鉴定临时列表中标志物；
[0054] 测定试验样品和对照样品的样品中的标志物的水平，其中与试验样品中的水平相 比，对照样品中标志物的水平的差异鉴定所述标志物为喉癌标志物；
[0055] 其中试验样品来自具有喉癌的受试者；
[0056] 其中对照样品来自健康人的受试者。
[0057] 本发明的各个方面更详细地描述于以下节段中：
[0058] 定义
[0059] 如本文所用，以下术语的每一个具有与其在本部分中相关的含义。
[0060] 冠词〃一个〃和〃一种〃在本文用于指该冠词的一个或超过一个（即至少一个）的语 法对象。例如，"要素"意指一个要素或超过一个要素。
[0061] "标志物"或"生物标志物"是与另一种表型状态(例如未患有疾病)相比，在取自一 种表型状态(例如患有疾病）的受试者的样品中差别存在的有机生物分子。如果在不同组中 生物标志物的平均或中位水平、例如表达水平经计算为统计学显著的，则生物标志物在不 同的表型状态中差别存在。统计学显著性的常见检验特别包括t-检验）漏￥六、&1^1?11-Wallis、Wilcoxon、Mann_Whitney和优势比。单独或组合的生物标志物提供受试者属于一种 表型状态或另一种表型状态的相对风险的度量。因此，它们用作标志物，例如，用于疾病(预 后和诊断）、药物的治疗功效(治疗诊断学)和药物毒性的标志物。
[0062] 在一些实施方案中，用于本发明的组合物和方法的标志物的准确性可通过接收器 工作特征曲线（"R0C曲线"）来表征。R0C是对于诊断标志物的不同可能的割点的真阳性率相 对假阳性率的曲线。R0C曲线显示灵敏性和特异性之间的关系。即是说，灵敏性的增加将伴 随特异性的降低。曲线越靠近R0C空间的左轴，然后顶缘，标志物越准确。相反地，曲线越靠 近R0C图的45度对角线，标志物越不准确。R0C下的面积是标志物准确性的度量。标志物的准 确性取决于标志物如何适当地将待测试的组分成具有所述疾病的组和不具有所述疾病的 组。曲线下面积(称为"AUC"）为1表示完美的标志物，而面积为0.5表示有用性较差的标志 物。因此，在一些实施方案中，本发明的生物标志物和方法的AUC大于约0.50、大于约0.60或 大于约0.70。
[0063] "喉癌"：主要分为原位癌、鳞状细胞癌、疣状癌、腺癌。
[0064] 原位癌的病变多发生在声带和室带，局部变化较轻，可见黏膜充血、水肿、增厚，有 时可出现角化、白斑。镜下可见非典型细胞浸润、分化不良的鳞状细胞。
[0065] 鳞状细胞癌:此类型喉癌表现为菜花型、浸润型和溃疡型。声门下区癌多属于浸润 型，声门区癌分化程度较高，声门上区癌分化程度较低者多见。
[0066] 疣状癌:疣状癌是高分化鳞状细胞癌的一种特殊类型，占喉恶性肿瘤的1 %~4%， 临床表现呈局部侵袭性、真菌样块，不发生颈淋巴结转移。组织学特点为高分化鳞癌，像粗 针状、以推进方式侵袭到喉基质内。
[0067] 腺癌：腺癌包括腺样囊性癌、黏液表皮样癌等，多发生在声门下或声门上区。其中 囊腺癌多趋向于神经周围浸润。
[0068]喉癌症状主要为声嘶、呼吸困难、咳嗽、吞咽困难、颈部淋巴结转移等。
[0069] 喉癌的分类分期:按照解剖位置分为3区：
[0070] 1.声门上区：会厌喉面、会厌杓状皱襞、杓状软骨、假声带及喉室，不包括会厌舌 面、会厌溪、梨状窝等。
[0071] 2.声带区两侧声带及前联合。
[0072] 3.声门下区两侧声门下，不包括声带下面，其下缘以环状软骨下缘为界。
[0073] "标志物的水平"或"生物标志物的水平"是指在待测试的样品中存在的标志物的 量。标志物的水平可以是绝对水平或量(例如μg/ml)或相对水平或量(例如相对信号强度）。
[0074] 标志物的"更高水平"或"水平增加"是指大于用于评估标志物水平的测定法的标 准误差的试验样品中的标志物水平，和优选为对照样品中标志物水平(例如来自具有健康 人的受试者、具有喉癌的受试者、在过去18个月内已经诊断为喉癌的受试者的样品和/或几 种对照样品中标志物的平均水平)的至少1.5倍、和更优选3、4、5、6、7、8、9或10或更多倍。
[0075] 标志物的"更低水平"或"水平降低"是指小于用于评估标志物水平的测定法的标 准误差的试验样品中的标志物的水平，和优选为对照样品中标志物水平(例如来自具有健 康人的受试者、具有喉癌的受试者、在过去18个月内已经诊断为喉癌的受试者的样品和/或 几种对照样品中标志物的平均水平）的至多1/2、和更优选1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9 或1/10或更低。
[0076] 术语"已知的标准水平"或"对照水平"是指标志物的公认的或预定的水平，其用于 比较来自受试者的样品中的标志物的水平。
[0077] 在一个实施方案中，标志物的对照水平基于来自健康人的受试者的样品中的标志 物的水平。
[0078] 在另一个实施方案中，标志物的对照水平基于来自具有喉癌的一个或多个受试者 的样品中的标志物的水平。
[0079]在另一个实施方案中，标志物的对照水平基于来自在过去18个月内已经诊断为喉 癌的受试者的样品中的标志物的水平。
[0080] 在另一个实施方案中，来自受试者的样品中的标志物的对照水平是之前在受试者 的样品中已确定的标志物的水平。
[0081] 在又一个实施方案中，标志物的对照水平基于在给予对喉癌的疗法之前来自受试 者的样品中的标志物的水平。
[0082] 在另一个实施方案中，标志物的对照水平基于来自未与试验化合物接触的具有喉 癌的受试者的样品中的标志物的水平。
[0083] 在另一个实施方案中，标志物的对照水平基于来自与试验化合物接触的健康人的 受试者的样品中的标志物的水平。
[0084] 在其它实施方案中，标志物的"对照"水平可通过测定获自在受试者中怀疑喉癌发 作之前的受试者样品、获自存档的受试者样品等的标志物的水平来确定。
[0085] 如本文所用的，术语〃患者〃或"受试者"是指人和非人动物，例如兽医学患者。术语 "非人动物"包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物、小鼠、 兔、绵羊、狗、猫、马、奶牛、鸡、两栖动物和爬行动物。在一个实施方案中，所述受试者是人。 [0086] 在一些实施方案中，受试者的体重指数(BMI)为小于约40kg/m2(例如约40、39、38、 37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19或约181^/111 2)。在其它实 施方案中，受试者的体重指数(BMI)为大于约40kg/m2(例如约41、42、43、44、45、46、47、48、 49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、 74、75、76、77、78、79或约801^/111 2)。
[0087]本文所用的术语"样品"是指自受试者分离的类似细胞或组织的收集物，以及在受 试者内存在的组织、细胞和流体。术语"样品"包括来自受试者的任何体液(例如血液、淋巴、 妇科流体、囊液、尿液、眼泪和通过支气管灌洗和/或腹膜冲洗收集的流体)或细胞。在一个 实施方案中，从受试者取出所述组织或细胞。在另一实施方案中，所述或细胞存在于所述受 试者内。其它受试者样品包括泪滴、血清、脑脊液、粪便、痰和细胞提取物。在一个实施方案 中，生物学样品包含来自测试受试者的蛋白分子。在另一实施方案中，生物学样品可包含来 自测试受试者的mRNA分子或来自测试受试者的基因组DNA分子。
[0088]术语〃测定〃意指包括检测样品中标志物的存在或不存在、定量测定样品中标志物 的量、和/或确定生物标志物的类型的方法。测量可通过本领域已知的方法和本文进一步描 述的那些方法实现。
[0089]试剂盒是包含特异性检测本发明的标志物的至少一种试剂例如探针、引物或抗体 的任何制品（例如包装或容器），所述制品作为用于进行本发明的方法的一个单位来推销、 分配或销售。在某些实施方案中，试剂盒可包括基质，例如包含本发明的一种或多种标志物 的捕获试剂和/或与本发明的一种或多种标志物结合的捕获试剂的基质。在一些实施方案 中，这样的试剂盒包含用于使用质谱测定标志物的水平的使用说明书。
[0090] 本发明的标志物
[0091] 本发明的一个方面，提供一种用于确定受试者是否具有或将发展喉癌的标志物， 其包括:肌酸、1，3_二氨基丙烷、胸腺嘧啶、3-氨基异丁酸、胞苷酸和腐胺中的一种或多种。
[0092] 肌酸:是一种自然存在于脊椎动物体内的一种含氮的有机酸，能够辅助为肌肉和 神经细胞提供能量。
[0093] 1，3-二氛基丙烷:C3H10N2。
[0094]胸腺嘧啶：C5H6N202。
[0095] 3-氨基异丁酸:C4H9N02，
[0096] 胞苷酸：
[0097]腐胺:C4H12N2，腐胺在上皮细胞迀移、增殖和分化过程中发挥着重要的作用。
[0098]在本发明的某些方面，单个标志物可用于本发明的方法和组合物。例如，在一个实 施方案中，用于本发明的方法和组合物的标志物是肌酸。在一个实施方案中，标志物是1，3_ 二氨基丙烷。在一个实施方案中，标志物是胸腺嘧啶。在一个实施方案中，标志物是3-氨基 异丁酸。在一个实施方案中，标志物是胞苷酸。在一个实施方案中，标志物是腐胺。
[0099] 在本发明的其它方面，超过一种标志物，例如多种标志物，例如2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11或更多种标志物，可用于本发明的方法和组合物。例如，在一个实施方案中，用于本发 明的方法和组合物的标志物包括肌酸和1，3_二氨基丙烷。在一个实施方案中，标志物包括 肌酸和胸腺啼啶。在一个实施方案中，标志物包括肌酸和3-氨基异丁酸。在一个实施方案 中，标志物包括肌酸和胞苷酸。在一个实施方案中，标志物包括肌酸和腐胺。在一个实施方 案中，标志物包括1，3_二氨基丙烷和胸腺嘧啶。在一个实施方案中，标志物包括1，3_二氨基 丙烷和3-氨基异丁酸。在一个实施方案中，标志物包括1，3_二氨基丙烷和胞苷酸。在一个实 施方案中，标志物包括1，3_二氨基丙烷和腐胺。在一个实施方案中，标志物包括胸腺嘧啶和 3_氨基异丁酸。在一个实施方案中，标志物包括胸腺嘧啶和胞苷酸。在一个实施方案中，标 志物包括胸腺嘧啶和腐胺。在一个实施方案中，标志物包括3-氨基异丁酸和胞苷酸。在一个 实施方案中，标志物包括3-氨基异丁酸和腐胺。在一个实施方案中，标志物包括胞苷酸和腐 胺。
[0100]在一个实施方案中，标志物包括肌酸、1，3-二氨基丙烷和胸腺嘧啶。在一个实施方 案中，标志物包括肌酸、1，3-二氨基丙烷和3-氨基异丁酸。在一个实施方案中，标志物包括 肌酸、1，3-二氨基丙烷和胞苷酸。在一个实施方案中，标志物包括肌酸、1，3-二氨基丙烷和 腐胺。在一个实施方案中，标志物包括肌酸、胸腺嘧啶和3-氨基异丁酸。在一个实施方案中， 标志物包括肌酸、胸腺嘧啶和胞苷酸。在一个实施方案中，标志物包括肌酸、胸腺嘧啶和腐 胺。在一个实施方案中，标志物包括肌酸、3-氨基异丁酸和胞苷酸。在一个实施方案中，标志 物包括肌酸、3-氨基异丁酸和腐胺。在一个实施方案中，标志物包括肌酸、胞苷酸和腐胺。在 一个实施方案中，标志物包括1,3-二氨基丙烷、胸腺啼啶和3-氨基异丁酸。在一个实施方案 中，标志物包括1，3-二氨基丙烷、胸腺嘧啶和胞苷酸。在一个实施方案中，标志物包括1，3-二氨基丙烷、胸腺嘧啶和腐胺。
[0101] 在一个实施方案中，标志物包括肌酸、1，3_二氨基丙烷、胸腺嘧啶和3-氨基异丁 酸。在一个实施方案中，标志物包括肌酸、1，3_二氨基丙烷、胸腺嘧啶和胞苷酸。在一个实施 方案中，标志物包括肌酸、1，3-二氨基丙烷、胸腺嘧啶和腐胺。在一个实施方案中，标志物包 括肌酸、1，3_二氨基丙烷、胸腺嘧啶、3-氨基异丁酸和腐胺。在一个实施方案中，标志物包括 肌酸、1，3_二氨基丙烷、胸腺嘧啶、3-氨基异丁酸、胞苷酸和腐胺。
[0102] 本发明的一个方面提供获取所述标志物的方法，其具体步骤在于：
[0103] 1、获取受试者样品，并进行前处理；
[0104] 2、将前处理过的受试者样品进行GC-MS或者LC-MS进行检测，收集数据；
[0105] 3、进行数据分析，获取可行的标志物。
[0106] 上述步骤中，所述受试者样品可以是固体、液体，也可以是细胞、微生物等。
[0107] 作为一种实施方式，当所述受试者样品为固体时，所述具体前处理的方法为：将 100mg固体溶于400yL提取试剂，加入钢珠进行研磨，所述研磨的条件为30Hz，5分钟;然后进 行离心，取上清。
[0108] 若要进行GC-MS测试，可进行浓缩干燥。所述浓缩干燥的步骤为将上清中加入 20mg/ml的甲氧胺，在80 °C下干燥20min，然后加入试剂BSTFA下进行衍生化处理1小时后，进 行测试。
[0109] 若要进行LC-MS测试，则只需将上清液进行浓缩干燥，加入100yL乙腈进行复溶，经 过滤塞，可直接进行LC-MS测试。
[0110] 作为一种实施方式，所述受试者样品为液体时，例如血清、尿液等。所述具体前处 理的方法为：100yL液体加入350yL甲醇中，进行斡旋混匀，高速离心，取上清液，进行测试。
[0111] 若要进行GC-MS测试，可进行浓缩干燥。所述浓缩干燥的步骤为将上清中加入 20mg/ml的甲氧胺，在80 °C下干燥20min，然后加入试剂BSTFA下进行衍生化处理1小时后，进 行测试。
[0112] 若要进行LC-MS测试，则只需将上清液进行浓缩干燥，加入100yL乙腈进行复溶，经 过滤塞，可直接进行LC-MS测试。
[0113]作为一种实施方式，所述受试者样品为微生物时，所述处理方式与细胞的处理方 式一样。
[0114] 本发明的方法
[0115] 在某些方面，本发明提供诊断方法。例如，在一个方面，本发明提供用于确定受试 者是否具有喉癌的方法。所述方法包括测定在受试者样品中的本发明的一种或多种标志物 的水平与在对照样品中的所述一种或多种标志物的水平。与对照样品中一种或多种标志物 的水平相比，受试者样品中的一种或多种标志物的水平差异(例如更高或更低)指示所述受 试者具有喉癌。
[0116] 在另一方面，本发明提供用于确定受试者是否具有喉癌的方法。所述方法包括测 定在受试者样品中的本发明的一种或多种标志物的水平与在对照样品中的所述一种或多 种标志物的水平。与对照样品中的一种或多种标志物的水平相比，受试者样品中的一种或 多种标志物的水平差异(例如更高或更低)指示所述受试者具有喉癌。
[0117] 本发明还提供预后方法。例如，在一个方面，本发明提供用于确定受试者是否将发 展喉癌的方法。所述方法包括测定在受试者样品中的本发明的一种或多种标志物的水平与 在对照样品中的所述一种或多种标志物的水平。与对照样品中的一种或多种标志物的水平 相比，受试者样品中的一种或多种标志物的水平差异(例如更高或更低)指示所述受试者将 发展喉癌。
[0118] 在另一方面，本发明提供用于确定受试者是否将发展喉癌的方法。所述方法包括 测定在受试者样品中的本发明的一种或多种标志物的水平与在对照样品中的所述一种或 多种标志物的水平。与对照样品中一种或多种标志物的水平相比，受试者样品中的一种或 多种标志物的水平差异(例如更高或更低)指示所述受试者将发展喉癌。
[0119] 在另一方面，本发明提供用于确定具有喉癌的受试者是否将对治疗方案有反应的 方法。所述方法包括测定在受试者样品中的本发明的一种或多种标志物的水平与在对照样 品中的所述一种或多种标志物的水平。与对照样品中的一种或多种标志物的水平相比，受 试者样品中的一种或多种标志物的水平差异(例如更高或更低)指示所述受试者将对治疗 有反应。
[0120] 本领域已知多种喉癌疗法，包括例如:氟尿嘧啶注射液、妥立士宁、迪欧平(盐酸托 烷司琼胶囊）、尼泰美(盐酸托烷司琼胶囊）、班宁(注射用去甲斑蝥酸钠）、顺铂注射液、注射 用盐酸博来霉素、塞替派。
[0121 ]在本发明的某些实施方案中，所述治疗包括氟尿嘧啶注射液。在另一实施方案中， 所述治疗包括尼泰美(盐酸托烷司琼胶囊）。在又一个实施方案中，所述治疗包括注射用盐 酸博来霉素。
[0122] 在本发明的任何方法(和试剂盒）中，获自受试者的样品中本发明的标志物的水平 可通过各种众所周知的技术和方法中的任一种来测定，其将样品中的本发明的标志物转化 成可检测和定量的部分。这样的方法的非限制性实例包括使用用于检测蛋白质的免疫学方 法、蛋白质纯化方法、蛋白质功能或活性测定法、核酸杂交方法、核酸逆转录方法和核酸扩 增方法、免疫印迹法、蛋白质印迹法、RNA印迹法、电子显微术、质谱法（例如MALDI -T0F和 SELDI-T0F)、免疫沉淀、免疫荧光、免疫组织化学、酶联免疫吸附测定法(ELISA)(例如扩增 ELISA)、基于血液的定量测定法（例如血清ELISA)、基于尿液的定量测定法、流式细胞术、 DNA杂交、阵列分析等和其组合或亚组合分析样品。
[0123] 普通技术人员将容易理解的是，本领域已建立用于在核酸或蛋白水平上检测本发 明的标志物的水平的任何技术手段基本上都可用于测定本文所述的本发明的标志物的水 平。
[0124] 在一个实施方案中，本发明的标志物的水平使用核酸探针来测定。本文所用的术 语"探针"是指能够选择性结合本发明的特定标志物的任何分子。探针可由本领域技术人员 合成，或来源于合适的生物制备物。探针可经特别设计为标记的。可用作探针的分子的实例 包括但不限于RNA、DNA、蛋白质、抗体和有机分子。
[0125] 在本发明的一个实施方案中，使用微阵列来检测本发明的标志物的水平。因为不 同实验之间的可再现性，微阵列特别地非常适合用于此目的。DNA微阵列提供一种用于同时 测量大量基因的水平的方法。各阵列由附着至固体支持物的可重现形式的捕获探针组成。 标记的RNA或DNA与阵列上的互补探针杂交，然后通过激光扫描检测。阵列上的各探针的杂 交强度经测定并转化成表示相对基因表达水平的定量值。
[0126] 用于在蛋白水平上检测本发明的标志物的其它已知方法包括以下方法，例如电 泳、毛细管电泳、高效液相色谱、薄层色谱、超扩散色谱等，或各种免疫学方法例如流体或凝 胶沉淀反应、免疫扩散、免疫电泳、放射免疫测定法、酶联免疫吸附测定法、免疫荧光测定法 和蛋白质印迹法。
[0127] 在本发明的一个实施方案中，使用蛋白质组方法，例如质谱法。质谱法是一种分析 技术，包括将化合物电离以产生带电分子(或其片段)和测量其质量-电荷比。在典型的质谱 程序中，自受试者获得样品，加载到质谱上，和其组分(例如本发明的标志物)通过不同的方 法电离(例如通过用电子束轰击它们），导致形成带电颗粒(离子）。然后当离子穿越电磁场 时，根据离子的运动计算颗粒的质量-电荷比。
[0128] 例如，基质辅助的激光解吸/电离飞行时间质谱法或表面增强激光解吸/电离飞行 时间质谱法，其包括应用生物样品例如血清至蛋白结合芯片可用于测定本发明的标志物的 水平。
[0129] 此外，用于测定本发明标志物的水平的体内技术包括将针对本发明标志物的标记 抗体引入到受试者中，所述抗体结合本发明的标志物并将其转化成可检测的分子。如上所 述，在受试者中本发明的可检测标志物的存在、水平或甚至位置可通过标准成像技术检测 而测定。
[0130]总的来说，优选受试者样品中的本发明标志物的水平与对照样品中的本发明标志 物的量之间的差异尽可能的大。尽管该差异可能与用于测定标志物水平的方法的检测限度 一样小，但优选所述差异至少大于评估方法的标准误差，优选差异为评估方法的标准误差 的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、100、500、1000倍或更大。
[0131] 用于监测治疗功效的方法
[0132] 本发明还提供用于监测可用于在受试者中抑制喉癌的发展;降低或减慢健康人至 喉癌的进展;和/或降低或抑制与所述疾病相关的并发症的发展的疗法或治疗方案或任何 其它治疗方法的功效的方法。在这些方法中，评估在一对样品（不经过治疗方案的第一样品 和经过治疗方案的至少一部分的第二样品）中的本发明的一种或多种标志物的水平。相对 于第二样品，第一样品中一种或多种标志物的表达水平的调节表明所述疗法有效在受试者 中抑制喉癌的发展;降低或减慢健康人至喉癌的进展;和/或降低或抑制与所述疾病相关的 并发症的发展。
[0133] 鉴定喉癌生物标志物的方法
[0134] 本发明进一步提供用于鉴定喉癌生物标志物的方法，所述生物标志物用作例如疾 病(预后和诊断）、药物的治疗功效(治疗诊断）和药物毒性的标志物。例如，如上所述，本文 所述的标志物和使用生物标志物发现的方法鉴定的标志物可用于例如确定受试者是否具 有或将发展喉癌;确定具有喉癌的受试者是否将对喉癌疗法有反应;监测用于在受试者中 抑制喉癌的发展、降低或减慢健康人至喉癌的进展和/或降低或抑制与所述疾病相关的并 发症的发展的疗法的功效;鉴定调节(例如降低或增加)用作例如疗法的本发明的标志物的 表达和/或活性的分子的筛选测定法中。
[0135] 喉癌标志物还可通过以下来鉴定:测定提供至少一部分疗法给受试者之前获自具 有喉癌的受试者的第一样品中的蛋白水平，和测定提供所述疗法的至少一部分后获自所述 受试者的第二样品中的蛋白水平。相对于第一样品，第二样品中蛋白表达水平的差异，例如 统计学显著水平，鉴定所述蛋白为喉癌标志物。
[0136] 本发明的试剂盒
[0137] 本发明还提供用于确定受试者是否具有或将发展喉癌的试剂盒。还提供确定疗法 是否将有效治疗具有喉癌的受试者的试剂盒和用于监测疗法的功效的试剂盒。
[0138] 这些试剂盒包括测定本发明的一种或多种标志物的水平的工具和试剂盒使用说 明书。
[0139] 本发明的试剂盒可任选包含用于进行本发明方法的另外组分。例如，试剂盒可包 含用于从受试者获得生物样品的试剂、对照样品、一个或多个样品区室、喉癌治疗剂、描述 进行本发明方法的指导材料和组织特异性对照/标准品。
[0140] 用于测定一种或多种标志物的水平的试剂可包括例如缓冲液或用于评价一种或 多种标志物的水平的测定法的其它试剂。说明书可以是例如用于进行评价本发明的一种或 多种标志物的水平的测定法的印刷的说明书。
[0141] 用于自受试者分离生物样品的试剂可包括可用于从受试者获得流体或组织的一 种或多种试剂，例如用于获得唾液或血液的工具。
[0142] 本发明的试剂盒可进一步包括用于培养获自受试者的样品的试剂。
[0143]优选，试剂盒经设计用于人类受试者。
[0144] 本发明通过以下实施例作进一步说明，实施例不应解释为进一步限制。本申请全 文所引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容，以及附图，明确地通过引用以其 整体结合到本文中。
[0145] 等效物
[0146] 在描述实例性实施方案中，为澄清的原因使用特定的术语。为描述的目的，各特定 的术语意指至少包括所有技术和功能等效物，其以类似的方式操作来实现类似的目的。此 外，在其中具体的实例性实施方案包括多个系统要素或方法步骤的一些实例中，那些要素 或步骤可替换为单一要素或步骤。同样，单一要素或步骤可替换为用于相同目的的多个要 素或步骤。此外，在本文指定实例性实施方案的各种性质的参数的情况下，那些参数可向上 或向下调整1/20、1/10、1/5、1/3等，或通过其四舍五入近似值调整，除非另有说明。此外，尽 管实例性实施方案已经参考其具体的实施方案进行显示和描述，但本领域普通技术人员将 理解，在不背离本发明的范围的情况下，可对其进行形式和细节上的各种替换和改变。还另 外，其它方面、功能和优点也在本发明的范围内。
[0147]本文提供了实例性的流程图用于说明的目的，并且是非限制性的方法实例。本领 域普通技术人员将认识到，实例性的方法可包括比实例性流程图中说明的那些更多或更少 的步骤，并且实例性流程图中的步骤可以与所示不同的顺序进行。
[0148] 分组:分为正常组、喉癌组、癌旁组织组。
[0149] 选取950个受试者，其中正常健康人320人;喉癌病300人;癌旁组织330人。
[0150] 一、获取标志物
[0151] 步骤：1、获取受试者血清，并进行前处理：100yL液体加入350yL甲醇中，进行斡旋 混匀，高速离心，取上清液，进行浓缩干燥，加入lOOyL乙腈进行复溶，经过滤塞，可直接进行 GC-MS测试;收集GC-MS数据，进行多元变量统计分析。
[0152] 采用GC-MS定量验证后发现正常组、喉癌组、癌旁组织组，与正常人组相比，特异有 差异的表达物质有:肌酸、1，3_二氨基丙烷、胸腺嘧啶、3-氨基异丁酸、胞苷酸和腐胺。
[0153] 标注物编号:编号1是肌酸;编号2是1，3-二氨基丙烷;编号3是3-氨基异丁酸;编号 4是胸腺啼啶;编号5是腐胺;编号6是胞苷酸。
[0154] 实施例如表1所示：
[0155] 表1【具体实施方式】


[0159] 其中，编号"2-3"代表以编号为2的标志物和编号为3的标志物组合联合诊断喉癌 组、癌旁组织组和正常人组，也就是以1，3-二氨基丙烷和3-氨基异丁酸为标志物组合联合 诊断。其余编号以此类推。
[0160] 以上数据可以看出，标志物组合使用时，诊断灵敏度为93.33%，特异度为0%。本 发明所选择的标志物具有很强的使用前景，因此提供了本发明的有益技术效果。
[0161] 前述的实例仅是说明性的，用于解释本公开的特征的一些特征。所附的权利要求 旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例 的组合的选择的实施方式的说明。因此，
【申请人】的用意是所附的权利要求不被说明本发明 的特征的示例的选择限制。而且在科技上的进步将形成由于语言表达的不准确的原因而未 被目前考虑的可能的等同物或子替换，且这些变化也应在可能的情况下被解释为被所附的 权利要求覆盖。
【主权项】
1. 用于确定受试者是否具有或将发展喉癌的标志物，其包括:肌酸、1，3-二氨基丙烷、 胸腺嘧啶、3-氨基异丁酸、胞苷酸和腐胺中的一种或多种。2. 用于确定受试者是否具有或将发展喉癌的方法，所述方法包括： 在受试者的样品中测定权利要求1中一种或多种标志物的水平； 将受试者样品中的一种或多种标志物的水平与对照样品中的一种或多种标志物的水 平相比较，其中与对照样品中的一种或多种标志物的水平相比，受试者样品中的一种或多 种标志物的水平的差异指示所述受试者具有或将发展喉癌。3. 用于确定具有喉癌的受试者是否将对疗法有反应的方法，所述方法包括 在受试者的样品中测定权利要求1中一种或多种标志物的水平； 将受试者样品中的一种或多种标志物的水平与对照样品中的一种或多种标志物的水 平相比较，其中与对照样品中的一种或多种标志物的水平相比，受试者样品中的一种或多 种标志物的水平的差异指示所述受试者将对所述疗法有反应。4. 用于确定受试者是否具有或将喉癌的试剂盒，所述试剂盒包括用于在受试者样品中 权利要求1中的一种或多种标志物的水平的试剂和确定受试者是否具有或将发展喉癌的试 剂盒使用说明书。5. 用于确定具有喉癌的受试者是否将对治疗有反应的试剂盒，所述试剂盒包括用于在 受试者样品中测定权利要求1中的一种或多种标志物的水平的试剂和确定受试者是否将对 所述治疗有反应的试剂盒使用说明书。6. 用于确定受试者是否具有或将发展喉癌的方法，所述方法包括 测定在受试者样品中的所述肌酸的水平； 将受试者样品中的肌酸的水平与对照样品中的肌酸的水平相比较，其中受试者样品中 的肌酸的水平高于对照样品中的肌酸的水平，指示所述受试者具有或将发展喉癌。7. 用于确定具有喉癌的受试者是否将对治疗有反应的方法，所述方法包括 测定在受试者样品中的肌酸的水平； 将受试者样品中的肌酸的水平与对照样品中肌酸的水平相比较，其中受试者样品中的 肌酸的水平高于对照样品中的肌酸的水平，指示所述受试者将对所述治疗有反应。8. 在具有喉癌的受试者中监测治疗的功效的方法，所述方法包括： 在给予受试者所述治疗的至少一部分之前和之后，测定在受试者样品中的肌酸的水 平;和 将在给予所述治疗之前来自受试者样品中的肌酸的水平与在给予所述治疗的至少一 部分之后来自受试者样品中的肌酸的水平相比较，其中与在给予所述治疗之前的样品中的 肌酸的水平相比，在给予所述治疗的至少一部分之后的样品中的肌酸的水平降低表明所述 受试者对所述治疗有反应，从而监测所述治疗的功效。9. 权利要求6-8中任一项的方法，进一步包括测定在受试者样品中的权利要求1中的一 种或多种另外的标志物的水平。10. 用于鉴定喉癌标志物的方法，所述方法包括 在稳定状态条件下，鉴定来自两个或更多个物种的两种或更多种的血液，从而产生标 志物的临时列表； 在功能障碍条件下鉴定临时列表中标志物，在正常条件下鉴定临时列表中标志物， 测定试验样品和对照样品的样品中的标志物的水平，其中与试验样品中的水平相比， 对照样品中标志物的水平的差异鉴定所述标志物为喉癌标志物； 其中试验样品来自具有喉癌的受试者； 其中对照样品来自具有正常的受试者。
【文档编号】G01N33/574GK106093241SQ201610403136
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】楼格尔, 邓军亮, 吴洪强
【申请人】上海阿趣生物科技有限公司