土壤中不同有机组分的连续提取方法
【专利摘要】本发明属于农业生产技术领域，公开了一种土壤中不同有机质组分的连续提取方法，包括颗粒有机质(POM)、颗粒态黑炭(POM?BC)、胡敏酸(HA)、富啡酸(FA)、易提取态球囊霉素相关蛋白(EE?GRSP)、难提取态球囊霉素相关蛋白(HE?GRSP)、柠檬酸钠易提取态可溶性有机质(EE?DOC)、柠檬酸钠难提取态可溶性有机质(HE?DOC)、残余态有机质(Residual)以及结合态黑炭(B?BC)的连续提取。主要步骤如下：(1)土壤样品的采集与预处理；(2)试剂的配置；(3)不同有机组分的连续提取；(4)提取出有机组分碳含量的测定；(5)不同有机组分碳含量的计算。本发明将不同的有机组分连续提取与分离出来，克服了传统方法每次只能提取一种有机组分以及提取出不同有机组分之间物质重叠的问题，同时提高了土壤中有机质的提取率。
【专利说明】
土壤中不同有机组分的连续提取方法
技术领域
[0001]本发明属于农业生产技术领域中一套土壤有机质组分的分离提取方法。具体的说就是一套将土壤有机质的不同组分，颗粒有机质(Ρ0Μ)、颗粒态黑炭(P0M-BC)、胡敏酸(HA)、富啡酸(FA)、易提取态球囊霉素相关蛋白(EE-GRSP)、难提取态球囊霉素相关蛋白(HE-GRSP)、柠檬酸钠易提取态可溶性有机质(EE-DOC)、柠檬酸钠难提取态可溶性有机质(HE-D0C)、残余态有机质(Residual)以及结合态黑炭(B-BC)，通过连续提取将其分离，并测定不同组分碳含量的方法。
技术背景
[0002]土壤有机质(SOM)是土壤的重要组成物质，对改善土壤物理化学性质以及植物的生长起着重要的作用，同时也是全球碳循环的一个重要因素，在环境保护、农业可持续发展等方面有着重要的意义。通过物理和化学分离手段可以将土壤有机组分分为颗粒有机质、富啡酸、胡敏酸、胡敏素、土壤球囊霉素相关蛋白以及黑炭。
[0003]颗粒有机质由大量来至植物根部的新鲜植物残体组成，这是植物残体分解最先形成的碳库，也是土壤系统中能量与营养的来源。颗粒有机质的提取方法是在加入高密度的碘化钠或多钨酸钠溶液，利用物理方法将其悬浮和土壤分离。胡敏酸和富啡酸是土壤动植物残体被微生物分解的副产品。利用氢氧化钠和焦磷酸钠溶液对土壤进行提取后，提取液用稀硫酸酸化进行沉淀，发生沉淀的物质是胡敏酸，溶液中未沉淀的物质是富啡酸。球囊霉素相关蛋白是由丛植菌根真菌产生的一种糖蛋白。利用柠檬酸钠溶液在提取温度为121°C的条件下将其提取，然后用盐酸溶液调节PH值到2.1使其沉淀，得到的沉淀物就是球囊霉素相关蛋白，溶液中没有沉淀的物质是柠檬酸钠可提取态可溶性有机质。土壤中黑炭的提取是利用盐酸和氢氟酸反复处理样品，充分去除土壤中的碳酸盐和硅酸盐，最后使用重铬酸钾和硫酸混合溶液处理，最后的残余物质就是黑炭。土壤胡敏素是既不溶于酸又不溶于水的腐殖物质组分，将土壤用氢氧化钠和焦磷酸钠混合液反复浸提除去其中的胡敏酸和富啡酸，剩余的残渣就是胡敏素。
[0004]现有的通过用不同提取剂将土壤有机质的不同组分分离提取出来的传统方法只能分离或提取土壤有机质中的一种或几种组分，不能完全将所有的已知土壤有机质组分分离出来。因此，设计一套能够将已知的所有土壤有机质组分进行系统、连续提取和分离的方法，对于土壤有机质的研究是一项基础性的工作，有非常重要的意义。
【发明内容】
[0005]本发明针对传统土壤有机质组分的提取与分离的方法只能提取与分离部分土壤有机质组分的问题，设计出一种土壤中不同有机组分的连续提取方法，即连续分离土壤有机质的物理与化学组分的方法。
[0006]本发明所述的土壤中不同有机组分的连续提取方法的连续提取步骤为:
[0007]—、土壤样品的采集与预处理；
[0008]二、试剂的配制；
[0009]三、不同有机组分的连续提取；
[0010]所述不同有机组分的连续提取包括如下步骤:
[0011]a.游离态颗粒有机质和游离态黑炭的混合物的提取:取土样2.5克到50ml塑料离心管中，加入20ml密度为1.7g/cm3的碘化钠溶液，振荡I小时，5600转离心20分;这种操作重复3次，直到悬浮液中没有悬浮物质为止;悬浮物质在0.7um的滤纸下过滤，用真空栗抽干，先用70ml左右0.0lmoVL的氯化钙冲洗，再用去离子水洗直到电导率<50yS/cm;样品转移到150ml三角瓶中，离心管中残余土保留以便下一步提取；测定提取物碳含量时应把转移到150ml三角瓶中的样品，在60°C条件下水浴蒸干；
[0012]b.闭蓄态颗粒有机质和闭蓄态黑炭的混合物的提取:将上一步提取的残余土，加入20ml密度为1.7g/cm3的碘化钠溶液，用450 J/ml的超声波处理I小时，温度控制在40 °C以下，5600转离心20分；这种操作重复3次，直到悬浮液中没有悬浮物质为止；悬浮物质在0.7um的滤纸下过滤，用真空栗抽干，先用70ml左右0.01mol/L的氯化钙冲洗，再用去离子水洗直到电导率〈50yS/cm;样品转移到150ml三角瓶中，离心管中残余土用去离子水洗洗涤，4000转离心5分钟，此操作重复3次，保留以便下一步提取;测定提取物碳含量时应把转移到150ml三角瓶中的样品，在60°C条件下水浴蒸干；
[0013]c.颗粒态黑炭POM-BC的提取:将步骤a和步骤b得到的混合物合并，加入6ml重铬酸钾和硫酸的混合液，其中重络酸钾的浓度为0.lmol/L，硫酸的浓度为2mol/L，在温度为55土I °C的条件下反应60小时，用去离子水冲洗转入离心管中，5000转离心20分钟，弃去上清液，用去离子水清洗3次，剩余物质就是P0M-BC;测定提取物碳含量时应把转移到150ml三角瓶中的样品，在60°C条件下水浴蒸干；
[OOM] d.胡敏酸HA和富啡酸FA的提取:在步骤b的残余土中加入0.lmol/L的焦磷酸钠和0.lmol/L的氢氧化钠混合液20ml，通入氮气5分钟，震荡12小时;4500转离心10分钟，上清液转入10ml容量瓶中，这一步骤重复3-5次，直到上清液无色为止，定容，此时容量瓶中收集的物质为腐殖酸:胡敏酸和富啡酸;吸取滤液40ml于烧杯中，置于沸水浴上加热，在玻璃棒搅拌下滴加3mol/L的硫酸溶液酸化，直至有絮状沉淀为止，继续加热10分钟使胡敏酸完全沉淀；以0.02mol/L的硫酸溶液洗涤滤纸和沉淀，洗至滤液无色为止，滤液为富啡酸，用150ml三角瓶收集；以热的0.02mol/L氢氧化钠溶液溶解沉淀，溶解液收集于150ml三角瓶中，如前法酸化;胡敏酸和富啡酸溶液60°C条件下水浴蒸干，以便下一步测定碳含量;离心管中残余土用去离子水洗洗涤，4000转离心5分钟，此操作重复3次，保留以便下一步提取；
[0015]e.易提取态球囊霉素相关蛋白EE-GRSP和柠檬酸钠易提取态可溶性有机质EE-DOC的提取:上述残余土中加入20ml浓度为0.02mol/L，pH值为7的柠檬酸钠溶液，121°C高压蒸汽处理30min，5600转离心20分钟，上清液转移到三角瓶中，参与物质用去离子水洗涤3遍，离心，上清液合并到三角瓶中；三角瓶中的溶液用浓度为0.lmol/L的盐酸溶液将pH值调节到2.1，冰浴60分钟，溶液中产生大量沉淀;将溶液过滤，滤液为EE-DOC，滤液收集到10ml容量瓶中定容;滤纸上的固态物质便是EE-GRSP，再用0.1moI/L的氢氧化钠溶液将其溶解到10ml三角瓶中，60°C水浴蒸至近干;将容量瓶中的EE-DOC溶液吸取20ml移入10ml三角瓶中，60°C下水浴蒸至近干；由于EE-DOC溶解在柠檬酸钠溶液中，柠檬酸钠的碳含量高，直接测定碳含量对试剂的需求量太大，因此，需要定容后从中量取20ml以备测定碳含量；
[0016]f.难提取态球囊霉素相关蛋白HE-GRSP和柠檬酸钠难提取态可溶性有机质HE-D0C的提取:上述残余土中加入20ml浓度为0.05mol/L，pH值为8的柠檬酸钠溶液，121°C高压蒸汽处理90min，5600转离心20分钟，上清液转移到250ml三角瓶中，重新添加浸提液，混匀加热，直到红棕色很淡，一般重复5次热抽提，个别含量很高的土壤需要增加次数;残余土用去离子水洗涤3遍，离心，上清液合并到三角瓶中；三角瓶中的溶液用浓度为0.lmol/L的盐酸溶液将PH值调节到2.1，冰浴60分钟，溶液中产生大量沉淀;将溶液过滤，滤液是HE-DOC，滤液收集到10ml容量瓶中定容；滤纸上的固态物质便是难提取态球囊霉素相关蛋白，再用0.lmol/L的氢氧化钠溶液将其溶解到10ml三角瓶中，60°C水浴蒸至近干;将容量瓶中的溶液吸取20ml移入10ml三角瓶中，60°C下水浴蒸至近干；
[0017]g.残余态有机组分Residual和结合态黑炭B-BC的提取:将上述残余土风干品均分成两份，其中一份用于残余态有机组分的测定;另一份转入离心管中，加入6ml浓度为3moI/L的盐酸溶液，室温下反应24小时，除去碳酸盐，5000转离心10分钟，倒掉上清液;加入6ml浓度为lOmol/L的氢氟酸，室温下反应24小时，除去硅酸盐;5000转离心10分钟，倒掉上清液；加入6ml浓度为10mol/L的盐酸溶液，室温下反应24小时，除去可能生成的氟化钙，5000转离心10分钟，倒掉上清液;剩余样品转入50ml三角瓶中，加入6ml重铬酸钾和硫酸的混合液其中重络酸钾的浓度为0.lmol/L,硫酸的浓度为2mol/L，在温度为55± TC的条件下反应60小时，用去离子水冲洗转入离心管中，5000转离心20分钟，弃去上清液，用去离子水清洗3次，剩余物质就是B-BC;将黑炭样品用去离子水冲洗转入10ml三角瓶中，60°C水浴蒸至近干；
[0018]四、步骤三提取出的有机组分碳含量的测定；
[0019]五、步骤三提取出的有机组分碳含量的计算。
[0020]本发明的优点是:通过对同一土壤样品按照一定顺序行连续提取，对每种提取方式获得的有机质样品分别进行处理，获得多个理化性质不同的土壤有机组分样品。本发明的将同一个土壤样品中一系列的有机组分连续分提取，各组分之间不存在重叠。本发明采用的提取顺序中，胡敏酸与富啡酸在球囊霉相关蛋白之前提取，避免了提取球囊霉素相关蛋白时，在高温、偏碱性的环境中将大量胡敏酸和富啡酸提取出来，造成胡敏酸和球囊霉素相关蛋白之间的大量的重叠。本发明采用多步连续提取的方法提取有机组分，使得有机组分的提取率远高于单独提取各种有机组分的提取率。
【附图说明】
[0021]图1是本发明的提取流程图。
[0022]图2是本发明连续提取法与传统提取法提取有机组份之一的对照表。
[0023]图3是本发明连续提取法与传统提取法提取有机组份之二的对照表。
[0024]图4是本发明连续提取法与传统提取法提取效率的对照表。
【具体实施方式】
[0025]现给合具体实施倒对本发明作进一步的说明。
[0026]本发明所述的土壤中不同有机组分的连续提取方法的连续提取步骤为:
[0027]一、土壤样品的采集与预处理:
[0028]采样地点:采样点1-天然次生林(记为N;经玮度:109°11.873’E 19。5.618，N;海拔:1145m);采样点点2-—代橡胶林(记为FG;经玮度:109° 3.587‘E 19° 8.784 ’ N;海拔:133m);采样点3-二代橡胶林(记为SG;经玮度:109° 24.275E 19° 28.555’N;海拔 125M)。
[0029]样品采集0-20cm土层(记为a层)和20-40cm土层(记为b层)；每个采样点采集3个重复。样品编号记为:N-1-a，N_2_a ； N_3_a ； N_l_b ； N_2_b ； N_3_b ； FG-1-a ； FG-2—a ； FG-3—a ； FG-
1-b ； FG-2-b ;FG-3-b ； SG-1-a ； SG_2_a ； SG_3_a ； SG_l_b ； SG_2_b ； SG_3_b。编号说明:例如N-1-a表示天然次生林-第一个采样点-20_40cm 土层。
[0030]采集的土壤样品风干后过0.25mm筛。
[0031]二、试剂的配制:
[0032]所述的试剂的配制方法为:
[0033](I)碘化钠溶液，密度为1.7g/cm3:将1200g碘化钠溶于水中，用IL的容量瓶定容；
[0034](2)氯化钙溶液，浓度为0.01mol/L;
[0035](3)焦磷酸钠和氢氧化钠混合液:焦磷酸钠和氢氧化钠的浓度均为0.lmol/L;
[0036](4)硫酸溶液，浓度约为3mo 1/L:量取163ml浓硫酸定容到IL;
[0037](5)硫酸溶液，浓度为0.02mo 1/L:吸取将溶液(4)66.7ml，定容到IL;
[0038](6)氢氧化钠溶液，浓度为0.02mol/L；
[0039 ] (7)柠檬酸钠溶液，浓度为0.02mo 1/L，pH值为7;
[0040](8)柠檬酸钠溶液，浓度为0.05mol/L，pH值为8;
[0041 ] (9)盐酸溶液，浓度为0.lmol/L:吸取8.33ml浓盐酸，定容到IL;
[0042](10)盐酸溶液，浓度为3mol/L:量取125ml浓盐酸，定容到500ml;
[0043](11)氢氟酸溶液，浓度为1mo 1/L:用塑料量筒量取150ml纯氢氟酸，用500ml塑料容量瓶定容；
[0044](12)盐酸溶液，浓度为10mol/L:量取417ml浓盐酸，定容到500ml;
[0045](13)重铬酸钾和硫酸的混合液:重铬酸钾浓度为0.lmol/L，硫酸浓度为2mol/L;
[0046](14)重铬酸钾标准液，l/6K2Cr207)=0.8mol/L:将重铬酸钾试剂在烘箱中，105°C条件下烘干3小时，取出后在干燥器中冷却8小时，冷却后称取39.225g，在水中加热溶解，冷却后用水定容至1L;
[0047](15)硫酸亚铁溶液，FeSO4,0.2mol/L: 56.0g硫酸亚铁，FeSO4'7H20，化学纯，溶于水，加入15ml浓硫酸，用水定容至IL;
[0048](16)邻啡罗啉试剂:1.485g邻啡罗啉试及0.695g硫酸亚铁溶于10ml水，在棕色瓶中保存。
[0049]三、不同有机组分的连续提取；
[0050]所述不同有机组分的连续提取包括如下步骤:
[0051]a.游离态颗粒有机质和游离态黑炭的混合物的提取:取土样2.5克到50ml塑料离心管中，加入20ml密度为1.7g/cm3的碘化钠溶液，振荡I小时，5600转离心20分;这种操作重复3次，直到悬浮液中没有悬浮物质为止;悬浮物质在0.7um的滤纸下过滤，用真空栗抽干，先用70ml左右0.0lmoVL的氯化钙冲洗，再用去离子水洗直到电导率<50yS/cm;样品转移到150ml三角瓶中，离心管中残余土保留以便下一步提取；测定提取物碳含量时应把转移到150ml三角瓶中的样品，在60°C条件下水浴蒸干；
[0052]b.闭蓄态颗粒有机质和闭蓄态黑炭的混合物的提取:将上一步提取的残余土，加入20ml密度为1.7g/cm3的碘化钠溶液，用450 J/ml的超声波处理I小时，温度控制在40 °C以下，5600转离心20分；这种操作重复3次，直到悬浮液中没有悬浮物质为止；悬浮物质在0.7um的滤纸下过滤，用真空栗抽干，先用70ml左右0.01mol/L的氯化钙冲洗，再用去离子水洗直到电导率〈50yS/cm;样品转移到150ml三角瓶中，离心管中残余土用去离子水洗洗涤，4000转离心5分钟，此操作重复3次，保留以便下一步提取;测定提取物碳含量时应把转移到150ml三角瓶中的样品，在60°C条件下水浴蒸干；
[0053]c.颗粒态黑炭POM-BC的提取:将步骤a和步骤b得到的混合物合并，加入6ml重铬酸钾和硫酸的混合液，其中重络酸钾的浓度为0.lmol/L，硫酸的浓度为2mol/L，在温度为55土
I°C的条件下反应60小时，用去离子水冲洗转入离心管中，5000转离心20分钟，弃去上清液，用去离子水清洗3次，剩余物质就是P0M-BC;测定提取物碳含量时应把转移到150ml三角瓶中的样品，在60°C条件下水浴蒸干；
[0054]d.胡敏酸HA和富啡酸FA的提取:在步骤b的残余土中加入0.lmol/L的焦磷酸钠和
0.lmol/L的氢氧化钠混合液20ml，通入氮气5分钟，震荡12小时;4500转离心10分钟，上清液转入10ml容量瓶中，这一步骤重复3-5次，直到上清液无色为止，定容，此时容量瓶中收集的物质为腐殖酸:胡敏酸和富啡酸;吸取滤液40ml于烧杯中，置于沸水浴上加热，在玻璃棒搅拌下滴加3mol/L的硫酸溶液酸化，直至有絮状沉淀为止，继续加热10分钟使胡敏酸完全沉淀；以0.02mol/L的硫酸溶液洗涤滤纸和沉淀，洗至滤液无色为止，滤液为富啡酸，用150ml三角瓶收集；以热的0.02mol/L氢氧化钠溶液溶解沉淀，溶解液收集于150ml三角瓶中，如前法酸化;胡敏酸和富啡酸溶液60°C条件下水浴蒸干，以便下一步测定碳含量;离心管中残余土用去离子水洗洗涤，4000转离心5分钟，此操作重复3次，保留以便下一步提取；
[0055]e.易提取态球囊霉素相关蛋白EE-GRSP和柠檬酸钠易提取态可溶性有机质EE-DOC的提取:上述残余土中加入20ml浓度为0.02mol/L，pH值为7的柠檬酸钠溶液，121°C高压蒸汽处理30min，5600转离心20分钟，上清液转移到三角瓶中，参与物质用去离子水洗涤3遍，离心，上清液合并到三角瓶中；三角瓶中的溶液用浓度为0.lmol/L的盐酸溶液将pH值调节到2.1，冰浴60分钟，溶液中产生大量沉淀;将溶液过滤，滤液为EE-DOC，滤液收集到10ml容量瓶中定容;滤纸上的固态物质便是EE-GRSP，再用0.1moI/L的氢氧化钠溶液将其溶解到10ml三角瓶中，60°C水浴蒸至近干;将容量瓶中的EE-DOC溶液吸取20ml移入10ml三角瓶中，60°C下水浴蒸至近干；由于EE-DOC溶解在柠檬酸钠溶液中，柠檬酸钠的碳含量高，直接测定碳含量对试剂的需求量太大，因此，需要定容后从中量取20ml以备测定碳含量；
[0056]f.难提取态球囊霉素相关蛋白HE-GRSP和柠檬酸钠难提取态可溶性有机质HE-D0C的提取:上述残余土中加入20ml浓度为0.05mol/L，pH值为8的柠檬酸钠溶液，121°C高压蒸汽处理90min，5600转离心20分钟，上清液转移到250ml三角瓶中，重新添加浸提液，混匀加热，直到红棕色很淡，一般重复5次热抽提，个别含量很高的土壤需要增加次数;残余土用去离子水洗涤3遍，离心，上清液合并到三角瓶中；三角瓶中的溶液用浓度为0.lmol/L的盐酸溶液将PH值调节到2.1，冰浴60分钟，溶液中产生大量沉淀;将溶液过滤，滤液是HE-DOC，滤液收集到10ml容量瓶中定容；滤纸上的固态物质便是难提取态球囊霉素相关蛋白，再用
0.lmol/L的氢氧化钠溶液将其溶解到10ml三角瓶中，60°C水浴蒸至近干;将容量瓶中的溶液吸取20ml移入10ml三角瓶中，60°C下水浴蒸至近干；
[0057]g.残余态有机组分Residual和结合态黑炭B-BC的提取:将上述残余土风干品均分成两份，其中一份用于残余态有机组分的测定;另一份转入离心管中，加入6ml浓度为3moI/L的盐酸溶液，室温下反应24小时，除去碳酸盐，5000转离心10分钟，倒掉上清液;加入6ml浓度为lOmol/L的氢氟酸，室温下反应24小时，除去硅酸盐;5000转离心10分钟，倒掉上清液；加入6ml浓度为10mol/L的盐酸溶液，室温下反应24小时，除去可能生成的氟化钙，5000转离心10分钟，倒掉上清液;剩余样品转入50ml三角瓶中，加入6ml重铬酸钾和硫酸的混合液其中重络酸钾的浓度为0.lmol/L,硫酸的浓度为2mol/L，在温度为55± TC的条件下反应60小时，用去离子水冲洗转入离心管中，5000转离心20分钟，弃去上清液，用去离子水清洗3次，剩余物质就是B-BC;
[0058]将黑炭样品用去离子水冲洗转入10ml三角瓶中，60°C水浴蒸至近干。
[0059]本发明所述各有机组分碳含量的测定方法如下:步骤&、13、(3、(1、64^中的各组份在水浴蒸至近干的三角瓶中，分别加入5ml的重铬酸钾溶液和5ml的浓硫酸摇匀，瓶口放置弯颈漏斗，放于190-200°C的油浴上加热，使三角瓶中溶液微沸，弯颈漏斗下端落下第一滴冷凝液开始计时，消煮5分钟；取下三角瓶冷却片刻，用去离子水洗冷凝器内壁以及下端外壁，洗涤液收集于原三角瓶中；加入2-3滴邻菲罗啉指示剂，用硫酸亚铁滴定剩余的重铬酸钾，溶液颜色由橙黄—绿—棕色为止，即为终点；如果样品滴定所用硫酸亚铁的毫升数达不到空白标定所用的硫酸亚铁毫升数的1/3时，则应增加重铬酸钾溶液与硫酸的体积，两种溶液的体积比为I: 1.每批样品分析时必须做两个空白，取0.5g粉末状二氧化硅代替有机组分，其它步骤与测定有机组分相同；测定结果取平均值。
[0060]四、本发明各有机组分碳含量的计算如下:
[0061 ] C= ((c*Vi/Vo)*(Vo-V)*M*10—3*1.l*100/m)*(V2/V3)
[0062]式中:C一一重铬酸钾法测得的碳含量；
[0063 ] C一一重铬酸钾(I /6K2Cr207)标准溶液的浓度，单位:mo I /L;
[0064]Vi一一加入重铬酸钾标准溶液的体积，单位:ml;
[0065]Vo 空白标定用去硫酸亚铁的体积，单位:ml ；
[00??] V 滴定土样用去硫酸亚铁溶液体积，单位:ml ；
[0067]V2一一腐殖酸、易提取态可溶性有机质和难提取态可溶性有机质定容体积，单位:ml ；
[0068]V3一一腐殖酸、易提取态可溶性有机质和难提取态可溶性有机质用于测定的体积，单位:ml ；
[0069]M——1/4C的摩尔质量，M(1/4C) =3g/mol ；
[0070]10 3 将ml换算成L的系数；
[0071]1.1一一氧化校正系数；
[0072]关于计算EE-DOC和HE-DOC碳含量的说明:计算柠檬酸钠易提取态可溶性有机组分和柠檬酸钠难提取态可溶性有机组分的碳含量是要注意去掉柠檬酸钠的含碳量，在以上计算结果的基础上，将含碳量带入一下计算公式得到C.即为柠檬酸钠提取可溶性有机质的含量；
[0073]Cdqc= (C-(20*Co*12*6*10—3) )*5/m
[0074]C一一重铬酸钾法测得的碳含量；
[0075]Cdoc一一柠檬酸钠提取可溶性有机质的含量；
[0076]V4 提取液的用量20ml;
[0077]Co——柠檬酸钠的浓度，单位mol/L
[0078]本发明所述的颗粒态黑炭(POM-BC)属于土壤黑炭，分离出来的颗粒有机质经过低浓度重铬酸钾和浓硫酸的混合液的处理剩余的组分就是颗粒态黑炭。这部分黑炭由于自身密度小，在提取土壤颗粒有机质时被同时提出。因此，从提取方法的角度定义，颗粒态黑炭也是土壤颗粒有机质的一部分。由于以往的研究没有认识到颗粒态黑炭的存在，在颗粒态有机质测定时没有考虑这部分黑炭。实际上颗粒态黑炭可以占黑炭总量的很大一部分。
[OO79 ]本发明所述的结合态黑炭(B-BC)是和土壤中矿物质结合的土壤黑炭；
[0080]本发明所述的黑碳总量是土壤颗粒态黑炭加上结合态黑炭的和。
[0081]本发明所述的难提取态球囊霉素相关蛋白(HE-GRSP)是在提取易提取态球囊霉素相关蛋白(EE-GRSP)之后，改变提取条件后进一步提取出来的球囊霉素相关蛋白；
[0082]本发明所述的柠檬酸钠易提取态可溶性有机质(EE-DOC)是在提取易提取态球囊霉素相关蛋白(HE-GRSP)的过程中，伴随提出了一部分有机组分，这种有机组分在酸性条件下不会发生沉淀，把这部分有机组分命名为柠檬酸钠易提取态可溶性有机质(EE-DOC)。在提取易提取态球囊霉素相关蛋白(HE-GRSP)的过程中，将柠檬酸钠提取液进行酸化出现沉淀后，溶液仍然带有较深的颜色，将这部分物质通过重铬酸钾氧化法测定有机质含量，所得结果减去柠檬酸钠碳含量之后发现，仍然剩余一部分碳的量，这表明提取土壤EE-DOC的过程中伴随提出了一部分有机组分，这种有机组分在酸性条件下不会发生沉淀，把这部分有机组分命名为柠檬酸钠易提取态可溶性有机质(EE-DOC)。
[0083]本发明所述的柠檬酸钠难提取态可溶性有机质(HE-DOC):在提取难提取态球囊霉素相关蛋白(HE-GRSP)的过程中，伴随提出了一部分有机组分，这种有机组分在酸性条件下不会发生沉淀，把这部分有机组分命名为柠檬酸钠难提取态可溶性有机质(EE-D0C)。在提取难提取态球囊霉素相关蛋白(HE-GRSP)的过程中，将柠檬酸钠提取液进行酸化出现沉淀后，溶液仍然带有较深的颜色，将这部分物质通过重铬酸钾氧化法测定有机质含量，所得结果减去柠檬酸钠碳含量之后发现，仍然剩余一部分碳的量，这表明提取土壤EE-DOC的过程中伴随提出了一部分有机组分，这种有机组分在酸性条件下不会发生沉淀，把这部分有机组分命名为柠檬酸钠难提取态可溶性有机质(EE-DOC)。
[0084]上述本发明在传统的有机质分类中将提取球囊霉素相关蛋白时柠檬酸钠提取液中未发生沉淀的物质也纳为土壤有机质的一个组分，暂命名为柠檬酸钠可提取态可溶性有机质。
[0085]本发明所述的颗粒有机质(POM)主要是来自于动植物残体的半分解产物，是没有与土壤矿质土粒以化学键紧密结合在一起的不稳定土壤有机质。
[0086]本发明所述的颗粒有机质是传统方法提取得到的颗粒有机质去掉黑炭后的部分。传统方法提取得到的颗粒有机质中分离出了黑炭，而从颗粒有机质的组成成分的定义来讲，不包括黑炭，传统颗粒有机质提取法得到的物质叫做颗粒态有机质和颗粒态黑炭的混合物。
[0087]本发明所述的土壤黑炭包括颗粒态黑炭和结合态黑炭两部分。从传统的定义认为，土壤黑炭是化石燃料和生物质不完全燃烧产生的富含碳元素的有机连续统一体，包括从轻度碳化的易分解的生物质到高度抗芳香化的抗分解石墨碳和烟尘颗粒等。近期人为活动产生的黑炭密度较轻，随颗粒有机质提取出来，为颗粒态黑炭;早期地质年代自然产生的黑炭，在自然条件下与土壤矿物质长期相互作用，形成结合态黑炭。
[0088]关于计算颗粒态有机质碳含量的说明:
[0089]本发明中的颗粒态有机质(POM)是指传统方法提取得到的颗粒有机质(即本发明中的颗粒有机质和颗粒态黑炭的混合物)去掉黑炭所剩的部分。因此，POM的碳含量是用本发明中颗粒有机质和颗粒态黑炭的混合物的碳含量减去颗粒态黑炭的碳含量而得到的值。
[0090]关于计算土壤总的黑炭碳含量的说明:
[0091]土壤黑炭是由颗粒态黑炭和结合态黑炭两部分组成的。因此土壤中总的黑炭的碳含量是颗粒态黑炭和结合态黑炭碳含量相加的和。
[0092]利用传统方法对土壤有机组分进行提取:
[0093]样品采集与预处理、溶液配制以及各组分有机质含碳量测定与本发明的相关操作相同，不同之处在于直接对称量好的土样进行提取，而不是按照一定顺序进行连续提取。
[0094]实验结果如下:
[0095]图2是连续提取法与传统提取法对照表。胡敏酸与富啡酸、颗粒有机质与黑炭的提取结果。连续提取方法与传统方法相比，胡敏酸、富啡酸与颗粒有机质之间的碳含量没有差异。连续提取法颗粒有机质与残余组分中均提出了黑炭，两部分碳含量之和与传统方法之间差异不大。
[0096]图3是连续提取法与传统提取法易提取态球囊霉素相关蛋白、柠檬酸钠易提取态可溶性有机质、难提取态球囊霉素相关蛋白、难溶性柠檬酸钠可溶性有机质提取结果对照表。连续提取与传统提取方法相比，以上4种有机组分的碳含量均小于传统方法，这说明传统方法利用柠檬酸钠溶液提取到的土壤有机组分和胡敏酸、富啡酸之间存在重叠、连续提取的方法解决了不同有机组分之间重叠的问题。
[0097]图4是有机组分提取率对照表。连续提取试验中将颗粒有机质、胡敏酸、富啡酸、易提取态球囊霉素相关蛋白、柠檬酸钠易提取态可溶性有机质、难提取态球囊霉素相关蛋白、难溶性柠檬酸钠可溶性有机质之和除以土壤有机质总量计算其有机组分提取率。传统提取方式中，选取提取量最大的组分除以土壤有机质总量记为最大提取率。实验结果表明，连续提取中有机组分的提取率大于传统方法的最大提取率，说明连续提取的方法能够更加充分的将土壤有机组分提取出来。
[0098]连续提取试验中将颗粒有机质、胡敏酸、富啡酸、易提取态球囊霉素相关蛋白、柠檬酸钠易提取态可溶性有机质、难提取态球囊霉素相关蛋白、难溶性柠檬酸钠可溶性有机质、残余态有机组分之和除以土壤有机质总量计算回收率。样品的平均回收率为109.05±3.29%。
【主权项】
1.一种土壤中不同有机组分的连续提取方法，其特征在于所述的连续提取步骤如下: 一、土壤样品的采集与预处理； 二、试剂的配制； 三、不同有机组分的连续提取； 所述不同有机组分的连续提取包括如下步骤: a.游离态颗粒有机质和游离态黑炭的混合物的提取:取土样2.5克到50ml塑料离心管中，加入20ml密度为1.7g/cm3的碘化钠溶液，振荡I小时，5600转离心20分;这种操作重复3次，直到悬浮液中没有悬浮物质为止;悬浮物质在0.7um的滤纸下过滤，用真空栗抽干，先用70ml左右0.0lmol/L的氯化钙冲洗，再用去离子水洗直到电导率〈50yS/cm;样品转移到150ml三角瓶中，离心管中残余土保留以便下一步提取；测定提取物碳含量时应把转移到150ml三角瓶中的样品，在60°C条件下水浴蒸干； b.闭蓄态颗粒有机质和闭蓄态黑炭的混合物的提取:将上一步提取的残余土，加入20ml密度为1.7g/cm3的碘化钠溶液，用450J/ml的超声波处理I小时，温度控制在40°C以下，5600转离心20分;这种操作重复3次，直到悬浮液中没有悬浮物质为止;悬浮物质在0.7um的滤纸下过滤，用真空栗抽干，先用70ml左右0.01mol/L的氯化钙冲洗，再用去离子水洗直到电导率〈50yS/cm;样品转移到150ml三角瓶中，离心管中残余土用去离子水洗洗涤，4000转离心5分钟，此操作重复3次，保留以便下一步提取;测定提取物碳含量时应把转移到150ml三角瓶中的样品，在60°C条件下水浴蒸干； c.颗粒态黑炭POM-BC的提取:将步骤a和步骤b得到的混合物合并，加入6ml重铬酸钾和硫酸的混合液，其中重铬酸钾的浓度为0.1mo I/L，硫酸的浓度为2mo I/L，在温度为55 土 1°C的条件下反应60小时，用去离子水冲洗转入离心管中，5000转离心20分钟，弃去上清液，用去离子水清洗3次，剩余物质就是POM-BC;测定提取物碳含量时应把转移到150ml三角瓶中的样品，在60°C条件下水浴蒸干； d.胡敏酸HA和富啡酸FA的提取:在步骤b的残余土中加入0.1mo I/L的焦磷酸钠和0.lmol/L的氢氧化钠混合液20ml，通入氮气5分钟，震荡12小时;4500转离心10分钟，上清液转入10ml容量瓶中，这一步骤重复3-5次，直到上清液无色为止，定容，此时容量瓶中收集的物质为腐殖酸:胡敏酸和富啡酸;吸取滤液40ml于烧杯中，置于沸水浴上加热，在玻璃棒搅拌下滴加3mol/L的硫酸溶液酸化，直至有絮状沉淀为止，继续加热10分钟使胡敏酸完全沉淀；以0.02mol/L的硫酸溶液洗涤滤纸和沉淀，洗至滤液无色为止，滤液为富啡酸，用150ml三角瓶收集；以热的0.02mol/L氢氧化钠溶液溶解沉淀，溶解液收集于150ml三角瓶中，如前法酸化;胡敏酸和富啡酸溶液60°C条件下水浴蒸干，以便下一步测定碳含量;离心管中残余土用去离子水洗洗涤，4000转离心5分钟，此操作重复3次，保留以便下一步提取； e.易提取态球囊霉素相关蛋白EE-GRSP和柠檬酸钠易提取态可溶性有机质EE-DOC的提取:上述残余土中加入20ml浓度为0.02mol/L，pH值为7的柠檬酸钠溶液，121°C高压蒸汽处理30min，5600转离心20分钟，上清液转移到三角瓶中，参与物质用去离子水洗涤3遍，离心，上清液合并到三角瓶中；三角瓶中的溶液用浓度为0.lmol/L的盐酸溶液将pH值调节到2.1，冰浴60分钟，溶液中产生大量沉淀;将溶液过滤，滤液为EE-DOC，滤液收集到I OOml容量瓶中定容;滤纸上的固态物质便是EE-GRSP，再用0.1moVL的氢氧化钠溶液将其溶解到10ml三角瓶中，60°C水浴蒸至近干;将容量瓶中的EE-DOC溶液吸取20ml移入10ml三角瓶中，60°C下水浴蒸至近干；由于EE-DOC溶解在柠檬酸钠溶液中，柠檬酸钠的碳含量高，直接测定碳含量对试剂的需求量太大，因此，需要定容后从中量取20ml以备测定碳含量； f.难提取态球囊霉素相关蛋白HE-GRSP和柠檬酸钠难提取态可溶性有机质HE-DOC的提取:上述残余土中加入20ml浓度为0.05mol/L，pH值为8的柠檬酸钠溶液，121°C高压蒸汽处理90min，5600转离心20分钟，上清液转移到250ml三角瓶中，重新添加浸提液，混匀加热，直到红棕色很淡，一般重复5次热抽提，个别含量很高的土壤需要增加次数;残余土用去离子水洗涤3遍，离心，上清液合并到三角瓶中；三角瓶中的溶液用浓度为0.lmol/L的盐酸溶液将pH值调节到2.1，冰浴60分钟，溶液中产生大量沉淀;将溶液过滤，滤液是HE-DOC，滤液收集到10ml容量瓶中定容；滤纸上的固态物质便是难提取态球囊霉素相关蛋白，再用0.lmol/L的氢氧化钠溶液将其溶解到10ml三角瓶中，60°C水浴蒸至近干;将容量瓶中的溶液吸取20ml移入10ml三角瓶中，60°C下水浴蒸至近干； g.残余态有机组分Residual和结合态黑炭B-BC的提取:将上述残余土风干品均分成两份，其中一份用于残余态有机组分的测定；另一份转入离心管中，加入6ml浓度为3mol/L的盐酸溶液，室温下反应24小时，除去碳酸盐，5000转离心10分钟，倒掉上清液;加入6ml浓度为lOmol/L的氢氟酸，室温下反应24小时，除去硅酸盐;5000转离心10分钟，倒掉上清液;加入6ml浓度为lOmol/L的盐酸溶液，室温下反应24小时，除去可能生成的氟化钙，5000转离心10分钟，倒掉上清液;剩余样品转入50ml三角瓶中，加入6ml重铬酸钾和硫酸的混合液其中重络酸钾的浓度为0.lmol/L,硫酸的浓度为2mol/L，在温度为55± TC的条件下反应60小时，用去离子水冲洗转入离心管中，5000转离心20分钟，弃去上清液，用去离子水清洗3次，剩余物质就是B-BC;将黑炭样品用去离子水冲洗转入10ml三角瓶中，60°C水浴蒸至近干； 四、步骤三提取出的有机组分碳含量的测定； 五、步骤三提取出的有机组分碳含量的计算。2.根据权利要求1所述的土壤中不同有机组分的连续提取方法，其特征在于所述的步骤四中有机组分碳含量的测定方法如下:步骤a、b、c、d、e、f、g中的各组份在水浴蒸至近干的三角瓶中，分别加入5 m I的重铬酸钾溶液和5 m I的浓硫酸摇匀，瓶口放置弯颈漏斗，放于190-200°C的油浴上加热，使三角瓶中溶液微沸，弯颈漏斗下端落下第一滴冷凝液开始计时，消煮5分钟;取下三角瓶冷却片刻，用去离子水洗冷凝器内壁以及下端外壁，洗涤液收集于原三角瓶中；加入2-3滴邻菲罗啉指示剂，用硫酸亚铁滴定剩余的重铬酸钾，溶液颜色由橙黄—绿—棕色为止，即为终点；如果样品滴定所用硫酸亚铁的毫升数达不到空白标定所用的硫酸亚铁毫升数的1/3时，则应增加重铬酸钾溶液与硫酸的体积，两种溶液的体积比为I: 1.每批样品分析时必须做两个空白，取0.5g粉末状二氧化硅代替有机组分，其它步骤与测定有机组分相同；测定结果取平均值。3.根据权利要求1所述的土壤中不同有机组分的连续提取方法，其特征在于所述的步骤五有机组分碳含量的计算如下: C= ((c*Vi/Vo)*(Vo_V)*M*10—3*1.l*100/m)*(V2/V3) 式中:C一一重铬酸钾法测得的碳含量； C——重铬酸钾(l/6K2Cr207)标准溶液的浓度，单位:mol/L; Vi一一加入重铬酸钾标准溶液的体积，单位:ml; Vo 空白标定用去硫酸亚铁的体积，单位:ml ； V 滴定土样用去硫酸亚铁溶液体积，单位:ml ； V2—一腐殖酸、易提取态可溶性有机质和难提取态可溶性有机质定容体积，单位:ml; V3—一腐殖酸、易提取态可溶性有机质和难提取态可溶性有机质用于测定的体积，单位:ml ； M——1/4C的摩尔质量，M( 1/4C) = 3g/mol ； 10 3 将ml换算成L的系数； I.I—氧化校正系数； 关于计算EE-DOC和HE-DOC碳含量的说明:计算柠檬酸钠易提取态可溶性有机组分和柠檬酸钠难提取态可溶性有机组分的碳含量是要注意去掉柠檬酸钠的含碳量，在以上计算结果的基础上，将含碳量带入一下计算公式得到Cdqc即为柠檬酸钠提取可溶性有机质的含量；Cdoc= (C_(20*Co*12*6*10—3) )*5/mC一一重铬酸钾法测得的碳含量； Cdoc--朽1檬酸钠提取可溶性有机质的含量； V4 提取液的用量20ml ； Co——柠檬酸钠的浓度，单位mol/L。4.根据权利要求1所述的土壤中不同有机组分的连续提取方法，其特征在于所述的步骤一土壤样品的采集与预处理方法为:土壤样品风干后过0.25mm筛，备用。5.根据权利要求1所述的土壤中不同有机组分的连续提取方法，其特征在于所述的步骤二中的试剂配制方法为: (1)碘化钠溶液，密度为I.7g/cm3:将1200g碘化钠溶于水中，用IL的容量瓶定容； (2)氯化妈溶液，浓度为0.0 lmol/L; (3)焦磷酸钠和氢氧化钠混合液:焦磷酸钠和氢氧化钠的浓度均为0.lmol/L; (4)硫酸溶液，浓度约为3mol/L:量取163ml浓硫酸定容到1L; (5)硫酸溶液，浓度为0.02mol/L:吸取将溶液(4)66.7ml，定容到IL; (6)氢氧化钠溶液，浓度为0.02mol/L; (7)柠檬酸钠溶液，浓度为0.02mol/L，pH值为7; (8)柠檬酸钠溶液，浓度为0.05mol/L，pH值为8; (9)盐酸溶液，浓度为0.lmol/L:吸取8.33ml浓盐酸，定容到IL; (10)盐酸溶液，浓度为3mol/L:量取125ml浓盐酸，定容到500ml; (11)氢氟酸溶液，浓度为lOmol/L:用塑料量筒量取150ml纯氢氟酸，用500ml塑料容量瓶定容； (12)盐酸溶液，浓度为lOmol/L:量取417ml浓盐酸，定容到500ml; (13)重络酸钾和硫酸的混合液:重络酸钾浓度为0.lmol/L，硫酸浓度为2mol/L; (14)重铬酸钾标准液，l/6K2Cr207)=0.8mol/L:将重铬酸钾试剂在烘箱中，105°C条件下烘干3小时，取出后在干燥器中冷却8小时，冷却后称取39.225g，在水中加热溶解，冷却后用水定容至1L; (15)硫酸亚铁溶液，FeSO4，0.2mol/L: 56.0g硫酸亚铁，FeSO4^H2O，化学纯，溶于水，加入15ml浓硫酸，用水定容至IL; (16)邻啡罗啉试剂:1.485g邻啡罗啉试及0.695g硫酸亚铁溶于10ml水，在棕色瓶中保 存。
【文档编号】G01N21/79GK106093289SQ201610580157
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月22日 公开号201610580157.5, CN 106093289 A, CN 106093289A, CN 201610580157, CN-A-106093289, CN106093289 A, CN106093289A, CN201610580157, CN201610580157.5
【发明人】吴蔚东, 兰天, 王海龙
【申请人】海南大学