人皮肤中主要纤维成分网状结构三维可视模型的制作方法
【专利摘要】本发明属于组织解剖学【技术领域】，具体涉及人皮肤中主要纤维成分网状结构三维可视模型。本发明的技术方案是人皮肤中主要纤维成分网状结构三维可视模型，采用如下方法制备得到：a、组织切片；b、染色；c、图像采集；d、图像配准；e、图像二值化处理；f、三维重建可视化。本发明的模型可用于人皮肤中主要纤维成分网状结构的3D打印、仿生材料制备、皮肤生理功能的研究等。
【专利说明】人皮肤中主要纤维成分网状结构三维可视模型
【技术领域】
[0001]本发明属于组织解剖学【技术领域】，具体涉及人皮肤中主要纤维成分网状结构三维可视模型。
【背景技术】
[0002]医学图像三维重建技术是计算机图形学和图像处理在生物医学工程中的重要应用。在医学诊断学领域，计算机断层扫描(CO、核磁共振成像(MRI)等对人体组织器官进行三维重建后，可以呈现给医生立体直观的3D影像，便于医生诊断病情，确定治疗方案；在生物医学领域，各种新型三维重建技术和仪器不断涌现，如微计算机断层扫描技术(Micro-CT)、激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)等。
[0003]但是，目前的三维重建技术有诸多不足:首先，对软组织三维重建能力较差。皮肤中胶原纤维、弹性纤维难以成像；其次，CT、MRI分辨率较低。如计算机断层扫描(CT)空间分辨率为约400微米，因此难以辨认微观组织结构；激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)虽有较高分辨率(小于I微米)，但是存在荧光标记不均匀等问题。
[0004]皮肤是保护机体的重要的天然屏障，也是人体最大的器官。组织工程皮肤是体表皮肤缺损(烧伤、整形、美容)最理想的替代物之一。
[0005]目前组织工程皮肤支架根据有无细胞分类可分为含细胞支架和无细胞支架；根据支架层次分类分为单层支架和双层支架；根据原材料分类可分为天然材料支架和人工合成材料支架。天然材料支架是指以自然界中存在的(植物或者动物来源)蛋白质类、多聚糖等天然材料构建的支架。其中蛋白质包括胶原、纤连蛋白等，多聚糖类包括(藻朊酸盐、粘多糖、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、明胶等。如壳聚糖-明胶-透明质酸(Cs-Gel-HA)多孔支架、戊二醛交联的壳聚糖/胶原支架等。人工合成材料支架主要包括羟基乙酸衍生物、乳酸衍生物以及其他的聚酯纤维衍生物。目前报道的有乳酸-羟基乙酸-胶原网状聚合物、胶原-聚己内酯的复合薄膜、聚维酮(Povidone) -多糖等。
[0006]世界上第一种商品化的人工皮肤Integra (Life Science)是一种胶原类真皮替代品。它的下层是由牛的I型胶原蛋白与6-硫酸软骨素(GAG)复合交联而成，呈多孔状结构，孔径30-120um ;上层由娃橡胶薄膜制成。另一种人工皮肤Apligraf (Organogenesis)是由牛肌腱胶原提取的胶原蛋白交联，内含从新生儿包皮分离培养的成纤维细胞，同时表面种植上皮细胞。
[0007]然而，目前的组织工程产品尚有诸多不足，特别是仿生程度不高(皮肤支架纤维是随机分布的，与人体生理结构不同)，导致效果不尽人意。
[0008]2013年4月，第六届全国组织工程与再生医学大会(西安)中，曾有专家提出，材料学家难以制造高度仿生的生物支架，是因为解剖学家不能提供详尽的结构数据。令人遗憾的是，人皮肤中主要纤维(胶原纤维、弹性纤维)的空间分布的三维图尚未见报道。
【发明内容】
[0009]本发明要解决的技术问题是为人皮肤中主要纤维成分网状结构三维可视模型的建立提供一种新选择。
[0010]本发明的技术方案是人皮肤中主要纤维成分网状结构三维可视模型，采用如下方法制备得到:
[0011]a、组织切片:取新鲜尸体大腿内侧全层皮肤，固定液固定，石蜡包埋，切片；
[0012]b、染色:对步骤a中所得到的组织切片进行醛品红染色法染色；
[0013]C、图像采集:利用全景扫描显微镜扫描步骤b得到切片，获得切片全景图；
[0014]d、图像配准:从步骤c的全景图片中选取连续且包含同一个毛囊的图片，截取每张图片中的该毛囊区域为ROKRegion of Interest，即图片中需要处理的区域)，以该毛囊为配准标志以该毛囊为配准标志，利用Adobe PhotoshopCS5软件或者PhotoLinel8.01软件进行手工配准；
[0015]e、图像二值化处理:对步骤d中配准后的图像进行图像分割，分割出胶原纤维、弹性纤维的区域，利用 Matlab7.10.0 软件、Microsoft Visual Studio2008、MicrosoftVisual C++6.0、dev-c++5.5.3或linux系统下的GCC软件,分别获得胶原纤维、弹性纤维的二值图；
[0016]f、三维重建可视化:将步骤e得到的胶原纤维、弹性纤维的二值图分别导入三维可视化软件；由此可分别导出胶原纤维、弹性纤维的三维数字模型，或/和得到包含上述两种纤维的三维数字模型。
[0017]其中，步骤a中切片200张，切片厚度为5?8μπι。小于5 μ m的切片容易损坏，难以制备；大于8 μ m的切片则会损失大量断层信息。
[0018]具体的,步骤a中固定液为Zamboni’s固定液,其配置方法为多聚甲醒20g,饱和苦味酸 150mL,加 Karasson-Schwlt’ sPB (Karasson-Schwlt，s 憐酸盐缓冲液)至 10OOmT,;其中 Karasson-Schwlt’ sPB 配置方法为，取 NaH2PO4.H203.31g, Na2HPO4.7H2033.77g，加双蒸水至 1000mL。
[0019]具体的，步骤b中醛品红染色法所需试剂包括醛品红染液、0.5%高锰酸钾溶液、1%草酸水溶液、50%酒精、70%酒精、95%酒精、100%酒精、1%亮绿溶液、二甲苯溶液；其中，醛品红染色配方为:碱性品红0.5g，浓盐酸lmL，三聚乙醛lmL，70%酒精100mL。
[0020]其中，步骤d中选取图片完整，无破损，无皱褶；纤维染色清晰，与周围对比鲜明的全景图片。
[0021]其中，步骤f中三维可视化软件为Materialise Mimicsl0.01软件,Thresholds设置为 Min: 226，Max: 3056。
[0022]本发明还提供了所述的人皮肤中主要纤维成分网状结构三维可视模型在3D打印中的用途。
[0023]本发明还提供了所述的人皮肤中主要纤维成分网状结构三维可视模型在仿生材料制备中的用途。
[0024]优选的，所述的仿生材料制备为皮肤仿生支架的设计。
[0025]本发明还提供了所述的人皮肤中主要纤维成分网状结构三维可视模型在皮肤生理功能研究中的用途。
[0026]具体的，所述的皮肤生理功能研究为皮肤纤维形态评估、纤维含量计算或皮肤力学特性分析。
[0027]本发明方法可以将皮肤中主要纤维成分(胶原纤维、弹性纤维)的网状结构清晰、直观、高分辨率的展示出来，皮肤显微结构清晰，分辨率高，分辨率小于I微米。所得到的模型高度仿生，纤维分布与正常人体相同。该三维模型可用于正常皮肤和疤痕组织中纤维形态评估，含量计算和其他生理功能研究。除皮肤之外，该方案可用于其它软组织、器官的三维重建，弥补常规影像学技术对于软组织重建的不足。该模型可以作为高仿生生物材料的模板。该三维模型有望应用于高仿生产业，制造与人体结构最相近的仿生皮肤。该模型可以直接导入3D打印机的控制系统，指导3D打印机进行打印操作。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1:新鲜尸体大腿内侧全层皮肤(固定于Zamboni’s固定液中)
[0029]图2:皮肤切片全景图(真皮层厚度约1.46mm，胶原纤维着绿色，弹性纤维着紫色，北京优纳PRECICS500)
[0030]图3a:带有毛囊的部分真皮区域(图中左下角毛囊为配准标志)
[0031]图3b:图像分割后，胶原纤维二值图
[0032]图3c:图像分割后，弹性纤维二值图
[0033]图4:人皮肤纤维成分网状结构三维可视模型(黄色代表胶原纤维模型，绿色代表弹性纤维模型)图4a:侧面图图4b:正面图
[0034]图5:人皮肤胶原纤维网状结构三维可视模型图5a:侧面图图5b:正面图
[0035]图6:人皮肤弹性纤维网状结构三维可视模型图6a:侧面图图6b:正面图
[0036]图7:3D打印机控制系统操作界面，左图打印中的界面，右图为打印完成后的界面
[0037]图8:3D打印机打印出的胶原纤维模型图8a:侧面图图8b:正面图
[0038]图9:真皮各层中胶原纤维分布图。真皮由浅到深，胶原纤维先增多，后减少。
[0039]图10:真皮各层中弹性纤维分布图。真皮由浅到深，弹性纤维先增多，后减少。
[0040]图11:染色后切片图像
[0041]图12:将图11图像划分为三部分。A:毛囊区B:毛囊附近C:远离毛囊区
[0042]图13:脱细胞真皮(ADM)内孔径分布图
[0043]图14:脱细胞真皮(ADM)内孔隙壁厚度分布图
[0044]图15 = MicroCT扫描人脱细胞真皮(ADM)图像比例尺:1mm
[0045]图15A:正面图图15B:横切面之一图15C:横切面之二
[0046]图15D:背面图图15E:纵切面之一图15F:纵切面之二
[0047]图15G:孔径分布图(不同颜色代表不同孔径大小)
[0048]图15H:孔径分布图纵切面之一
[0049]图151:孔径分布图纵切面之二
【具体实施方式】
[0050]图像配准精确度直接影响到三维重建的真实性。图像配准选取149张序号连续且包含同一个毛囊的图片。截取每张图片中的毛囊区域。以该毛囊为配准标志，利用AdobePhotoshop CS5软件进行手工配准。配准后的图像保存为BMP格式的图片(尺寸3140*3004，24位)。对于缺失或损坏的图片，则复制上一张图片来替代。也可以使用其他具有图像旋转、平移、透明化、填涂功能以及图层处理功能的其他图像处理软件，如PhotoLinelS.0l软件。
[0051]具体的，步骤a切片张数由切片厚度和目标模型厚度有关。如切片200张，厚度为5 μ m，则目标模型厚度为1000 μ m。
[0052]其中，步骤d中配准后的图像保存为BMP格式的图片，尺寸3140X3004,24位。具体的图片格式和尺寸可选择。其决定因素为:后期处理能力；目标模型的宽度；需包含完整的组织学结构。
[0053]其中，从步骤c的张全景图片中选取图片是的标准为:图片完整，无破损，无皱褶；纤维染色清晰，与周围对比鲜明。
[0054]其中，步骤e中图像分割后将图像尺寸转换为1024X979。具体的图片格式和尺寸可选择。其决定因素为:后期处理能力；目标模型的宽度；需包含完整的组织学结构。
[0055]本发明所使用的新鲜尸体指的是死亡24小时内的尸体，皮肤没有脱水，没有坏死。
[0056]实施例1采用本发明方法获得人皮肤中主要纤维成分网状结构三维可视模型
[0057]I)皮肤组织显微切片:取新鲜尸体大腿内侧全层皮肤(IcmXlcmXlcm，第三军医大学西南医院烧伤科皮库提供)，修剪皮肤边缘，利用Zamboni’s固定液固定(见图1)。将组织块进行脱水、透明、石蜡包埋后，利用组织切片机(Leica)连续切取切片200张。每张切片间距5微米。将切片平铺于防脱玻片(惠利试剂公司)中央，按切下的先后顺序标号。
[0058]Zamboni’s固定液配方:多聚甲醒20g,饱和苦味酸150mL,力口Karasson-Schwlt，sPB 至 1000ml。其中 Karasson-Schwlt，sPB 配方:NaH2P04.H203.31g,Na2HPO4.7Η2033.77g，加双蒸水至 1000mL。
[0059]2)胶原纤维、弹性纤维染色:对步骤I)中每张切片进行醛品红染色法染色，胶原纤维着绿色，弹性纤维着紫色。
[0060]醛品红染色法所需试剂:醛品红染液、0.5%高锰酸钾溶液、1%草酸水溶液、酒精(浓度分别为50%、70%、95%、100%)、1%亮绿溶液、二甲苯溶液。其中醛品红染色配方为:碱性品红0.5g，浓盐酸1ml，三聚乙醛lmL，70%酒精100mL。
[0061]3)切片全景图像采集:利用全景扫描显微镜(优纳科技UNIC Technologies Inc.赛睿PRECICS500系列全自动数字病理扫描系统物镜40倍武警总医院病理科)扫描步骤2)中每张切片，获得200张切片全景图，见图2。
[0062]4)图像配准:从步骤3)的200张切片全景图中，选取149张序号连续且包含同一个毛囊的图片。截取每张图片中的该毛囊区域为R0I。ROI:ff=4000,H=4000,Area =1140624(μ mX μ m)0以该毛囊为配准(图3a),利用Adobe PhotoshopCS5软件进行手工配准。配准后的图像保存为BMP格式的图片(尺寸3140 X 3004，24位)。对于缺失或损坏的图片，则复制上一张图片来替代。
[0063]5)图像二值化处理:对步骤4)中配准后的图像进行图像分割。目的是分割出胶原纤维、弹性纤维的区域。将图像尺寸转换为1024X979。利用Matlab7.10.0(R2010a, Mathfforks)软件，分别获得胶原纤维、弹性纤维的二值图(见图3b和3c)。
[0064]6)三维重建可视化:将步骤5)得到的胶原纤维、弹性纤维的二值图分别导入Materialise Mimicsl0.01 软件。Thresholds 设置为 Min: 226，Max: 3056。由此可分别导出胶原纤维、弹性纤维的三维数字模型，也可以得到包含上述两种纤维的三维数字模型。
[0065]三维模型截图为图4、5、6。可见胶原纤维较粗，结构致密；弹性纤维较细，结构疏松，与正常人体相同。
[0066]实施例2图像配准
[0067]I)打开Adobe PhotoshopCS5软件,导入I号图片(基准图片)。
[0068]2)导入2号图片，设置不透明度为50%_70%。打开自由变换功能(Ctrl+T)。以I号图片中的毛囊为配准标志，自由变换2号切片位置，使两张图片达到最大程度重合。恢复2号图片不透明度为100%。将2号图片保存为BMP格式(Ctrl+S)。
[0069]3)导入3号图片，依次按照上述方法操作。
[0070]按照上述操作，可以完成图像配准。
[0071 ] 实施例33D打印机打印该三维模型的可行性测试
[0072]以胶原纤维三维可视模型为例:
[0073]1、从Materialise Mimicsl0.01软件中导出重建好的胶原纤维三维可视模型(stl格式)。
[0074]2、将该模型导入3D打印机控制软件(第三军医大学西南医院关节外科组织工程中心Zprint450三维打印机)3D打印机控制系统操作界面见图7。
[0075]3、利用石膏粉末为原料，开始打印操作。打印完毕。耗时52分47秒，使用16.3mL胶水。打印出来的模型约为5cmX5cmXlcm。
[0076]打印完毕，如图8所示。缺口处为毛囊位置，可见大量孔隙结构。虽然打印原料为石膏粉，而非胶原纤维，但是该操作证实了利用3 D打印机打印该三维模型是可行的。
[0077]实施例4人皮肤真皮层中，由浅到深胶原纤维、弹性纤维分布规律分析
[0078]1、截取全景图中真皮层区域图片(R0I)。利用windows2007自带的画图软件,填充毛囊、污点、汗腺等非纤维成分为白色。
[0079]2、利用Matlab7.10.0 (R2010a, Mathfforks)软件,将真皮层平均分为10层，计算每一层中，胶原纤维像素、弹性纤维像素与该层总像素的比值，结果见表1。
[0080]3、同方法2，将真皮层平均分为100层，计算每一层中，胶原纤维像素、弹性纤维像素与该层总像素的比值，结果见图9和图10。
[0081]4、利用SPSS13.0软件对数据进行数理统计分析。
[0082]表1真皮分层情况分析
[0083]
【权利要求】
1.人皮肤中主要纤维成分网状结构三维可视模型，其特征在于:采用如下方法制备得到: a、组织切片:取新鲜尸体大腿内侧全层皮肤，固定液固定，石蜡包埋，切片； b、染色:对步骤a中所得到的组织切片进行醛品红染色法染色； C、图像采集:利用全景扫描显微镜扫描步骤b得到切片，获得切片全景图； d、图像配准:从步骤c的全景图片中选取连续且包含同一个毛囊的图片，截取每张图片中的该毛囊区域为ROI ;以该毛囊为配准标志，利用Adobe PhotoshopCS5软件或PhotoLinel8.01软件进行手工配准； e、图像二值化处理:对步骤d中配准后的图像进行图像分割，分割出胶原纤维、弹性纤维的区域，利用 Matlab7.10.0 软件、Microsoft Visual Studio2008、MicrosoftVisualC++6.0或dev_c++5.5.3、linux系统下的GCC软件,分别获得胶原纤维、弹性纤维的二值图； f、三维重建可视化:将步骤e得到的胶原纤维、弹性纤维的二值图分别导入三维可视化软件Materialise Mimicsl0.01或Amira5.4.3软件；由此可分别导出胶原纤维、弹性纤维的三维数字模型，或/和得到包含上述两种纤维的三维数字模型。
2.如权利要求1所述的人皮肤中主要纤维成分网状结构三维可视模型，其特征在于:步骤a中切片厚度为5~8 μ m。
3.如权利要求1或2所述的人皮肤中主要纤维成分网状结构三维可视模型，其特征在于:步骤a中固定液为Zamboni’ s固定液,其配置方法为多聚甲醒20g,饱和苦味酸150mL,加Karasson-Schwlt’ s憐酸盐缓冲液至10OOmT,;其中Karasson-Schwlt’ sPB配置方法为，取 NaH2PO4.Η203.31g, Na2HPO4.7Η2033.77g，加双蒸水至 1000mL0
4.如权利要求1~3任一项所述的人皮肤中主要纤维成分网状结构三维可视模型，其特征在于:步骤b中醛品红染色法所需试剂包括醛品红染液、0.5%高锰酸钾溶液、1%草酸水溶液、50%酒精、70%酒精、95%酒精、100%酒精、1%亮绿溶液、二甲苯溶液；其中，醛品红染色配方为:碱性品红0.5g，浓盐酸lmL，三聚乙醛lmL，70%酒精100mL。
5.如权利要求1~4任一项所述的人皮肤中主要纤维成分网状结构三维可视模型，其特征在于:步骤d中选取图片完整，无破损，无皱褶；纤维染色清晰，与周围对比鲜明的全景图片。
6.如权利要求1~5任一项所述的人皮肤中主要纤维成分网状结构三维可视模型，其特征在于:步骤f中三维可视化软件为Materialise Mimicsl0.01软件，Thresholds设置为 Min:226, Max:3056。
7.权利要求1~6任一项所述的人皮肤中主要纤维成分网状结构三维可视模型在3D打印中的用途。
8.权利要求1~6任一项所述的人皮肤中主要纤维成分网状结构三维可视模型在仿生材料制备中的用途。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于:所述的仿生材料制备为皮肤仿生支架的设计。
10.权利要求1~6任一项所述的人皮肤中主要纤维成分网状结构三维可视模型在皮肤生理功能研究中的用途。
11.如权利要求10所述的用途，其特征在于:所述的皮肤生理功能研究为皮肤纤维形态评估、纤维含量计算或皮肤力学特性分析。
【文档编号】G06T19/00GK103761771SQ201410036372
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月24日 优先权日:2014年1月24日
【发明者】王玉振, 徐瑞, 贺伟峰, 罗高兴, 吴军 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院