本发明涉及基因表达谱分析技术领域，特别涉及一种利用mRNA表达谱与竞争性内源RNA表达谱联合筛选蒽环类药物心脏毒性基因的方法。
背景技术：
中国所有浸润性乳腺癌患者中大约81.4％接受了辅助化疗并有较高肿瘤治愈率。然而，乳腺癌患者长期存活者目前存在的问题：心脏原因引起的死亡率增高8.2倍；长期存活的患者发生心衰的风险性高15倍，心血管疾病发生风险高10倍。2015年NCCN乳腺癌指南首选辅助化疗方案AC×4→T(P)×4(吡柔比星/环磷酰胺-紫杉醇)，蒽环类因其抗瘤谱广、抗瘤活性强，在肿瘤化疗中获得较高评价。该类药物最突出的化疗毒副反应为心脏毒性(Anthracycline-Induced Cardiotoxicity，AIC)，主要表现为严重的急性、慢性、迟发性心肌毒性。蒽环类药物没有绝对的“安全剂量”，可能是因为存在着个体差异，即患者体内代谢蒽环类药物相关基因的差异性导致其对蒽环类药物的易感性不同。蒽环类药物的心脏毒性临床治疗困难，疗效不理想，重点在于早期检测，积极预防。
目前，蒽环类药物心脏毒性的防治手段包括：
心内膜心肌活检(EMB)，其是一种评估蒽环类心脏毒性最敏感、最特异的方法，但是因为是有创性检查和技术要求高，临床应用受到极大的限制；
无创性监测，其广泛应用于临床，主要是用于监测心功能变化，如超声心动图和MUGA等。但是，无创性监测通常只能在较为晚期阶段检测出心脏毒性。
技术实现要素：
本发明要解决现有技术中蒽环类药物的心脏毒性的无创性监测只能在较为晚期阶段检测出，导致临床治疗困难，疗效不理想的技术问题，提供一种利用mRNA表达谱与竞争性内源RNA表达谱联合筛选蒽环类药物心脏毒性基因的方法。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案具体如下：
一种利用mRNA表达谱与竞争性内源RNA表达谱联合筛选蒽环类药物心脏毒性基因的方法，包括以下步骤：
步骤1、通过mRNA和竞争性内源RNA表达谱芯片检测到大量基因的表达值，对所有基因的相关性进行排序，去除在所有样本中表达量RPKM均值小于1的低相关度基因，留下与蒽环类药物心脏毒性分类RPKM均值1以上的密切相关的基因；
步骤2、将获取的mRNA和竞争性内源RNA特征基因进行合并，形成基因池；
步骤3、通过遗传算法，对所述基因池进一步选择基因，消除冗余基因，搜索获得一个最优特征的最优基因集；
步骤4、通过比较乳腺癌患者、乳腺癌AIC患者及正常人mRNA与竞争性内源RNA联合表达谱不同，样本间的数据从而选出差异表达的基因；基于差异表达基因进行分析；
步骤5、对差异表达基因预测，挑选score大于140，自由能小于-20的作为可靠的靶基因；再从靶基因中挑选P值小于0.05的，用剩余部分RNA对构建的乳腺癌蒽环类药物心脏毒性发病目的靶基因进行验证。
在上述技术方案中，步骤1中对所有基因的相关性进行排序的方法具体为采用过滤式特征基因选择方法：分别去除mRNA和竞争性内源RNA表达谱芯片中1000～2000个低相关度基因，留下100～200个与蒽环类药物心脏毒性分类密切相关的基因，分别在mRNA和竞争性内源RNA表达谱中选取得分最高的10～50个基因。
在上述技术方案中，步骤3中的所述最优基因集具有1～10个的基因数量。
在上述技术方案中，步骤4中基于差异表达基因进行的分析具体包括：差异基因表达模式聚类分析，Gene Ontology功能显著性富集分析，Pathway显著性富集分析，以及蛋白互作网络分析。
在上述技术方案中，所述竞争性内源RNA为miRNA、lncRNA或者cirRNA。
本发明具有以下的有益效果：
本发明的利用mRNA表达谱与竞争性内源RNA表达谱联合筛选蒽环类药物心脏毒性基因的方法，联合mRNA表达谱和竞争性内源RNA表达谱芯片筛选蒽环类药物给药前、后罹患心脏毒性的基因表达谱，候选出更为可靠的与蒽环类药物心脏毒性相关的潜在基因标志物。从多层面、多角度揭示蒽环类药物心脏毒性的分子生物学改变的缺陷，对理解蒽环类药物心脏毒性发生、发展机制以及研发诊断、判断预后的分子标志物和治疗靶标起到很大帮助，充分发挥了有效的作用。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
图1为本发明的利用mRNA表达谱与竞争性内源RNA表达谱联合筛选蒽环类药物心脏毒性基因的方法的步骤示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做以详细说明。
本发明的利用mRNA表达谱与竞争性内源RNA表达谱联合筛选蒽环类药物心脏毒性基因的方法，以利用mRNA表达谱与miRNA表达谱为例，包括以下的步骤：
一.外周血的采集及mRNA基因表达谱和miRNA基因表达谱的获得
1.对象
2016年1月-2016年12月在某院肿瘤科收集应用化疗前且未出现心脏毒性乳腺癌患者及应用蒽环类药物后出现心脏毒性患者的血清标本各6例，同期收集10例健康志愿者作为对照(其中每组3人提取的总RNA标本用于测序检测外周血单个核细胞基因表达谱和miRNA表达谱，其余人用于目的基因qPCR验证)。3组研究对象间性别、年龄无统计学差异。
蒽环类药物心脏毒性评价标准：指具有下面的一项或多项表现，但不包含化疗/靶向药物使用早期发生的亚临床的心血管损伤：(1)左心室射血分数(LVEF)降低的心肌病，表现为整体功能降低或室间隔运动明显降低；(2)充血性心衰(CHF)相关的症状；(3)CHF相关的体征，如第3心音奔马律、心动过速，或两者都有；(4)LVEF较基线降低至少5％至绝对值＜55％，伴随CHF的症状或体征；或LVEF降低至少10％至绝对值＜55％，未伴有症状或体征[J Clin Oncol，2002，20:1215-1221.]。
2.外周静脉血采集
每天上午8-9点间使用EDTA抗凝管采集受试者10mL外周血，于10分钟之内送往实验室处理。
3.RNA提取
按miRNeasy Mini Kit试剂盒说明书提取和纯化外周血单个核细胞RNA。
4.获得mRNA基因表达谱
上述样本Total RNA质控，分别用不同的红、绿荧光基团标记，芯片杂交，经过洗脱后，荧光扫描，通过专用的图像分析软件，可获得微阵列上每个点的红、绿荧光强度(Cy5和Cy3)，其比值(Cy5/Cy3)称为基因在不同样本中的表达水平。
5.获得miRNA基因表达谱
与上述步骤4相同，这里不再赘述。
二.利用mRNA表达谱与miRNA表达谱联合筛选蒽环类药物心脏毒性基因，该方法包括以下步骤：
步骤1、通过mRNA和miRNA表达谱芯片检测到大量基因的表达值，采用过滤式特征基因选择方法对所有基因的相关性进行排序，去除大量的低相关度基因，留下少量与蒽环类药物心脏毒性分类密切相关的基因；
通过过滤式特征基因选择方法的选择实施，分别去除mRNA和miRNA表达谱芯片中大量的(1000～2000个)低相关度基因，留下少量(100～200个)与蒽环类药物心脏毒性分类RPKM均值1以上的密切相关的基因，分别在mRNA和miRNA表达谱中选取得分最高的n(10～50)个基因；
步骤2、将采用过滤式特征基因选择方法获取的mRNA和miRNA特征基因进行合并，形成基因池U；
步骤3、通过遗传算法，对基因池进一步选择基因，消除冗余基因，搜索获得一个最优特征的最优基因集S，使其具有更少(1～10个)的基因数量和更好的分类性能；
步骤4、通过比较乳腺癌患者、乳腺癌AIC患者及正常人mRNA与miRNA联合表达谱不同，样本间的数据从而选出差异表达的基因；最后基于差异表达基因，进行差异基因表达模式聚类分析，Gene Ontology功能显著性富集分析，Pathway显著性富集分析，以及蛋白互作网络分析；
步骤5、对差异表达基因预测，挑选score大于140，自由能小于-20的作为可靠的靶基因；再从靶基因中挑选P值小于0.05的，由于我们采用同一RNA样本同时进行基因表达谱和miRNA表达谱研究，获得的基因集既包含mRNA基因，又包含miRNA基因，因此，这些差异表达的靶基因和差异表达的miRNA被认为是有调控关系的；用剩余部分RNA对构建的乳腺癌蒽环类药物心脏毒性发病目的靶基因进行验证。
在上述具体实施方式中提到的miRNA，其含义与microRNA或者miRNAs或者microRNAs含义相同，均为一种大小约21—23个碱基的单链小分子RNA。mRNA的含义为信使RNA。
RPKM是Reads Per Kilo bases per Million reads的缩写，代表每百万reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数。
基因冗余gene redundancy是指：编码同一物质的基因出现重复的现象，如在E.coli中的染色体中有两到多倍的tRNA基因的现象。
在本发明的具体实施方式中，差异基因表达模式聚类分析，Gene Ontology功能显著性富集分析，Pathway显著性富集分析，以及蛋白互作网络分析等分析手段均为本领域技术人员熟知的普通分析手段，这里不再赘述。
在其他的具体实施方式中，竞争性内源RNA还可以是lncRNA或者cirRNA，利用mRNA表达谱与lncRNA表达谱，或者利用mRNA表达谱与cirRNA表达谱联合筛选蒽环类药物心脏毒性基因的方法与上述具体实施例类似，这里不再赘述。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。