新方法

专利名称:新方法
技术领域：
本发明涉及胸苷的生物法生产。更具体地是，本发明涉及ー种利用遗传操作的生物材料(genetically manipulated biological materials)的方法。该遗传操作的生物材料包括产胸苷的生物，如细菌或ー个或多个DNA构建体如质粒，该构建体与合适的宿主细胞结合，当在合适的培养基中培养时，将以生物法生产胸苷。
背景技术：
嘧啶脱氧核糖核苷胸苷可用作药物中间体。在也被称为叠氮或叠氮胸苷(zidovidine或azidothymidine)的AZT的化学合成中尤为重要。它是核苷逆转录酶抑制剂(NRTI)类的抗逆转录病毒药物，以“立妥威”(“Retrovir”)为商标，是第一种批准用于治疗HIV感染的药物。
通常使用三种或更多种抗逆转录药物的组合来治疗HIV/AIDS(DeClercq，Med.Chem. Res. 13 =439-478,2004)。AZT作为组合治疗的主要成分具有重要和扩展(expanded)的作用，并且以多种商标名出售，包括立妥威，齐多唯(Zidovir)，齐多夫定(Viro-Z)，阿齐多夫定(Aviro-Z)和齐多耶奇(Zido-H)。
AZT在与NRTI药物3TC (拉米夫定(Iamivudine))结合时，尤具价值。这两种药物是能够得到的，将它们配制成单ー的丸剂，商标名为卡贝兹(Combivir)和多卩隹(Duovir)。AZT、3TC和阿巴卡韦(abacavir)三种NRTI的组合以商品名三协唯(Trizivir)出售。其他用于与AZT联用的NRTI药物包括地丹诺辛(didanosine),恩曲他滨(emtricitabine)和扎西他滨(zalcitabine)。
AZT也可以用于和HIV蛋白酶抑制剂药物包括安普纳韦(amprenavir)，阿扎那韦(atazanavir),却地纳宰(indinavir),利托纳宰(ritonavir)和沙奎纳宰(saquinavir)联用，以及和非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)包括地拉夫定(delavirdine)，依法韦仑(efavirenz)和奈,拉平(nevirapine)联用。
AZT是唯一批准可于怀孕期间使用的抗-HIV的药物(Lyall，et al.，HIVMed. 2 314-334, 2001) o在1997年，约有600，000儿童死于母婴传染而感染的AIDS。怀孕期最后三个月服用AZT,可将病毒传染的风险降低67% (Mitchla & Sharland, Expert Opin.Pharmacother. I :239-248,2000)。
对于商业制备在AZT生产中所需的大量胸苷而言,发 酵技术是ー种相对于化学合成具有吸引力的可供选择的方式。发酵エ艺是エ业领域中行之有效的ー种大規模且相对低成本生产生物分子如抗生素、氨基酸和维生素的方式(Atkinson,& Mavituna,BiochemicalEngineering and BiotechnologyHandbook,2nd Edition, New fork, Stockton Press,1991)。
但是自然界中通常找不到“游离”形式的胸苷，但是能以单磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸的形式产生并以三磷酸形式并入到DNA中。生物系统不能天然地生产大量的胸苷，因此需要突变或工程得到的生物。[0009]在EP 0，344，937中，公开了选定用于在有氧培养中生产胸苷的短杆菌属(Brevibacterium)的菌株。同时可參考日本专利公开号No. 39-16345,其中教导了在发酵生产含有胸苷的多糖中，使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtlis)突变菌株。
在US. 5，2I3, 972 (McCandliss & Anderson)中，公开了用于生产诸如胸苷和2’ -脱氧尿苷的嘧啶脱氧核糖核苷(PdN)的エ艺，该文献全部内容引用到本文作为參考，同时读者可详细的參考该文献全文。其教导了一种可复制的微生物，所述微生物包含(incorporating)并表达编码PdN磷酸水解酶的DNA序列，该酶能将PdN单磷酸转化为PdN。
更具体地是,上述McCandliss & Anderson,描述了用于生产胸苷的发酵方法,包括表达来自枯草芽孢杆菌噬菌体PBSl的脱氧胸苷酸磷酸水解酶(dTMPase)。自然条件下这种类型的酶由噬菌体表达，该噬菌体将诸如2’ -脱氧尿苷或5-羟甲基-2’ -脱氧尿 苷的PdN代替胸苷纳入自身DNA。
在US. 5，213，972中描述的胸苷发酵中，已通过突变去除了降解胸苷的酶(胸苷磷酸化酶和尿苷磷酸化酶)从而使胸苷积累。所以，dTMPase酶的应用有助于创造允许胸苷合成的途径。但是，dTMPase的単独表达不能保证胸苷生产处于商业上可行的水平。
在WO 01/02580(其全部内容加入本发明作为參考，同时读者也可详细地全文參考该专利)中，描述了通过表达dTMPase的细胞导致胸苷产生提高的改进。
但是在生物法产生胸苷的生产中存在的问题在于发酵エ艺中伴随生产出2’ -脱氧尿苷(UdR)。这两种分子具有相似的性质，只是在结构上具有一个甲基的不同，因而下游处理过程中的分离是困难并且费用昂贵的。对于医药应用如AZT的合成而言，可能需要高纯度、低UdR水平的胸苷。
如果通过发酵以生物法生产的胸苷能相比于目前エ艺表现出显著降低的UdR水平，从而最小化或消除对于为了去除该物质而进行的下游纯化的需求，那么这将是有益的。
“显著降低”意味着在发酵获得的胸苷产品中，(污染的)UdR水平组成低于25%，更优选地更低于10%，更优选地更低于5%到4%、3%和2%，到I %以及更低的水平。
理想地是，应该获得“高”水平的胸苷。胸苷水平可以作为“单位产率(specificproductivity) ”数据表示,其中测定量在诱导4-6小时后确定。优选大于5mg TdR/1/hr/g细胞干重的水平，更具体地是大于IOmg TdR/1/hr/g细胞干重的水平,还更优选大于15到20和25的单位产率数据。
这些水平的TdR应该最优选与上述降低的UdR水平一起获得，由此可将数据组合为，例如可获得效价为5g/l的TdR，其含有少于如5%的UdR。
确实，现有技术的エ艺，如W001/02580中公开的，在宿主菌株CMG2451中使用质粒PCG532，可在摇瓶试验中产生34. 5%的平均UdR含量。在如此高的水平，使得从UdR中分离胸苷的下游处理是困难的并且代价昂贵。
本发明的目标在于修饰生产胸苷的生物，从而使它们能生产胸苷而不大量伴生出UdR。
这里运用的术语“生物(organism) ”包括通过表达其染色体中的编码DNA (如EP0344937中所公开)或将其作为宿主的DNA (如US 5，213，927和WO 01/02580中所公开)而能够生产胸苷的生物。该宿主DNA可能作为ー个或多个DNA构建体存在，如作为ー个或多个质粒存在。[0022]具体地，本发明的目标在于提供ー种与W001/02580公开的构建体/宿主组合相比，在生产的胸苷质量方面的改进。
进ー步地，本发明的目标在于确保对构建体的任何基因修饰是稳定的，从而当构建体导入宿主细胞并且培养其组合时，该宿主无法在构建体不存在时进行自身増殖，即如果构建体丢失，则生物死亡。

发明内容
意想不到地是，在胸苷生产中发现ー个显著的限速步骤，该步骤发生于dUMP到dTMP的转化过程中，从而使dUMP可能同时指向UdR的产生。这种限制作用不能通过简单的过表达催化转化反应的胸苷酸合酶来缓解。但是，通过确保供应就绪(ready supply)的甲基供体的可用性，本申请人确定能生产污染性UdR水平显著下降(从约35%到少于5%并 且有些情况少于1% )的胸苷。
根据本发明的第一方面，提供一种在培养基中培养时能产生胸苷的生物，该生物含有一个或多个对其DNA进行的遗传修饰或ー些对其生长必需的染色体外DNA，其特征在于该生物含有一个或多个遗传修饰，由于所述一个或多个遗传修饰增加了 dUMP转化为dTMP所需单碳単位的可用性，所以所述修饰使胸苷生物合成途径以消耗UdR为代价优先地产生TdR。
上述一个或多个修饰优选地是这样的修饰，所述修饰增加了用于将dUMP转化为dTMP的胸苷酸合酶可用的5，10-亚甲基四氢叶酸(CH2-THF)量。CH2-THF是两类已知胸苷酸合酶(EC2. I. I. 45和EC2. I. I. 148)的常见ー碳单位供体。对这两种酶催化的反应的比较如图2。
在大多数情况下，供体分子的亚甲基还原为甲基所需的氢原子由CH2-THF自身提供，因此dUMP到dTMP的转化反应需要同时发生CH2-THF到ニ氢叶酸(DHF)的转化反应。这种形式的酶以EC2. I. I. 45表示，由诸如大肠杆菌thyA基因或T4噬菌体td基因编码。
在以EC2. I. I. 148表示，由诸如幽门螺杆菌(Helicobacter pulori)的thyX基因编码的酶的可选形式中，以还原形式的黄素核苷酸如黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)提供两个氢原子。在这种情况下，在胸苷酸合酶反应中将CH2-THF转化为四氢叶酸(THF)，同时将FADH2 转化为 FAD (MyIlykalIio，H. et al. , Science 297 :105-107,2002)
通常情况下通过将ー碳单位转移到THF来再生CH2_THF。在利用EC2. I. I. 45胸苷酸合酶的生物体内，必须存在通过ニ氢叶酸还原酶(EC1. 1.5.3)的作用将DHF转化为THF作为第一歩，ニ氢叶酸还原酶由例如大肠杆菌folA基因或T4 frd基因表达。使用EC2. I. I. 148形式的胸苷酸合酶则不需要这一歩。
由THF产生CH2-THF的主要代谢路径是ー种经过丝氨酸和甘氨酸的途径，起始于糖代谢中间体3-磷酸甘油酸。这种丝氨酸-甘氨酸-C1途径如图3所示。第一关键步骤是在磷酸甘油酸脱氢酶的作用下产生3-磷酸羟基丙酮酸，该酶由例如大肠杆菌serA基因编码。
在该途径中，CH2-THF在两步反应中产生第一步是通过如大肠杆菌glyA基因编码的丝氨酸羟甲基转移酶的作用将L-丝氨酸转化为甘氨酸。第二步是通过是至少四个基因的产物的甘氨酸裂解酶复合体将甘氨酸转化为ニ氧化碳和氨。[0032]在许多生物体内，也能使用甲酸提供碳原子通过三步反应从THF产生CH2-THF,如图4所示。甲酸可来源于中心代谢中间体丙酮酸。在真核生物中这三种所需的酶活性可存在于单一的三功能蛋白质中，如通过例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) ADE3基因编码。
在促进CH2-THF的可用性的生产胸苷的生物中，染色体或染色体外DNA的基因修饰，致使在UdR水平显著下降的同时，胸苷以令人满意的产率生产。这种类型的基因修饰能用于逆转UdR的增加，所述UdR的增加是使用如US 5，213，972和WO 01/02580中教导的遗传操作来增加总PdN产量时的結果，因此这种类型的修饰能改善エ艺产量而没有不可接受的UdR杂质的増加。
优选地但不是必需地是，所述生物是细菌，更优选地是大肠杆菌。但是如先前鉴定的现有技术文件公开的短杆菌属(Brevibacterium)和芽孢杆菌属(Bacillus)菌种，以及其他产胸苷的生物如棒状杆菌属(Corynebacterium)细菌或酵母也能根据本发明的描述进行选用和修饰。可以理解地是，在产胸苷的生物中有多种不同的可以提高CH2-THF可用性的模式，同时在每种情况下最高效的模式将依赖于生物的遗传背景。
优选地，该生物也包括能够过表达胸苷酸合酶的转录单位(染色体上的或染色体外的)，所述胸苷酸合酶由例如td或thyA基因编码；和ー个或多个能使胸苷自dTMP产生的基因，例如，由例如dTMPase基因编码的脱氧胸苷酸磷酸水解酶。
在优选的实施方式中，在胸苷酸合酶是产生DHF的EC 2. I. I. 45型时，该生物包括ー种在表达时能促进DHF转化为THF的基因。所述基因可以是ニ氢叶酸还原酶基因，如folA或frd。优选的ニ氢叶酸还原酶基因是噬菌体基因，更优选地是T偶数噬菌体(T evenphage)基因，最优选地是T4噬菌体基因frd。
可将ニ氢叶酸还原酶基因直接导入生物的染色体DNA中；或者可将其纳入DNA构建体，接下来使该构建体以所述生物作为宿主。优选地，DNA构建体是载体，如质粒，病毒，转座子或者微型染色体。
当使用DNA构建体将DNA导入宿主细胞吋，优选地保证设计的构建体在供试宿主体内稳定存在。
在详细的优选实施方式和最佳模式中，该生物是大肠杆菌宿主菌株CMG2576，该菌株来源于WO 01/02580公开的菌株CMG2451，带有质粒pCG609，该质粒来源于WO 01/02580公开的PCG532。它们的构成在实施例3和4中更全面的详细说明。两次稳定化处理这种组合以确保在“非诱导”条件下生长期间将质粒保持在宿主菌株中。
将TMPase基因与噬菌体入启动子偶联插入到宿主染色体。该质粒携帯在其自身启动子控制下的噬菌体入Cl857温度敏感型阻遏物，该阻遏物从WO 01/02580中公开的宿主菌株染色体上重新定位。如果质粒丢失将没有阻遏物产生，同时表达TMPase基因，从而将TMP转化为胸苷，继而使生物死亡。
申请人:确定该稳定化机制在需要培养多代的大規模培养中使用是不足的，因为质 粒丢失伴随着染色体上定位的TMPase基因的同时失活是频繁的足以使缺少质粒的衍生菌株生长的情況。添加第二种稳定化的机理，其中将一种生长和存活必需的基因从染色体上缺失并将其重新定位于质粒上。在CMG2576和pCG609组合中，这种基因是ThyA，将其克隆进质粒，使其在Iac启动子的控制下。[0042]没有功能性ThyA基因，细胞不能产生TMP，因此不能产生用于合成DNA的TTP，进而死亡。该机制特别有效，因为基因能够容易地进行突变而丧失功能，但是不容易重新产生ー个完全丧失功能的基因。此外，缺失的酶的产物是磷酸化的化合物，该化合物不能通过从功能细胞传出并且进入那些丢失质粒所帯基因的细胞来“互养共栖”(cross-feed)。
为了说明本发明更概括的方面，在详细说明中给出了进ー步的实例，所述实例不总是直接可比的。摇瓶试验数据经常包括在第二个质粒中导入“试验基因”。但是这种多质粒系统没有进行标度试验(scale test),同时它们在大规模培养的遗传稳定性尚未确定。
根据本发明的第二个方面，提供一种生产胸苷的方法，包括在培养基中培养生物，该生物包括对其DNA进行的一个或多个遗传修饰或ー些对其生长必需的染色体外DNA，其特征在于该生物含有一个或多个遗传修饰，由于所述一个或多个遗传修饰增加了 dUMP转化为dTMP所需单碳単位的可用性，结果使胸苷生物合成途径以消耗UdR为代价优先地产生TdR。
优选地，UdR含量低于胸苷含量的5%。
以单位产率表示的胸苷含量，优选大于5mg TdR/1/hr/g细胞干重，更优选大于7. 5到10，再以2. 5为ー级直到25mg TdR/1/hr/g细胞干重和更高。
根据本发明的第三个方面，提供能支持本发明所述生物的生长和胸苷生产的培养基。
根据本发明的再一方面，提供自胸苷生产的叠氮胸苷，所述胸苷根据本发明所述的方法生产。
本发明的优选实施方式
在第一个并且是优选的实施方式中，将基因间接导入生物作为染色体外DNA，最优选地是以质粒形式导入(而不是直接导入染色体)。优选的基因是表达这样ー种酶的基因，该酶能确保将脱氧尿苷单磷酸(dUMP)转化成胸腺嘧啶脱氧核苷单磷酸(dTMP)的胸苷酸合酶(如EC 2. I. I. 45，EC 2. I. I. 148)与供应就绪(ready supply)的甲基一起提供，从而与转化为UdR相反，将大多数的dUMP甲基化为dTMP。
在该优选的实施方式中，优选的胸苷酸合酶是EC 2. I. I. 45型，同时优选的基因是帮助将ニ氢叶酸(DHF)转化为四氢叶酸(THF)的基因。合适的基因是编码ニ氢叶酸还原酶的基因。这可以是野生型或去调控的细菌基因或噬菌体基因。特别优选的基因，同时也是用作示例性说明本发明的ー个基因是噬菌体T4的frd基因(T4frd)。
在另ー个实施方式中，进行基因修饰用于帮助将THF转化为5，10-亚甲基四氢叶酸(CH2-THF)。所有这些遗传修饰有ー个共同的目的就是推动dUMP优先转化为dTMP而非UdR。
已显示有作用的ー些基因修饰不是作为优选修饰的ー种替代方式，就是与其组合起作用，这些基因修饰包括如下
对酶进行修饰，该酶直接作用于转化THF为CH2-THF的反应。一个这样的修饰是导入ー个表达丝氨酸羟甲基转移酶的基因，该酶将L-丝氨酸转化为甘氨酸的同时催化THF 转化成CH2-THF,例如大肠杆菌的glyA。其它这样的修饰可包括导入表达ー个或多个甘氨酸裂解酶复合体成分的ー种或多种基因，该酶复合体催化THF转化成CH2-THF,同时转化甘氨酸成为ニ氧化碳和氨，如大肠杆菌的gcvT, gcvH, gcvP和Ipd基因。[0055] 进行基因修饰，该修饰直接作用于由甲酸提供所需单碳単位的THF到CH2-THF的转化反应。一种这样的修饰是导入ー个或多个表达甲酰四氢叶酸合酶(formyl-THF-synthase)，次甲基四氢叶酸环化水解酶和CH3-THF脱氢酶活性的基因。ー个例子是编码具有全部这些活性的三功能蛋白质的酵母ADE3基因。另ー个例子是，仅向大肠杆菌中导入甲酰四氢叶酸合酶基因，该转化所需的其它酶已存在。
进行基因修饰，该修饰增加反应底物的可用性，该反应作用于THF向CH2-THF的转化。一个这种例子是通过导入基因来促进作为丝氨酸羟甲基转移酶底物的L-丝氨酸的可用性，该基因例如表达3-磷酸甘油酸脱氢酶的大肠杆菌serA基因，所述3-磷酸甘油酸脱氢酶能催化从糖到L-丝氨酸途径中的第一歩反应。另ー些例子包括导入表达从3-磷酸-D-甘油酸产生L-丝氨酸所涉及的随后酶的基因，例如大肠杆菌的serC和serB，或者任何的基因修饰，该修饰能增加酵母ADE3基因编码的酶复合体所需甲酸的可用性。
本发明的各个方面与US 5，213，972和WO 01/02580 二者的教导相比有显著的进 歩，同时提供了改进的DNA构建体和含有该构建体的宿主细胞以用于商业生产胸苷。它们还能应用于对其它产胸苷生物的修饰。
本发明其它的目的，特点和优势将在接下来的描述中变得清晰。但应当理解地是，这些代表了本发明优选实施方式并且仅以举例方式说明。在本发明精神和范围内的各种不同修饰和改变对本领域的技术人员是显而易见的。
本发明的构建体可能是染色体上的或更优选是染色体外的，如位于载体上。
本发明的载体包括质粒，病毒(包括噬菌体)，转座子，和微型染色体，优选地是质粒。
可以根据本领域的技术人员已知的任何方便的方法将载体导入宿主细胞，所述方法例如Pl转导，电穿孔或者转化。
用于本发明中合适的宿主细胞包括真核生物(如真菌)和原核生物(如细菌)。原核生物包括大肠杆菌、沙门氏菌属(Salmonella)、假单孢菌属(Pseudomonas)、短杆菌属、芽孢杆菌属(Bacillus)菌株以及它们的突变菌株。
优选地，本发明的载体包括调控元件(例如启动子如/匕，操纵基因，激活剂，阻遏物如、阻遏物，尤其是温度敏感性变体，和/或增强子)，合适的终止序列，启始序列和核糖体结合位点。另外载体还可包括选择性标记。可供选择地，调控元件(尤其是入阻遏物)可位于宿主细胞染色体上。
根据本发明修饰的宿主细胞在胸苷的商业生产中特别有用。在本发明特别有利地应用中，含有(携带或者并入)根据本发明(尤其与US 5，213，972或者WO 01/02580的教导相结合)修饰的质粒的大肠杆菌宿主细胞能用在胸苷的商业生产中。所以，根据本发明修饰的宿主细胞另外还可包括来源于如PBSl的dTMPase和US 5，213，972教导的突变如deoA，tdk-l和udp-1，以及在WO 01/02580中教导的对构建体的进ー步改进如T4 nrdCAB，T4 td, dcd和 udko
一般来说，使用如WO 01/02580教导的发酵方法，该方法涉及将细胞浸没(submerge)在合适容器内包含的培养基中。在合适的条件下培养之后，收集产生的胸苷并纯化(富集)，如果需要，根据标准的方案纯化至药用的级别。该纯化的胸苷随后能用于药物的生产,如用于药用组合物如AZT的生产。[0066]
附图简述
仅以实例的方式，參考下列的附图来说明本发明，其中
图I显示胸苷生物合成的途径；
图2显示胸苷酸合酶反应(转化dUMP为dTMP)；
图3显示从L-丝氨酸和甘氨酸再生CH2-THF ；
图4显示从甲酸再生CH2-THF ；
图5总结了改进CH2-THF再生的方法；
图6显示质粒pCG532的图谱(现有技术教导);
图7显示质粒pCG609的图谱；
图8显示质粒pCG376的图谱；和
图9对比了ー些宿主/质粒中的胸苷生产。
详细描述
图I使用添加有TMPase基因的大肠杆菌K12为例显示了胸苷生物合成途径的复杂性及相关的遗传学。胸苷以TdR表示，2’-脱氧尿苷以UdR表示，在图示的右下角。UdR在化学上不同于TdR之处在干，比TdR缺少ー个甲基。这两种化合物间的结构类似性使纯化困难并且代价昂贵。本发明涉及进行基因修饰，该修饰能以消耗UdR的生产为代价影响TdR的优先形成。
本申请人确定，通过确保向dUMP到dTMP的エ艺步骤提供增加的一碳单位如CH2-THF的供给，可有效的控制TdR相对于UdR的水平，所述エ艺步骤由例如胸苷酸合酶基因(如td，thyA或者thyX)表达的胸苷酸合酶催化。
这主要是通过确保dUMP转化成dTMP所产生的消耗后的一碳供体分子能快速循环到其作为CH2-THF的活化状态而实现。图2显示胸苷酸合酶的两种可供选择的机理，每ー种产生不同的消耗后的ー碳供体。当胸苷酸合酶是EC 2. I. I. 45型，例如由thyA或td基因编码时，消耗后的供体是DHF。当该酶是EC 2. I. I. 148型，例如由thyX基因编码时，消耗后的供体是THF。
因为CH2-THF直接的前体是THF，显而易见地，在使用EC2. I. I. 45型胸苷酸合酶的生物，如大肠杆菌中，第一步反应必须是DHF到THF的转化。通过向这种生物导入ニ氢叶酸还原酶基因，其编码催化上述反应的酶，本申请人能够显著降低污染性UdR水平，并且额外地増加胸苷的生产量，如实施例6所述。
这种方法能实现对根据US 5，213,972和/或WO 01/02580教导原理产生的胸苷发酵エ艺产量的进ー步改进。用于增加嘧啶脱氧核糖核苷总量的以前的遗传修饰，通过导入ニ氢叶酸还原酶基因，主要导致UdR水平的增加，这种额外的产物现在能直接成为TdR，如实施例7所述。
在实施例8中，已将这种方法与其它修饰结合以确保质粒构建体稳定的存在于它的合适的大肠杆菌宿主菌株内，该质粒构建体携帯ニ氢叶酸还原酶和其它TdR生产所需的克隆的基因。这代表了目前对WO 01/02580教导的现有技术エ艺的最佳模式的改进，但不意味着达到了本发明期望的极限。
由图2显而易见地是，通过导入ニ氢叶酸还原酶基因以增加DHF到THF转化是一种遗传修饰，该修饰能在产胸苷生物中的CH2-THF再生方面产生期望的增加。但是，这种方法不适合应用于有EC 2. I. I. 148型 胸苷酸合酶的生物。在这些情况下，正如在DHF转化为THF不是或不再是CH2-THF再生的限制步骤的情况下，有多种可选择的或其他的遗传修饰能用于达到期望的TdR生产产量且使UdR处于低水平。
这些可供选择的修饰通过考虑THF生物转化为CH2-THF的路径将变得显而易见，如通过L-丝氨酸和甘氨酸，如图3所示，或者通过甲酸，如图4所示。各种可能的解决方法如图5总结。一般来说，合适的修饰或者増加CH2-THF合成的总速率或者改进转化THF为CH2-THF所需ー碳単位的提供速率。
申请人:已试验了这些方法的一些实施例。在实施例9中，过表达ー种酶，该酶能通过将L-丝氨酸转化为甘氨酸来将THF转化为CH2-THF。在实施例10中，过表达另ー种酶，目的是通过增加代谢物向如图3所示的丝氨酸/甘氨酸途径的流动，来改进THF转化为CH2-THF所需的ー碳单位的供应。实施例11和12运用不同的方法将非固有途径导入大肠杆菌，所述途径用于使用甲酸作为ー碳供体将THF转化为CH2-THF。
每种情况中有i)UdR水平小幅下降，或ii)TdR小幅上升，无相对的UdR增加，或者iii)前两者的组合。与实施例6，7，8中所述增加ニ氢叶酸还原酶的效果相比，改进是相对较小的，但是应当理解的是，在可选择的或另外的改进型产胸苷生物中，每种情况能更显著，所以是本发明有效的实施例。
实施例I.(比较例)
_9] 现有技术的构建体/菌株
以WO 01/02580公开的现有技术构建体/菌株作为对照，说明本发明的优点。图6显示构建体PCG532，表I给出大肠杆菌宿主菌株CMG2451的基因型。但是，应当理解的是，并非其中公开的所有基因都构成本发明必需部分，虽然胸苷酸合酶基因(td，在质粒上)和TMPase (整合到染色体)的存在对其优选实施方式很重要。
表I :现有技术宿主菌株CMG2451的基因型
菌株基因型
CMG2451 hsdR-2 supE thi deoA-15 tdk-1 (入 clg57 ABAM AHI)


nic bio A(chlD-pgl) nadA-S^wJnXQ udp-/
_chr: :Tn5: :d丁MPase AZT R FUdR R _
实施例2.
胸苷牛产的摇瓶试验
根据以下方法，将实施例I涉及的构建体和菌株在培养基(表2)中培养。获得的数据用于比较TdR产率和UdR杂质的相对量(以TdR的百分数表示)的目的。
所有的实验在250ml带挡板的摇瓶中进行，每个试验菌株7到12个瓶。使用在LB培养基中培养的新鲜种子液以大约2. 5%体积的接种量接种于每瓶20mL的培养基中。将培养物在31°C培养至0D600nm = 5。然后将摇瓶移至不同的摇床，使温度从35. 7°C上调到36. 8°C。温度诱导4到6小时后取样品分析。
表2:摇瓶富集培养基配方
权利要求
1.ー种在培养基中培养时能产生胸苷的细菌，其中所述细菌具有TMPase和胸苷酸合酶基因，其特征在于该细菌含有遗传修饰，该遗传修饰通过增加dUMP转化为dTMP所需单碳単位的可用性，结果使胸苷生物合成途径以消耗UdR为代价优先地产生TdR，其中所述遗传修饰包含大肠杆菌的thyA基因或噬菌体T4的td基因的过表达和导入能够表达ニ氢叶酸还原酶(EC1. 5. I. 3)的T4 frd转录单位，并且其中已将编码核苷ニ磷酸激酶(EC2. 7. 4. 6)的宿主菌株基因敲除或以其它方式失活或切去，其中所述细菌是大肠杆菌。
专利摘要
本发明公开了包括DNA构建体宿主细胞组合在内的新生物。该生物包括含有编码酶的DNA序列的转录单位(如操纵子)，这些酶促进dUMP转化为dTMP所需单碳单位的供应。实例包括二氢叶酸还原酶基因，如T4 frd；丝氨酸羟甲基转移酶基因，如glyA；3-磷酸甘油酸脱氢酶基因，如serA；以及THF合酶基因，如ADE3。该生物用于生产所含尿苷水平显著下降的胸苷的生物方法中。
文档编号C12N9/12GKCN101379185 B发布类型授权 专利申请号CN 200780004615
公开日2012年8月29日 申请日期2007年2月5日
发明者克里斯托弗·普雷斯顿, 刘林, 安德鲁·J·科利斯, 戴维·M·安德森, 瑟吉·波德科维罗夫 申请人:葛兰素集团有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (1), 非专利引用 (2),