一种同时制备知母中四种药效成分的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及到中药制药技术领域，涉及一种同时制备知母中四种药效成分的方 法，具体涉及通过联用两种分离材料实现对知母中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII和知母 皂苷AllI制备分离。
【背景技术】
[0002] 知母为百合科（Liliacea)植物知母AnemarrhenaasphodeloidesBge.的干燥 根茎，具有清热泻火、生津润燥的功效，临床用于外感热病、高热烦渴、肺热燥咳、骨蒸潮热、 内热消渴、肠燥便秘。现代药理研究表明其具有降血糖、抗老年痴呆、抗肿瘤、抗病原微生 物、抗血小板聚集、降血糖、解热、抗炎生理活性（徐爱娟等，中药材，2008, 31 (4) :624-628 ; YingliWang，et.JEthnopharmacol. 2014,153(1) :42-60)，知母中化学成分主要为双苯P比 酮类和留体皂苷类，双苯吡酮类主要成分为新芒果苷（NMF)和芒果苷（MF)，留体皂苷类主 要成分为知母皂苷B-II(TSB-II)、知母皂苷A-III(TSA-III)。芒果苷具有降糖、神经保 护、抗氧化、改善记忆、抗肿瘤等药理效应，新芒果苷具有芒果苷相似的药理作用，B-II具有 改善认知、抗血栓、抗炎效果，A-III具有抗血小板聚集、抗肿瘤的药理作用，且该四种成分 在药材中含量较高，表明其具有潜在的药物开发价值。因此，对此知母中这些成分进行富集 纯化具有一定经济价值和社会意义。
[0003] 采用大孔吸附树脂技术可以实现对知母中总黄酮类成分（段亮亮等，中医研究， 2009,22(9) :20-22)和总皂苷类成分（陈志红等，应用化工，2008, 37 (8) :841-843 ;胡洋叶 等，世界科学技术-中医药现代化，2012，14(1) :1232-1236)富集；若通过大孔吸附树脂技 术得到单一化合物知母皂苷B-II、A-III多需要与硅胶柱层析、逆流色谱（Meng-ShunLiu， et.SeparationandPurificationTechnology138(2014) 138-143)、制备液相等技术联用 才能实现纯化，但受设备限制该工艺很难实现规模化生产，同时成本较高；也有采用大孔吸 附树脂对知母皂苷A-III(李志雄等，中成药，2013, 35 (2) :411-413)、B-II(CN1693310A)分 离制备，但现有工艺存在分离制备成分只有一种成分、其他成分没有综合制备利用的问题， 或者工艺复杂，生产成本高，很难实现规模化生产。通过单一大孔吸附树脂技术很难实现对 知母中四种组分单一成分芒果苷、新芒果苷、知母皂苷B-II和知母皂苷A-III的同时分离。
[0004] 因此建立一种能同时制备知母中芒果苷、新芒果苷、知母皂苷B-II和知母皂苷 A-III的、对环境友好、分离低成本的方法显得十分必要。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是建立一种同时规模化分离制备知母中主要化学组分的方法，涉及一 种同时制备知母中四种药效成分的方法，洗脱剂中避免使用其他有机溶剂，只使用含水乙 醇，在降低生产成本的同时实现对环境友好。
[0006] 本发明涉及通过联用两种分离材料实现对知母中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII 和知母皂苷AllI制备分离；
[0007] 本发明涉及同时分离制备知母中主要成分的分离方法，涉及聚酰胺-大孔树脂联 用对知母中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII和知母皂苷AIII制备分离；
[0008] 本发明涉及同时制备知母中四种药效成分的方法，先通过聚酰胺洗脱，再通过大 孔树脂柱洗脱，同时分离制备知母中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BII和知母皂苷AIII的方 法。
[0009] 本发明涉及同时分离制备知母中主要成分的分离方法，其包括：知母用乙醇提取， 知母乙醇提取物用聚酰胺吸附，用乙醇洗脱；然后加到大孔树脂柱中，用乙醇洗脱，制备得 到知母中四种药效成分。
[0010] 本发明涉及同时分离制备知母中主要成分的分离方法，其包括：知母用乙醇提取， 知母乙醇提取物回收乙醇后，用聚酰胺吸附，水洗除杂，用乙醇洗脱；乙醇洗脱物浓缩后，然 后加到大孔树脂柱中，用乙醇洗脱，制备得到知母中四种药效成分。
[0011] 本工艺的特征工艺是聚酰胺-大孔树脂的连接方式，具体是通过两种分离材料的 联用实现分离，即知母乙醇提取液回收醇后的样品水溶后是先通过聚酰胺，不同浓度乙醇 洗脱部位回收醇后分别通过大孔吸附树脂分段收集。
[0012] 聚酰胺-大孔树脂的优选连接方式：先通过聚酰胺树脂，分别用5% -20%乙醇和 40% -60%乙醇洗脱，分段后回收乙醇，然后分别采用不同浓度的乙醇进行洗脱大孔树脂 柱，大孔树脂柱采用低浓度乙醇为20% -30%乙醇，中浓度乙醇为50% -60%乙醇，高浓度 乙醇为70% -80%乙醇洗脱，可以实现对四种组分的规模化制备。
[0013] 本发明通过实验发现：知母乙醇提取物不能通过"先通过大孔吸附树脂，再通过聚 酰胺"而实现新芒果苷、知母皂苷BII、芒果苷和知母皂苷AIII的有效完全分离。
[0014] 本发明涉及同时分离制备知母中主要成分的分离方法，其包括：
[0015] a)将市售的知母药材或饮片直接投料或粉碎成粗粉，以3-10倍体积的30% -80% 的乙醇室温超声提取1-3次，每次0. 5-lh，或者通过加热方式超声提取或回流提取1-3次， 每次l_3h，过滤，合并提取液回收乙醇后加水溶解到适当体积，得提取液。
[0016] b)上述提取液通过预处理好的聚酰胺柱，先后采用5% -20 %乙醇和40% -60% 乙醇溶剂1_5BV(BV为填料的装柱体积，如聚酰胺柱体积为30mL，1-5BV就是洗脱剂要用 30-150mL，下同）洗脱。第一部分包括上样流出溶液和5% -20%乙醇洗脱溶液，记作样1 ; 第二部分为40% -60%乙醇洗脱溶液，记作样2。
[0017] c)取样1浓缩至无醇味，加水至3-10倍体积至充分溶解，通过大孔吸附树脂柱，分 另IJ用水、不同浓度乙醇洗脱。收集低浓度乙醇洗脱部位，记作样3,中浓度洗脱部位，记作样 4〇
[0018] d)取样2浓缩到无醇味，加水适量至充分溶解，通过大孔吸附树脂柱，分别以低浓 度、中浓度和高浓度乙醇洗脱，收集低浓度醇洗脱部位，记作样5 ;高浓度乙醇洗脱部位，记 作样6。
[0019] e)取样3、样4、样5、样6,浓缩，真空干燥或冷冻干燥，分别得到新芒果苷、知母皂 苷BII、芒果苷和知母皂苷AIII。
[0020] 步骤b)中聚酰胺为30-60目或者60-100目。
[0021] 步骤c)中大孔吸附树脂为中极性、弱极性或非极性吸附树脂，如D101、HPD100、 AB-8、HPD400、HPD600等，低浓度乙醇浓度范围为10% -30%乙醇，中浓度乙醇浓度范围为 40% -50% 乙醇。
[0022] 步骤d)中大孔吸附树脂为中极性、弱极性或非极性吸附树脂，如D101、HPD100、 AB-8、HPD400、HPD600等，低浓度乙醇浓度范围为20% -30%乙醇，中浓度乙醇浓度范围为 50% -60 %乙醇，高浓度乙醇浓度范围为70% -80 %乙醇。
[0023] 在上述描述中，上样流速为l_3BV/h，洗脱流速l_2BV/h，洗脱剂体积为柱体积的 1-3 倍。
[0024] 聚酰胺-大孔树脂的连接方式：连接方式可以通过一定管线连接以实现流水化。
[0025] 与现有技术相比，本发明采用乙醇提取，采用聚酰胺和大孔吸附树脂联用技术同 时分离制备知母中四种主要成分、芒果苷（MF)、新芒果苷（NMF)、知母皂苷BII(TSB-II)和 知母皂苷AIII(TSA-III)，有效避免单一提取带来的资源浪费，提高资源利用效率，且使用 的分离材料可以再生处理，洗脱剂为含水乙醇。工艺生产成本低，绿色环保，纯度大于90%， 易于规模化生产。知母乙醇提取浓度考察：由表1看出，30% -70%乙醇提取溶剂可以提取 绝大部分成分，综合考虑到杂质含量等，以70%乙醇作为提取溶剂。
[0026] 表1不同乙醇浓度考察结果（η= 2)
[0027]
[0028] 大孔吸附树脂型号的静态和动态考察：
[0029] 分别量取预处理好的18种大孔吸附树脂各lg(干重），加样品溶液100mL，放入摇 床中25°C下回旋震荡12h，滤除溶液，依次分别用水10mL，80%乙醇20mL震荡洗脱2h，测定 芒果苷、新芒果苷、知母皂苷B-II和知母皂苷A-III的含量，计算比吸附量和解吸率，结果 见表2,综合考虑到吸附量、解吸率和树脂价格，选择HPD-100,HPD-400,HPD-600做进一步 考察。
[0030] 表2树脂静态考察
[0031]
[0032] 分别取相当于干重8g的HPD-100,HPD-400,HPD-600大孔吸附树脂，装于 Φ20X300mm层析柱中，取生药浓度1 : 10知母提取溶液200mL以2.OBV/h流速通过聚酰 胺树脂柱，然后分别以去离子水、10 %、20 %、30 %、40 %、50 % 60 %、70 %、80 %乙醇各80mL 以1.OBV/h进行洗脱，80mL分段进行收集，测定新芒果苷、芒果苷、知母皂苷B-II和知母皂 苷A-III。由表3可以看出，新芒果苷和芒果苷都不能在在三种大孔吸附树脂上实现分离， 知母皂苷B-II与芒果苷洗脱曲线也有一定重合，知母皂苷A-III在三种树脂上都能实现 分离。在本工艺考察中，芒果苷和知母皂苷B-II在中弱极性树脂HPD400具有相对好的分 离效果。
[0033] 表3三种大孔吸附树脂树脂动态吸附考察
[0034]
[0035] 上样质量对四种组分在大孔吸附树脂上分离影响：
[0036] 取预处理好的相当于8g的HPD400大孔吸附树脂装入Φ20X300mm层析柱中，取 生药浓度1 : 10知母提取溶液60mL，120mL，180mL分别以2.OBV/h通过聚酰胺树脂柱，然 后分别以水、10 %、20 %、30 %、40 %和50 %乙醇1.OBV/h进行洗脱，每80mL分段进行收集， 测定新芒果苷、芒果苷、知母皂苷B-II和知母皂苷A-III。
[0037] 由表4可以看出，新芒果苷、芒果苷、知母皂苷B-II和知母皂苷A-III分别被 20% -30%乙醇、20% -50%乙醇、40% -60%乙醇和40% -60%乙醇洗脱，随着上样质量的 增加，B-II与芒果苷的重合越来越多，为保持合适的分离效率，故上样量以不超过180mL为 宜。
[0038] 表4不同上样体积四种组分在HPD400上的洗脱特征
[0039]
[0040] 大孔吸附树脂的型号对四种组分的分离并没有决定性的影响，但因非极性吸附树 脂如D101、弱极性吸附树脂如AB-8和中极性吸附树脂具有较大的吸附量，这些型号树脂都 可以作为本工艺的分离树脂。四种组分并不能实现在大孔吸附树脂上有效分离。
[0041] 聚酰胺纯化工艺中聚酰胺规格、厂家和乙醇洗脱浓度考察：分别取预处理好的台 州四甲（台州市路桥四甲生化塑料厂）产30-60目（T30-60)、60-100目（T60-100)聚酰胺 粉和宝