外源性基因表达增强剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种在利用了家蚕絹丝腺的蛋白质表达系统中将反义RNA表达载体作 为有效成分的外源性基因表达增强剂，和具有该反义RNA表达载体的基因重组家蚕。
【背景技术】
[0002] 家蚕(Bombyx mori)的絹丝腺，具有短时间合成大量蛋白质的能力。另外，由于家 蚕的絹丝腺是大型器官所W容易摘出，合成的蛋白质被保存于絹丝腺内腔，所W也具有容 易回收的优点。因此，利用絹丝腺表达目标蛋白质的基因重组家蚕，被视为有希望作为有用 蛋白质或高性能丝等附加值高的蛋白质的大量生产系统。
[0003] 家蚕絹丝腺，形态学上是如图1所示的左右1对的器官，分别由前部絹丝腺、中部絹 丝腺和后部絹丝腺3个区域构成。在中部絹丝腺细胞内，合成作为絹丝的覆盖成分的水溶性 的明胶样蛋白质、丝胶蛋白1(本说明书中，常常简称为"Seri")、丝胶蛋白2(本说明书中，常 常简称为"Ser2")和丝胶蛋白3(本说明书中，常常简称为"Serf")(图1)。运些蛋白质，在合 成后被分泌至中部絹丝腺内腔中。另外，在后部絹丝腺细胞内，合成构成属于絹丝纤维成分 的丝素蛋白的3个主要蛋白质即丝素蛋白Η链(本说明书中，常常简称为"門b H")、丝素蛋白 L链(本说明书中，常常简称为"Fib L")和p25/FHX(W下，记为"p25")。运3个蛋白质WFib H:F;Lb Up25 = 6:6:l的比率形成复合物（sUk fibroin elementary unit;本说明书中，W 下称为"SFKJ复合物"），分泌至后部絹丝腺内腔中。然后，SFKJ复合物转移至中部絹丝腺内 腔，被丝胶蛋白覆盖，作为絹丝从前部絹丝腺吐丝（图1:非专利文献1)。因此，将家蚕絹丝腺 作为蛋白质表达系统利用时，利用中部絹丝腺或后部絹丝腺中特异性表达的基因表达系统 即可。实际上，目前为止作为使用中部絹丝腺的重组蛋白质表达系统，确立了利用GAL4/UAS 系统(非专利文献2)或将Seri启动子和Hr3增强子进行组合的系统的大量表达方法(非专利 文献3)。
[0004] 在利用家蚕絹丝腺的蛋白质表达系统中，为了提高目标蛋白质的生产效率，提高 该基因的表达量本身、通过减少絹丝腺的其他主要蛋白质量从而使目标蛋白质的表达量相 对上升W及从家蚕有效回收目标蛋白质是重要的。阻碍蛋白质回收的原因之一，可举出夹 杂蛋白质的存在。例如，可举出作为絹丝腺的主要蛋白质的丝素蛋白、丝胶蛋白。运些蛋白 质由于合成量多，且是纤维品质，粘稠性、结晶性高，因此容易成为目标蛋白质提取或精制 时堵塞柱或过滤器的原因。因此，对于蛋白质的有效回收，需要抑制运些夹杂蛋白质的基因 表达。另一方面，家蚕絹丝腺中表达的运些基因的过度的表达抑制，由于会对家蚕的生长本 身产生影响，因此需要控制该表达抑制的技术。
[0005] 家蚕絹丝腺中，抑制内源性丝素蛋白或丝胶蛋白的表达的方法中，包括使用已有 的基因突变系统的方法和人为抑制运些基因的表达的方法。
[0006] 作为使用已有的基因突变系统的方法的例子，已知在家蚕中由后部絹丝腺表达的 Fib Η链具有异常的Nd系统、門b L链具有异常的Nd-s系统和Nd-sD系统。由于Nd系统中Fib Η链的表达或者Nd-s系统和Nd-sD系统中Fib L链的表达非常低，因此通过使用运些系统利 用中部絹丝腺使目标蛋白质表达能够提高其表达量（专利文献1)。但是，上述基因突变系 统，不能抑制由中部絹丝腺表达的Seri等基因表达，另外，由家蚕的中部絹丝腺表达的基因 的突变系统等目前为止没有报告。
[0007] 作为人为抑制基因的表达的方法的例子，可举出RNAKRNA inteference)法。RNAi 法是在生物体内介由祀基因的转录产物的分解，抑制(沉默)该基因的表达的方法。通常在 RNAi法中，使用由双链RNA构成的siRNA(small intedering RNA)或miRNA(micro RNA)W 及由单链RNA构成通过自折叠（36"寸〇1(1；[叫)在分子内形成双链1?魁区域的3111?熱(31101·* hairpin RNA)等RNAi分子。另一方面，由单链RNA构成且不形成分子内双链RNA区域的反义 RNA(本说明书中，常常记为"asRNA")与祀mRNA退火，最终经过与双链RNA相同过程发挥RNAi 所致的基因的表达抑制效果。但是，由于与其他RNAi分子相比其效果非常低，因此基本没有 使用(非专利文献4)。
[000引在W家蚕为首的鱗翅目化epidoptera)昆虫中，与其他生物种相比RNAi所致的基 因表达抑制的效果通常低(非专利文献5)。但是，已知其效果因组织不同而不同，即使是鱗 翅目，也只是在皮肤或絹丝腺中比较高。例如，报告通过使Fib Η链、Fib L链和Seri的双链 RNA在家蚕的细胞内表达，能够抑制各基因的表达(专利文献2~4)。但是，运些方法，由于必 须在生物体内表达和构筑双链RNA，而且表达载体的制作或基因重组家蚕制作的工序复杂 需要劳力，因此存在制造成本变高的问题。而且，在W往技术中，存在组合多个基因而同时 抑制其表达非常困难的问题。运些问题，如果是由单链RNA构成的asRNA则能够克服。但是， 报告了在家蚕絹丝腺内asRNA所致的基因表达抑制的效果也非常低，与双链RNA相比仅为数 百分之一左右(非专利文献6)。
[0009]现有技术文献 [0010]专利文献
[0011] 专利文献1:日本特开2004-135528
[0012] 专利文献2:日本特表2006-521802
[0013] 专利文献3:日本特开2008-245623
[0014] 专利文献4:日本特开2011-103816
[0015] 非专利文献
[0016] 非专利文献 1: Inoue S.et al. ,2000,The Journal of Biological 化emistiT, 275(51):40517-40528.
[0017] 非专利文献2:Tatematsu K.et al. ,2010,Transgenic Research,19(3) :473-87. [001 引 非专利文献3:Tomita M.et al. ,2007 Jransgenic Research, 16(4) :449-465.
[0019] 非专利文献4:Tave;rnarakis N.et al. ,2000,Na1:ure genetics,24180-183.
[0020] 非专利文献5:Terenius O.et al. ,2011 Journal of Insect Physiology, (57): 231-245
[0021] 非专利文献6: Isobe R.et al. ,2002, Journal of insect biotechnology and sericology,71,43-47
【发明内容】
[0022] 本发明的课题在于开发并提供有效抑制作为絹丝腺内源性的主要的蛋白质且可 成为夹杂蛋白质的丝胶蛋白和/或Fib Η链的基因表达的方法，W在基因重组家蚕的絹丝腺 中提高目标蛋白质的生产效率。
[0023] 为了解决上述课题，本发明人等进行深入研究，最终发现通过使将丝胶蛋白、門b Η链的氨基酸序列中含有的重复序列区域作为直接的祀区域的asRNA在家蚕的絹丝腺中表 达，从而即便是asRNA也能够有效抑制丝胶蛋白、門b Η链的基因表达。本发明基于该研究成 果，提供W下的发明。
[0024] (1)-种家蚕絹丝腺的外源性基因表达增强剂，其含有能够使家蚕中部絹丝腺特 异性表达选自56^日3尺酷、56的日3尺臟和56切日3尺臟中至少一个33尺臟的33尺臟表达载体和/或 能够使家蚕后部絹丝腺特异性表达Fib-H asRNA的asRNA表达载体作为有效成分，其中， SerlasRNA含有与编码序列编号1表示的家蚕Seri的氨基酸序列中628位~1054位的重复序 列区域的至少一个重复单元的碱基序列互补的序列，Ser2asRNA含有与编码序列编号4表示 的家蚕Ser2的氨基酸序列中41位~117位或685位~1359位的重复序列区域的至少一个重 复单元的碱基序列互补的序列，Ser3asRNA含有与编码序列编号8表示的家蚕Serf的氨基酸 序列中141位~978位或1031位~1178位的重复序列区域的至少一个重复单元的碱基序列 互补的序列，門b-HasRNA含有与编码序列编号12表示的家蚕Fib Η链的氨基酸序列中152位 ~5203位的重复序列区域的至少一个重复单元的碱基序列互补的序列。
[0025] (2)根据（1)记载的外源性基因表达增强剂，其中，Seri的重复单元由序列编号2表 示的氨基酸序列构成，Ser2的重复单元由序列编号5或6表示的氨基酸序列构成，Ser3的重 复单元由序列编号9或10表示的氨基酸序列构成，另外Fib Η链的重复单元由序列编号13表 示的氨基酸序列构成。
[0026] (3)根据（1)记载的外源性基因表达增强剂，其中，Seri的asRNA由序列编号3表示 的碱基序列构成，Ser2的asRNA由于序列编号7表示的碱基序列构成，Ser3的asRNA由序列编 号11表不的碱基序列构成，另外Fib Η链asRNA由序列编号14表不的碱基序列构成。
[0027] (4)根据（1)~（3)中任一项记载的外源性基因表达增强剂，其中，上述asRNA表达 载体由2个亚单元构成。
[00%] (5) -种基因重组家蚕，具有能够使家蚕中部絹丝腺特异性表达选自SerlasRNA、 Ser2asRNA和Ser3asRNA中至少一个asRNA的asRNA表达载体和/或能够使家蚕后部絹丝腺特 异性表达Fib-化sRNA的asRNA表达载体，其中，SerlasRNA含有与编码序列编号1表示的家蚕 Seri的氨基酸序列中628位~1054位的重复序列区域的至少一个重复单元的碱基序列互补 的序列，Ser2asRNA含有与编码序列编号4表示的家蚕Serf的氨基酸序列中41位~117位或 685位~1359位的重复序列区域的至少一个重复单元的碱基序列互补的序列，Ser3asRNA含 有与编码序列编号8表示的家蚕Ser3的氨基酸序列中141位~978位或1031位~1178位的重 复序列区域的至少一个重复单元的碱基序列互补的序列，Fib-H asRNA含有与编码序列编 号12表示的家蚕Fib Η链的氨基酸序列中152位~5203位的重复序列区域的至少一个重复 单元的碱基序列互补的序列。
[0029] (6)根据(5)记载的外基因重组家蚕，其中，Seri的重复单元由序列编号2表示的氨 基酸序列构成，Ser2的重复单元由序列编号5或6表示的氨基酸序列构成，Serf的重复单元 由序列编号9或10表示的氨基酸序列构成，另外Fib Η链的重复单元由序列编号13表示的氨 基酸序列构成。
[0030] (7)根据(5)记载的基因重组家蚕，其中，Seri的asRNA由序列编号3表示的碱基序 列构成，Ser2的asRNA由序列编号7表示的碱基序列构成，Ser3的asRNA由序列编号11表示的 碱基序列构成，另外Fib Η链asRNA由序列编号14表不的碱基序列构成。
[0031] (8)根据（5)~（7)中任一项记载的基因重组家蚕，上述表达载体由2个亚单元构 成。
[0032] (9)根据(8)记载的基因重组家蚕，上述2个亚单元存在于不同的染色体上。
[0033] (10)根据巧)~(9)中任一项记载的基因重组家蚕，具有能够表达目标外源性基因 的外源性基因表达载体。
[0034] (11)-种基因重组家蚕制作方法，其包括对家蚕给予（1)~(4)中任一项记载的外 源性基因表达增强剂的工序。
[0035] (12)-种在（10)记载的基因重组家蚕的絹丝腺中制造外源性基因编码的目标肤 的方法。
[0036] 本说明书包含作为本申请优先权的基础的日本国专利申请2013-222138号说明书 和/或附图记载的内容。
[0037] 根据本发明的外源性基因表达增强剂，通过对家蚕给予，在蛋白质生产系统的家 蚕中，能够抑制成为夹杂蛋白质的丝胶蛋白或Fib Η链的合成。
[0038] 根据本发明的基因重组家蚕，能够提供丝胶蛋白和/或Fib Η链的合成被抑制的家 蚕。另外，如果是进一步具有由絹丝腺表达的外源性基因的基因重组家蚕，则能够提高外源 性基因编码的目标肤的生产效率和回收率。
[0039] 根据本发明的肤制造方法，通过使用本发明的基因重组家蚕作为蛋白质生产系 统，能够大量且比较低成本地制造附加值高的蛋白质。
【附图说明】
[0040] 图1表示在家蚕的絹丝腺和各部位表达的丝素蛋白构成蛋白质和吐出絹丝之前的 概念图。
[0041] 图2是表示作为本发明外源性基因表达增强剂的有效成分的asRNA表达载体由2个 基因表达单元构成时的第1亚单元和第2亚单元的构成例的图。A~C是第1亚单元的构成例。 A是在后部絹丝腺启动子下配置GAL4基因作为编码转录调节因子的DNA的后部絹丝腺GAL4 表达载体的一部分。B是在中部絹丝腺启动子下配置GAL4基因的中部絹丝腺GAL4表达载体 的一部份。C是在中部絹丝腺和后部絹丝腺各自的启动子下配置GAL4基因的中部&后部絹丝 腺GAL4表达载体的一部分。D和E是第2亚单元的构成例。D是在作为GAL4的祀启动子的UAS启 动子的下游具有1个asRNA编码DNA的asRNA表达载体的一部分。E是在UAS启动子的下游W2 个串联具有asRNA编码DNA的asRNA表达载体的一部分。各亚单元中白框表示的3'UTR的箭头 表示转录方向。
[0042] 图3是表示实施例1等使用的表达SerlasRNA的第2亚单元的构成的图。A是表达5' Ser lasRNA 的 UAS-5 ' Ser lasRNA 表达载体。另外，B 是表达 3 ' SerlasRNA 的 UAS-3 ' SerlasRNA 表 达载体。此处，5'SerlasRNA将不含有重复序列区域的Seri的5'区域作为祀。另外，3' SerlasRNA将含有重复序列区域的Seri的3'区域作为祀。SerlasRNA编码DNA的箭头表示转 录方向下，与此相同）。
[0043] 图4是表示实施例1等使用的表达SerlshRNA的第2亚单元的构成的图。A是表达5' Ser 1 shRNA 的 UAS-5 ' Ser 1 shRNA 表达载体。另外，B是表达3 ' Ser 1 shRNA 的 UAS-3 ' Ser 1 shRNA 表 达载体。SerlshRNA由Seri正义RNA(SerlsRNA)、连接体（肌动蛋白内含子）和SerlasRNA构 成。
[0044] 图5是表示实施例1等使用的第1亚单元的构成的图，表示W中部絹丝腺表达GAL4 基因的中部絹丝腺GAL4表达载体。
[0045] 图6是表不具有图3和图4表不的各第2亚单兀和图5表不的第1亚单兀的基因重组 家蚕的Seri基因的表达抑制的图。图中上方记载的的％是各组表示的3系统（1，2,3)的平均 相对量。
[0046] 图7是表示具有图3和图4表示的各第2亚单元和图5表示的第1亚单元的基因重组 家蚕的虽蛋白质的SDS-PAGE的图。
[0047] 图8是表示实施例2等使用的表达Fib-H asRNA的第2亚单元的构成的图。A是表达 Fib-HlasRNA 的 UAS-Fib-HlasRNA 表达载体。另外，B 是表达門b-肥 asRNA 的 UAS-Fib-肥 asRNA 表达载体。Fib-Hl和Fib-肥，作为祀的Fib Η链的重复序列区域的长度不同。
[0048] 图9是表示实施例2等使用的第1亚单元的构成的图，表示后部絹丝腺中表达GAL4 基因的后部絹丝腺GAL4表达载体。
[0049] 图10是表示具有图8表示的第2亚单元和图9表示的第1亚单元