5化的样 品进行电泳后，利用CBC染色。
[02川（结果）
[0232] 图13示出结果。第1亚单元使用后部絹丝腺表达用GAL4载体时，与对照(UAS-;GAL4 + )相比中部絹丝腺的Fib Η链蛋白质量减少。运与实施例2的结果一致，另外，第1亚单元使 用中部絹丝腺表达用GAL4载体时，中部絹丝腺的Seri蛋白质基本消失。运表明通过中部絹 丝腺表达用GAL4载体，在中部絹丝腺Ser lasRNA表达，抑制Seri基因的表达。另一方面，第1 亚单元使用中部&后部絹丝腺表达用GAL4载体时，在中部和后部絹丝腺的双方表达Fib-H asRNA和SerlasRNA。由此，Seri基因和Fib Η链基因两者同时且高效地被抑制表达。
[0233] <实施例4:利用SerlasRNA增强外源性基因的表达>
[0234] (目的）
[02巧]根据实施例1和3,证明通过SerlasRN A抑制了Seri基因的表达。因此，证明通过 Seri基因的表达抑制，能够增强外源性基因的表达。
[0236] 巧法）
[0237] 1.外源性基因表达载体的制作
[0238] 利用Ncol-Notl将实施例1制作的UAS骨架质粒Am切an/pZero2切断，切出Am切an基 因片段。将得到的片段插入pBac[SerUAS-ser_int-EGFP/3xP3EGFP](图 14A)(Tatematsu K.et al.,2010,Transge nic Research,19(3):473-87)的Ncol-Notl部位。由此将pBac [SerUAS-s er_int-EGFP/3xP3EGFP]的标记基因由EGFP替换为Am切an。将得到的UAS-EGFP 表达载体作为地acSerUAS-ser_intEGFP/3xP3AmCyan(图 14B)。
[0239] 2.重组家蚕的制作
[0240] (1)外源性基因表达载体的导入
[0241] 将上述"1.外源性基因表达载体的制作"所制作的UAS-EGFP表达载体地acSerUAS- ser_in巧GFP/3xP3Am切an与实施例1记载的辅助质粒PHA3PIGW1:1的比例混合，注射至产 卵后2~8小时的wl-pnd系统的家蚕卵。注射后的卵在加湿状态下在25°C解育直至解化。解 化的幼虫在25~27°C的饲养室内利用人工饲料(Silk Mate原种1-3龄S、日本农产工)饲养 全龄。人工饲料每2~3天交换。羽化后，进行同胞交配。根据3xP3Am切an标记物所致的眼的 巧光的有无选拔得到的F1，得到基因重组家蚕系统。将该基因重组家蚕系统作为UAS-EGFP 系统。
[0242] (2)中部絹丝腺GAL4系统、3 ' Ser 1 asRNA系统W及UAS-EGFP系统的交配
[0243] 将具有地acSer-pro GAL4/3xP3DsRed2作为中部絹丝腺表达用GAL4载体的中部絹 丝腺GAL4系统（相当于第1亚单元系统）与具有3'5日'1日33歴表达载体98日(3[5日州45-3' asSerl/3xP3EYFP]的UAS-3'Ser asRNA系统（相当于第2亚单元系统）和"（1)外源性基因表 达载体的导入"得到的具有地acSerUAS-ser_intEGFP/3xP3Am切an的UAS-EGFP系统进行交 配。作为比较用，将上述中部絹丝腺GAL4系统与具有3'SerlshRNA表达载体地ac[SerUAS-3' dsSerl/3xP3EYFP]的UAS-3'Ser shRNA系统和上述UAS-EGFP系统进行交配。另外，作为阴性 对照用，仅将上述中部絹丝腺GAL4系统和上述UAS-EGFP系统进行交配。基于各自的表达载 体的标记物根据眼的巧光的有无选拔单个个体具有巧巾基因表达载体的系统、或具有巧中基 因表达载体的阴性对照用系统。由此，得到中部絹丝腺特异性表达EGFP基因且发生Seri基 因的表达抑制的系统，和不发生Seri基因的表达抑制的系统。
[0244] 3.絹丝腺的EGFP蛋白质的定量
[0245] 使用上述"2.基因重组家蚕的制作"所制作的各基因重组家蚕对EGFP蛋白质量进 行验证。从5龄第6天的幼虫摘出中部絹丝腺，每1根添加到10 m L的P B S (P Η 7.2 )/1 % Tween20/0.05%叠氮化钢，通过室溫下振荡24小时提取水溶性蛋白质。将得到的水溶性蛋 白质提取液W2000Xg离屯、10分钟，回收上清液。利用Reacti-Bind Anti-GFP Coated Plates(PIERCE)测定上清液含有的水溶性蛋白质中的EGFP蛋白质浓度。具体而言，在 Reacti-Bind Anti-GFP Coated Plates中添加 lOOyL上清液，室溫下静置1小时。利用PBS/ 0.05%Tween 20清洗3次后，添加 horseradish peroxidase-conjugated anti-GFP antibody (Rockland Immunochemicals)，室溫下静置 1小时。利用PBS/0.05 % Tween 20清洗 3次后，使用TMB化roxidase ΕΙΑ Substrate Kit(Bio-Rad)进行显色反应，添加 IN硫酸使 反应停止。将显色利用plate reade;r(SpectraMax250;Molecular Devices)定量。使用重组 GFP蛋白质(TAKARA BI0;Z2373N)的系列稀释液(l-400pgAiL)制作标准曲线。
[0246] (结果）
[0247] 图15示出各系统的每个个体的EGFP蛋白质量。表达3'SerlasRNA的系统与对照（图 15的"一")相比，具有约2倍的EGFP蛋白质量的上升。运表明通过在中部絹丝腺表达针对 Seri基因的重复序列区域的3'SerlasRNA,Seri基因的表达被抑制，最终外源性基因（此处 为EGFP基因）的表达增强。另一方面，利用3'SerlshRNA抑制Seri基因的表达虽然也增加 EGFP蛋白质量，但是与3 ' SerlasRNA相比，其增加量低。
[024引 <实施例5:利用SerlasRNA和Fib-H asRNA的表达增强外源性基因的表达>
[0249](目的）
[02加]验证通过将SerlasRNA和Fib-H asRNA组合进行表达，同时抑制Seri基因和Fib Η 基因的表达，从而能够更加增强外源性基因的表达。
[0巧^ 巧法）
[0巧2] 1.重组家蚕的制作
[0巧3] 将实施例3制备的具有中部&后部絹丝腺GAL4表达载体pBacFi地-pro GAL4_Ser- pro GAL4/3xP3DsRed2的中部&后部絹丝腺GAL4系统、UAS-3'Serl-門bHlasRNA系统和实施 例4制备的UAS-EGFP系统进行交配。另外，作为对照用，仅将中部&后部絹丝腺GAL4系统和 UAS-EGFP系统进行交配。根据各表达载体的标记物所致的眼的巧光的有无进行选拔，得到 絹丝腺特异性表达EGFP且中部絹丝腺和/或后部絹丝腺同时表达Fib-H asRNA和SerlasRNA 的基因重组家蚕各3个系统。
[0254] 2.絹丝腺的EGFP蛋白质的定量
[0255]使用上述"1.基因重组家蚕的制作"所制作的各基因重组家蚕，对于EGFP蛋白质量 进行验证。从5龄第6天的幼虫摘出絹丝腺，每1根添加到20mL的PBS(抑7.2)/l%Tween20/ 0.05%叠氮化钢，通过室溫下振荡24小时提取水溶性蛋白质。将得到的水溶性蛋白质提取 液 W2000Xg离屯、10分钟，回收上清液。使用Reacti-Bind Anti-GFP Coated Plates (PI邸CE)测定上清液含有的水溶性蛋白质中的EGFP蛋白质浓度。具体而言，在Reacti-Bind Anti-GFP Coated Plates中添加 lOOyL上清液，室溫下静置1小时。利用PBS/0.05 % Tween 20清洗3次后，添方口horseradish peroxid曰se-conju邑曰ted 曰nti-GFP 曰ntibody(Rockl曰nd Immunochemicals)，室溫下静置1小时。利用PBS/0.05 % Tween 20清洗3次后，使用TMB Peroxidase EIA Substrate Kit(Bio-Rad)进行显色反应，添加 IN硫酸使反应停止。将显色 利用plate reader(SpectraMax250 ;Molecular Devices)定量。使用重组GFP蛋白质 (TAKARA BIO;Z2373N)的系列稀释液(l-400pgAiL)制作标准曲线。
[0巧6](结果）
[0巧7] 图16示出各系统每个个体EGFP蛋白质量。在表达3'SerlasRNA和Fib-H asRNA的系 统中，与不抑制运些基因的表达的阴性对照（图17的"一")相比，在絹丝腺发现高的EGFP蛋 白质量。运一结果表明，通过作为中部絹丝腺和后部絹丝腺的主要蛋白质的Seri和Fib Η链 的合成被各自asRNA抑制，外源性基因（此处为EGFP基因）的表达增强。
[0258] <实施例6:利用SerlasRNA和Fib-H asRNA的表达减少夹杂蛋白质>
[0259] (目的）
[0260] 确认了阻碍目标肤的提取的凝胶状夹杂蛋白质（主要由丝胶蛋白和丝素蛋白构 成）可通过表达SerlasRNA和Fib-H asRNA而减少。
[0261] 巧法）
[0262] 从与实施例5制作的基因重组家蚕相同的系统的5龄第6天的幼虫各3头摘出中部 和后部絹丝腺。收集1头份儿的中部和后部絹丝腺并添加至4mLPBS，在4°C进行过夜颠倒揽 拌。4°C、W5000rpm离屯、，将得到的上清液装入15mL管，4°C静置48小时。使管上下颠倒，测量 落下的液量，计算相对于原来的液量百分之几的液体落下。
[02创（结果）
[0264] 图17示出结果。在不抑制Seri和Fib Η链基因的表达的阴性对照中上清液凝胶化， 白色浑浊。最终，即使将管上下颠倒提取液也完全不落下。另一方面，在来源于表达Ser las RNA和Fib-H as RNA的系统的试样中，上清不凝胶化，保持液体状态。将管上下颠倒时，平均 98%的提取液落下。运些结果表明，通过利用Serlas RNA和Fib-H as RNA分别抑制Seri基 因和Fib Η链基因的表达，能够有效除去成为絹丝腺提取液的凝胶化的原因的夹杂蛋白质。
[0265] 应予说明，将本说明书中引用的全部出版物、专利和专利申请直接作为参考援引 入本说明书。
【主权项】
1. 一种家蚕絹丝腺的外源性基因表达增强剂，其特征在于，含有能够使家蚕中部絹丝 腺特异性表达选自丝胶蛋白1反义RNA、丝胶蛋白2反义RNA和丝胶蛋白3反义RNA中的至少一 个反义RNA的反义RNA表达载体和/或能够使家蚕后部絹丝腺特异性表达丝素蛋白Η链反义 RNA的反义RNA表达载体作为有效成分，其中， 所述丝胶蛋白1反义RNA含有与编码序列编号1所示的家蚕丝胶蛋白1的氨基酸序列中 628位~1054位的重复序列区域的至少一个重复单元的碱基序列互补的序列， 所述丝胶蛋白2反义RNA含有与编码序列编号4所示的家蚕丝胶蛋白2的氨基酸序列中 41位~117位或685位~1359位的重复序列区域的至少一个重复单元的碱基序列互补的序 列， 所述丝胶蛋白3反义RNA含有与编码序列编号8所示的家蚕丝胶蛋白3的氨基酸序列中 141位~978位和1031位~1178位的重复序列区域的至少一个重复单元的碱基序列互补的 序列， 所述丝素蛋白Η链反义RNA含有与编码序列编号12所示的家蚕丝素蛋白Η链的氨基酸序 列中152位~5203位的重复序列区域的至少一个重复单元的碱基序列互补的序列。2. 根据权利要求1所述的外源性基因表达增强剂，其中，丝胶蛋白1的重复单元由序列 编号2所示的氨基酸序列构成， 丝胶蛋白2的重复单元由序列编号5或6所示的氨基酸序列构成， 丝胶蛋白3的重复单元由序列编号9或10所示的氨基酸序列构成，另外 丝素蛋白Η链的重复单元由序列编号13所示的氨基酸序列构成。3. 根据权利要求1所述的外源性基因表达增强剂，其中， 丝胶蛋白1反义RNA由序列编号3所示的碱基序列构成， 丝月父蛋白2反义RNA由序列编号7所不的喊基序列构成， 丝胶蛋白3反义RNA由序列编号11所示的碱基序列构成，另外 丝素蛋白Η链反义RNA由序列编号14所示的碱基序列构成。4. 根据权利要求1~3中任一项所述的外源性基因表达增强剂，其中，所述反义RNA表达 载体由2个亚单元构成。5. -种基因重组家蚕，其特征在于，具有能够使家蚕中部絹丝腺特异性表达选自丝胶 蛋白1反义RNA、丝胶蛋白2反义RNA和丝胶蛋白3反义RNA中的至少一个反义RNA的反义RNA表 达载体和/或能够使家蚕后部絹丝腺特异性表达反义RNA的丝素蛋白Η链反义RNA表达载体， 其中， 所述丝胶蛋白1反义RNA含有与编码序列编号1所示的家蚕丝胶蛋白1的氨基酸序列中 628位~1054位的重复序列区域的至少一个重复单元的碱基序列互补的序列， 所述丝胶蛋白2反义RNA含有与编码序列编号4所示的家蚕丝胶蛋白2的氨基酸序列中 41位~117位或685位~1359位的重复序列区域的至少一个重复单元的碱基序列互补的序 列， 所述丝胶蛋白3反义RNA含有与编码序列编号8所示的家蚕丝胶蛋白3的氨基酸序列中 141位~978位或1031位~1178位的重复序列区域的至少一个重复单元的碱基序列互补的 序列， 所述家蚕后部絹丝腺特异性表达的反义RNA含有与编码序列编号12所示的家蚕丝素蛋 白Η链的氨基酸序列中152位~5203位的重复序列区域的至少一个重复单元的碱基序列互 补的序列。6. 根据权利要求5所述的基因重组家蚕，其中， 丝胶蛋白1的重复单元由序列编号2所示的氨基酸序列构成， 丝胶蛋白2的重复单元由序列编号5或6所示的氨基酸序列构成， 丝胶蛋白3的重复单元由序列编号9或10所示的氨基酸序列构成，或 丝素蛋白Η链的重复单元由序列编号13所示的氨基酸序列构成。7. 根据权利要求5所述的基因重组家蚕，其中， 丝胶蛋白1反义RNA由序列编号3所示的碱基序列构成， 丝胶蛋白2反义RNA由序列编号6所示的碱基序列构成， 丝胶蛋白3反义RNA由序列编号9所示的碱基序列构成，或 丝素蛋白Η链反义RNA由序列编号14所示的碱基序列构成。8. 根据权利要求5~7中任一项所述的基因重组家蚕，其中，所述反义RNA表达载体由2 个亚单元构成。9. 根据权利要求8所述的基因重组家蚕，其中，所述2个亚单元存在于不同的染色体上。10. 根据权利要求5~9中任一项所述的基因重组家蚕，具有能够表达目标外源性基因 的外源性基因表达载体。11. 一种基因重组家蚕的制作方法，其特征在于，包括对家蚕给予权利要求1~4中任一 项所述的外源性基因表达增强剂的工序。12. -种在权利要求10所述的基因重组家蚕的絹丝腺中制造外源性基因编码的目标肽 的方法。
【专利摘要】本发明的课题在于开发并提供简便且有效抑制作为绢丝腺特异性主要蛋白质的丝胶蛋白和/或丝素蛋白H链的基因表达，以在基因重组家蚕中利用绢丝腺高效生产目标蛋白质作为蛋白质的大量生产系统的方法。本发明提供能够在家蚕体内表达反义RNA的家蚕系统，上述反义RNA将丝胶蛋白和/或丝素蛋白H链的重复序列区域作为靶部位。
【IPC分类】C12N15/113, C12P21/02, C12N15/09, A01K67/033
【公开号】CN105683373
【申请号】
【发明人】立松谦一郎, 濑筒秀树, 内野惠郎, 小岛桂
【申请人】国立研究开发法人农业生物资源研究所
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2014年10月14日