当的浓度的方式将外源性基因表达增 强剂利用水、缓冲液等溶剂溶解或稀释，制备给予溶液。此处，asRNA表达载体在asRNA编码 DNA的两端具有转座子的末端反向重复序列时，可W在给予溶液中添加具有编码转座子转 移酶的DNA的辅助载体，注射至家蚕的发育初期卵。此时使用的家蚕，可W是野生型家蚕，也 可W是W家蚕絹丝腺生产目标肤的具有外源性基因表达载体的基因重组家蚕。另外，外源 性基因表达增强剂含有辅助载体时，可W将上述给予溶液直接注射至家蚕发育初期卵。然 后，通过基于选拔标记物选拔转化体，能够得到目的基因重组家蚕。W该方法得到的基因重 组家蚕中，外源性基因表达增强剂中的asRNA表达载体介由转座子的末端反向重复序列组 装入染色体中。可W根据需要将该基因重组家蚕进行同胞交配或同系交配，得到插入染色 体中的表达载体的纯合子。
[0137] 另一方面，将分别在不同的染色体上具有第1实施方式记载的表达载体的第1亚单 元和第2亚单元的基因重组家蚕进行交配来制作本发明的基因重组家蚕的方法也可W通过 本领域公知的方法进行。例如，首先，将含有各个亚单元的第1外源性基因表达增强剂和第2 外源性基因表达增强剂分别给予各个家蚕。给予方法，与上述同样可W通过将基因表达载 体导入家蚕的方法，例如可W通过Tamura等的方法进行。此时，例如，在染色体上具有第1亚 单元的基因重组家蚕已经确立，能够利用其时，可W仅将含有与该第1亚单元对应的第2亚 单元的第2外源性基因表达增强剂导入家蚕。例如，染色体中具有在丝胶蛋白启动子运类中 部絹丝腺启动子的下游配置编码GAL4蛋白质的基因而成的第1亚单元的基因重组家蚕已经 确立，能够利用其时，可W仅将第2外源性基因表达增强剂给予家蚕，制作染色体上具有第2 亚单元的基因重组家蚕，所述第2外源性基因表达增强剂含有在作为GAL4蛋白质的祀序列 的UAS启动子的下游配置目的asRNA编码DNA而成的第2亚单元作为有效成分。得到的具有各 个亚单元的基因重组家蚕进行同胞交配或同系交配，关于各亚单元优选预先制为纯合子。 接下来，将具有各个亚单元的基因重组家蚕进行交配，通过选拔具有2个亚单元的F1个体， 能够得到目的基因重组家蚕。选拔是基于第1和第2亚单元各自的选拔标记物进行的。
[0138] 制作本实施方式的基因重组家蚕后，根据需要还可W进一步导入外源性基因表达 载体。此时，将外源性基因表达载体导入本实施方式的基因重组家蚕的方法，可W利用与上 述同样的方法进行。
[0139] 3.肤制造方法
[0140] 3-1.概要
[0141] 本发明的第3实施方式是肤制造方法。根据本实施方式的制造方法，在基因重组家 蚕的絹丝腺，能够在抑制丝胶蛋白、門b Η链等夹杂蛋白质的表达的情况下高效制造外源性 基因编码的目标肤。
[0142] 3-2.材料
[0143] 本实施方式的肤制造方法使用基因重组家蚕作为蛋白质的大量生产系统。本实施 方式使用的基因重组家蚕是具有第1实施方式记载的asRNA表达载体和外源性基因表达载 体的基因重组家蚕。即，换言之是具有外源性基因表达载体的上述第2实施方式的基因重组 家蚕。
[0144] 本实施方式使用的基因重组家蚕具有的外源性基因表达载体，包含编码在本实施 方式的肤制造方法中应制造的目标肤的外源性基因。
[0145] 3-3.制造方法
[0146] 本发明的制造方法，包括饲养工序和回收工序。W下，对各工序进行说明。
[0147] (1)饲养工序
[0148] "饲养工序"是饲养基因重组家蚕的工序。关于基因重组家蚕的饲养方法，可W按 照本领域公知的家蚕的饲养技术饲养。例如，可W参照"蚕种总论;高见丈夫著，全国蚕种协 会刊"。饲料可W使用桑属(Morus)的叶运类食草树种的天然叶，也可W使用Si化Mate L4M 或原蚕种1-3龄用（日本农业工业)运类人工饲料。从抑制疾病发生，能够进行W稳定的质 和量提供巧料，且根据需要能够无菌饲养的角度出发，优选为人工饲料。W下，对于基因重 组家蚕的简单的饲养方法，举一例说明。
[0149] 将幼蚕移动到蚕座进行饲养的作业是利用适当只数(例如，4~10只）的同系基因 重组家蚕的雌性产卵的卵而进行。将解化的幼虫从蚕卵纸转移至作为蚕座的铺有防干纸 (石蜡加工纸）的容器内，将Silk Mate等人工饲料摆放在防干纸上提供巧料。巧料的交换， 原则上在1~2龄各进行1次、在3龄进行1~3次。旧的巧料吃剩多时，为了防止腐败将其除 去。在4~5龄的健壮家蚕幼虫时的饲养，转移至大型容器，适当调整每个容器的只数。根据 湿度、容器内的状态，容器中也可W盖上防干纸、丙締酸树脂或钢丝网制的盖。饲养溫度，贯 穿全龄在25~28°C下饲养。
[0150] (2)回收工序
[0151] "回收工序"是回收基因重组家蚕的幼虫在絹丝腺内蓄积的目标肤的工序。
[0152] 本实施方式使用的基因重组家蚕，主要从幼虫的末龄后期开始表达外源性基因， 其编码的目标肤在絹丝腺细胞内蓄积。从该基因重组家蚕回收目标肤的方法没有限制。例 如，可举出在从末龄后期至前蛹期从虫体将絹丝腺摘出，直接回收目标肤的方法。具体的方 法可通过本领域公知的方法实现。例如，将末龄(5龄)第6天的将要吐丝之前的家蚕在冰上 进行麻醉后，将背侧切开利用大头针等W不伤害絹丝腺的方式摘出（参照森靖编，利用家蚕 的新生物学实验，Ξ省堂，1970，pp. 249-255)。将摘出的絹丝腺例如在上述提取缓冲液中0 ~l〇°C、优选为0~5°C的溫度下缓慢振荡，能够将目标肤溶解至缓冲液中。如果目标肤不是 热敏感性肤，可W在10~40°C的溫度下进行。然后，通过离屯、或过滤，将组织片等夹杂物除 去，回收含有目标肤的上清液。
[0153] 实施例
[0154] <实施例1:利用SerlasRNA抑制Seri基因的表达>
[0155] (目的）
[0156] 证明利用针对Seri基因的asRNA能够抑制作为中部絹丝腺特异蛋白质的丝胶蛋白 l(Serl)的基因表达。
[0157] (方法）
[0158] 1.家蚕中部絹丝腺特异性表达载体的制作
[0159] 作为家蚕中部絹丝腺能够特异性表达的表达载体，制作表达针对Seri基因的 asRNA(记为"SerlasRNA")的SerlasRNA表达载体和表达针对Seri基因的shRNA(记为 "SerlshRNA"。应予说明，本说明书的shRNA也包括具有发夹结构的long dsRNA)的 SerlshRNA表达载体。
[0160] (l)UAS骨架质粒的制作
[0161] 将 pAm 切 an 1-N1 (Takar a)作为模板，将Am 切 anko zakU (序列编号 2 3)和 SV40PCRL (序 列编号24)用作引物对进行PCR扩增，插入pZ化0-2载体（life technologies)。将其作为 AmCy曰n/pZero2〇
[0162] 另外，将祀YFP-Nl(clonetech)作为模板，将EYFPkozakU(序列编号25)和SV40PC化 用作引物对进行PCR扩增，插入pZ化0-2载体（1 if e technologies)。将其作为EYFP/pZero2。
[0163] 利用化oI-Notl将Am切an/pZero2和EYFP/pZero2切断，通过将得到的Ncol-Notl片 段插入pBac[Se;rUAS/3xP3EGFP](Tatematsu K.et al.,2010,TYansgenic Research,19 (3):473-87)的NcoI-NotI部位，由此将标记物基因由EGFP替换为Am切an或EYFP。将运些质 粒作为地ac [ SerUAS/3xP3AmCyan ]或地ac [ SerUAS/3xP3EYFP ]。
[0164] (2)Serl片段的克隆
[0165] 从家蚕白/C系统的5龄第6天的中部絹丝腺提取总RNA(Isogen Nippon Gene)。使 用oligo dT primeHPromega)和逆转录酶(ReverTra Ace TOYOBO)对总RNA进行逆转录，得 到cDNA。将得到的cDNA作为模板，使用SpeSerlB130U23(序列编号26)和BlnSerlB1636L23 (序列编号27)、W及BlnSerlB130U23(序列编号28)和SpeSerlB1636L23(序列编号29)运巧中 引物对进行PCR，得到Seri的5 '端的片段。将运些核酸片段作为5 ' SerlSB和5 ' SerlBS。
[0166] 另外，同样将得到的cDNA作为模板，使用SpeSerlB1531U24(序列编号30)和 BlnSerlB3108L23(序列编号 31)、W及BlnSerlB1531U24(序列编号 32)和 SpeSerlB3108L23 (序列编号33)运2种引物对进行PCR，得到Seri的3'端的片段。将运些核酸片段作为3' SerlSB和3'SerlBS。
[0167] (3)shRNA连接体的制作
[0168] 制作相当于shRNA的环部分的连接体。将家蚕白/C系统的基因组DNA作为模板，引 物对使用BlnA3intU(序列编号34)和SpeA3IntL(序列编号35)对肌动蛋白3的内含子进行 PCR扩增。将得到的核酸片段作为连接体A3intBS。
[0169] (4)SerlasRNA表达载体的制作
[0170] 在上述（1)制作的pBac[SerUAS/3xP3Am切an]的Blnl部位WBlnl成为5'端的方式 插入5'SerlSB。将该质粒作为地ac[SerUAS-5'asSerl/3xP3Am切an](图3A)。地ac[SerUAS- 5 'asSerl/3xP3AmCyan]是表达5 ' SerlasRNA的5 ' SerlasRNA表达载体，该5 ' SerlasRNA将不 含有重复序列区域的Seri基因的5'端区域作为祀部位。
[0171] 另外，在pBac[SerUAS/3xP3EYFP]的Blnl部位WBlnl成为5'端的方式插入3' SerlSB。将该质粒作为pBac[SerUAS-3'asSerl/3xP3EYFP](图3B)KpBac[SerUAS-3' asSerl/3xP3EYFP]是表达3 ' SerlasRNA的 3 ' SerlasRNA 表达载体，该3 ' SerlasRNA 将在Seri 基因的3'端存在的重复序列区域作为祀部位。3'SerlasRNA表达载体，相当于含有本发明的 外源性基因表达增强剂作为有效成分的asRNA表达载体的第2亚单元。
[0172] (5) SerlshRNA表达载体的制作
[0173] 在5'SerlasRNA表达载体的Blnl部位WBlnl部位成为5'端的方式插入连接体 A3in巧S，进一步WBlnl部位成为5'端的方式插入5'SerlBS。将该质粒作为pBac[SerUAS-5' dsSerl/3xP3Am切an](图4A)。地ac[SerUAS-5'dsSerl/3xP3Am切an]是表达5'SerlshRNA的 5 ' SerlshRNA表达载体，该5 ' SerlshRNA将Seri基因的5 '端区域作为祀部位。
[0174] 另外，在3'SerlasRNA表达载体的Blnl部位WBlnl部位成为5'端的方式插入连接 体A3in巧S，进一步WBlnl部位成为5'端的方式插入3'SerlBS。将该质粒作为地ac[SerUAS- 3 ' dsSerl/3xP3EYFP](图4B)。地ac[SerUAS-3 ' dsSerl/3xP3EYFP]是表达3 ' SerlshRNA的3 ' SerlshRNA表达载体，该3 ' SerlshRNA将Seri基因的3 '端存在的重复序列区域作为祀部位。
[0175] 2.基因重组家蚕的制作
[0176] (1)表达载体的导入
[0177] 分别将上述"1.家蚕中部絹丝腺特异性表达载体的制作"中制作的作为SerlasRNA 表达载体的地 ac[SerUAS-5'asSerl/3xP3Am 切 an]、地 ac[SerUAS-3'asSerl/3xP3EYFP 巧口作 为 SerlshRNA 表达载体的 pBac[SerUAS-5'dsSerl/3xP3Am 切 an 巧日 pBac[SerUAS-3'dsSerl/ 3xP3EYFP]个别地与表达转座子转移酶的辅助质粒pHA3PIG(Tamura T.et al. ,2000， 化ture Biotechnology, 18,81-84) : 1的比例混合，注射至产卵后2~8小时的wl-pnd系 统的家蚕卵中。注射后的卵，在加湿状态下，在25°C解育直至解化。解化的幼虫，在25~27°C 的饲养室内利用人工饲料(Silk Mate原种1-3龄S、日本农产工)饲养全龄。每2~3天交换人 工饲料化chino K.et al. ,2006 J Insect Biotechnol Seri col,75:89-97)。羽化后，进 行同胞交配。根据作为各自选拔标记物的3XP3EYFP标记物或3xP3Am切an标记物所致的眼的 巧光的有无选拔得到的F1卵，得到基因重组家蚕系统。
[0178] (2)与中部絹丝腺GAL4系统的交配
[0179] 将上述"(1)表达载体的导入"所得到的各基因重组家蚕系统每种3系统地与图5所 示的具有pBacSer-pro GAL4/3xP3DsRed2(Tatematsu K.et al.,2010,Transgenic Research,19(3) :473-87)的基因重组家蚕系统交配。此处，pBacSer-pro GAL4/3xP3DsRed2 是中部絹丝腺特异性表达GAL4基因的中部絹丝腺GAL4表达载体，相当于含有本发明的外源 性基因表达增强剂作为有效成分的asRNA表达载体的第1亚单元。在F1个体中，根据 3xP3EYFP标记物或3xP3Am切an标记物W及3xP3DsRed2标记物所致的眼的巧光的有无选拔 具有SerlasRNA表达载体或SerlshRNA表达载体（第2亚单元）和pBacSer-pro GAL4/ 3xP3DsRed2(第1亚单元)两者的系统，得到中部絹丝腺特异性表达SerlasRNA或SerlshRNA 的基因重组家蚕。由于每种3系统地使用具有第2亚单元的基因重组家蚕，因此，中部絹丝腺 特异性表达SerlasRNA或SerlshRNA的基因重组家蚕也分别得到每种3系统。
[0180] 3.SerlmRNA 的定量
[0181] 使用上述"2.基因重组家蚕的制作"所制作的中部絹丝腺特异性表达SerlasRNA或 SerlshRNA的基因重组家蚕，对各基因重组家蚕的中部絹丝腺的Seri基因的表达抑制效果 进行验证。
[0182] 从各基因重组家蚕的5龄第6天的幼虫摘出中部絹丝腺，使用IS0GEN(Nippon Gene)提取总RNA。使用oligo dT引物（Promega)和逆转录酶（ReverTra Ace T0Y0B0)对总 RNA进行逆转录，制备cDNA。将得到的cDNA作为模板，使用SerlLC3364(序列编号36)和 SerlLC3528L(序列编号37)的引物对通过Li曲t 切cler FastStad DNA Master SYBR Green(Roche)进行Seri的mRNA的定量PCR。内标使用巧49LCF2(序列编号38)和巧49LCR1 (序 列编号39)的引物对，同样进行定量PCR。
[0183] 4. Seri蛋白质量的验证
[0184]使用上述"2.基因重组家蚕的制作"所制作的中部絹丝腺特异性表达SerlasRNA或 SerlshRNA的基因重组家蚕确认在蛋白质水平也抑制Seri蛋白质的合成。饲养各基因重组 家蚕，得到虽后，向lOmg虽添加 ImL的50mM Tris-肥1(P册.0)/8M尿素 /lOmM