Fib Η启动子、含有序列编号19表示的碱基序列的来源于昨蚕的Fib Η启动子、含有 序列编号20表示的碱基序列的来源于家蚕的Fib L启动子、含有序列编号21表示的碱基序 列的来源于昨蚕的Fib L启动子和含有序列编号22表示的碱基序列的来源于家蚕的p25启 动子等。
[0088] (3)终止子
[0089] 终止子由在导入asRNA表达载体的宿主的后部絹丝腺细胞内能够终止asRNA的转 录的碱基序列构成。
[0090] (4)标记基因
[0091] 标记基因是编码也被称为选拔标记物的标记蛋白质的基因。标记蛋白质是指基于 其活性能够判断标记基因的表达的有无的多肤。因此，asRNA表达载体通过含有标记基因， 能够基于标记蛋白质的活性容易判断具有asRNA表达载体的基因重组家蚕。此处"基于活 性"是指"基于活性的检测结果"。活性的检测，可W是直接检测标记蛋白质的活性本身，也 可W是介由由标记蛋白质的活性生成的色素运类代谢物间接检测。检测可W是化学检测 (包括酶反应的检测）、物理检测(包括行动分析的检测）或检测者的感觉检测(包括利用视 觉、触觉、嗅觉、听觉、味觉的检测）的任意一个。
[0092] 标记蛋白质的种类只要是通过该领域公知的方法能够检测其活性即可，没有特别 限制。优选为检测时对基因重组家蚕的侵袭性低的标记蛋白质。例如，可举出巧光蛋白质、 色素合成蛋白质、发光蛋白质、外部分泌蛋白质、控制外部形态的蛋白质等。巧光蛋白质、色 素合成蛋白质、发光蛋白质和外部分泌蛋白质，由于在特定的条件下能够视觉检测，因此对 基因重组家蚕的侵袭性非常低，判断和选拔容易，所W特别优选。
[0093] 上述巧光蛋白质是指对基因重组家蚕照射特定波长的激发光时发出特定波长的 巧光的蛋白质。其可W是天然型和非天然型的任意一个。另外，激发波长、巧光波长也没有 特别限制。具体而言，例如，可举出CFP、Am切an、RFP、DsRed (包括DsRed monomer、DsRed2运 类衍生物）、YFP、GFP (包括EGFP、EYFP等衍生物)等。
[0094] 上述色素合成蛋白质是参与色素的生物合成的蛋白质，通常为酶。此处所谓"色 素"是能够对转化体赋予色素的低分子化合物或肤，其种类不限。优选为作为个体的外部色 彩表现的色素。例如，可举出黑色素系色素(包括多己胺黑色素）、眼色素系色素或噪晚系色 素。
[0095] 上述发光蛋白质是指不需要激发光能够发光的底物蛋白质或催化该底物蛋白质 发光的酶。例如，可举出水母发光蛋白、作为酶的巧光素酶。
[0096] 本说明书中外部分泌蛋白质是分泌至细胞外或体外的蛋白质，属于外分泌性酶 等。外分泌性酶中，包括有助于杀稻攝菌素运类药剂的分解或灭活而赋予宿主耐药性的酶， 除此之外还包括消化酶。
[0097] 标记基因在asRNA表达载体中在上述的启动子的下游W能够表达的状态配置。使 用的启动子可W与asRNA编码DNA相同，也可W不同。
[009引 （5)绝缘子
[0099] 绝缘子是在不受到周围的染色体的染色质影响下稳定控制被该序列夹持的基因 的转录的序列。例如，可举出鸡的C服4序列、果蛹的gypsy序列等。
[0100] (6)转座子的末端反向重复序列
[0101] 转座子的末端反向重复序列（Inverted terminal repeat sequence)(化ndler AM.et al.，1998，Proc.化11.Acad.Sci.U.S.A.95:7520-5)在asRNA表达载体为能够重组的 asRNA表达载体时可W被含有。末端反向重复序列配置于asRNA表达载体的上游和下游。作 为转座子，能够使用pi ggyBac、mariner、minos等（Shimizu,K.et al.,2000,Insect Mol.Biol.，9,277-281;Wang W.et al.，2000，Insect Mol Biol 9(2):145-55)。
[0102] (7)编码转录调节因子的DM
[0103] "编码转录调节因子的DNA"是后述的第1亚单元的必要元素，是指转录调节因子的 基因。本说明书中所谓的"转录调节因子"是指与后述的祀启动子结合，能够活化该祀启动 子的蛋白质因子。例如，可举出作为酵母的半乳糖代谢活化蛋白质的GAL4蛋白质和作为四 环素控制性转录活化因子的tTA及其突变体等。
[0104] (8)转录调节因子的祀启动子
[0105] "转录调节因子的祀启动子"是后述的第2亚单元的必要元素，是指通过由第1亚单 元编码的转录调节因子进行结合，在其控制下能够活化某个基因表达的启动子。上述转录 调节因子及其祀启动子，与上述转录调节因子具有对应关系，通常，如果确定转录调节因 子，那么必然也能够确定其祀启动子。例如，转录调节因子为GAL4蛋白质时，使用UAS (Upstream Activating Sequence)。
[0106] (9)外源性基因
[0107] 外源性基因，如上述定义所述，是在絹丝腺内能够表达的外来性基因，编码目标 肤。本实施方式的外源性基因表达增强剂所含有的asRNA表达载体的本来的功能是使抑制 Seri~Ser3、Fib Η链等祀基因的表达的asRNA进行表达。因此，编码目标肤的外源性基因， 与asRNA表达载体的构成没有直接关系。但是，asRNA的目的是通过抑制上述祀基因的表达， 间接地增强外源性基因的表达，高效生产目标肤。即，外源性基因是在本实施方式的外源性 基因表达增强剂发挥其效果的基础上必要的对象物。因此，给予本实施方式的外源性基因 表达增强剂的宿主昆虫不具有在絹丝腺内能够表达的外源性基因时，不能充分实现本发明 的目的。编码目标肤的外源性基因，通常，包含于后述的其他的基因表达载体(外源性基因 表达载体），与asRNA表达载体相独立地导入相同的宿主昆虫。但是，也可W在能够表达作为 该对象物的外源性基因的状态下包含于asRNA表达载体。asRNA表达载体含有外源性基因 时，为了外源性基因在絹丝腺内能够表达，在其上游可W配置上述中部絹丝腺特异启动子 和/或后部絹丝腺特异启动子。
[0108] B. asRNA表达载体的单元构成
[0109] asRNA表达载体包括由1个基因表达单元构成的情形和由2个基因表达单元构成的 情形。W下对各个情形进行说明。
[0110] (1)由1个基因表达单元构成的情形
[0111] asRNA表达载体由1个基因表达单元构成时，只要对家蚕给予含有该asRNA表达载 体的外源性基因表达增强剂，就能够在家蚕细胞内表达目的asRNA。运类asRNA表达载体，将 在表达asRNA方面必要的全部构成元素包含于1个单元内。即，包含至少1个由作为必要构成 元素的启动子及在该启动子的下游功能性结合的asRNA编码DNA构成的1组表达系统。该1组 表达系统可W是在1个启动子控制下含有1个asRNA编码DNA的系统，也可W是含有2个W上 asRNA编码DNA的系统。
[0112] (2)由2个基因表达单元构成的情形（图2)
[0113] asRNA表达载体由第1亚单元和第2亚单元2个基因表达单元构成时，在表达asRNA 方面必要的构成元素各自分开存在于2个单元。因此，只要运2个在家蚕细胞内存在就能作 为1个asRNA表达载体发挥功能，表达目的asRNA。各亚单元具有W下构成。
[0114] 第1亚单元含有启动子和在该启动子的下游功能性结合的编码上述转录调节因子 的DNA而成。图2A~C例示第1亚单元。第1亚单元中使用的启动子，与上述控制asRNA编码DNA 的表达的启动子同样地，使用在家蚕絹丝腺能够发挥功能的启动子。例如，可举出如图2A表 示的后部絹丝腺启动子所示的Fib H、Fib L或p25等在后部絹丝腺特异且大量合成的蛋白 质的基因启动子，如图2B表示的中部絹丝腺启动子所示的丝胶蛋白蛋白质等在在中部絹丝 腺特异且大量合成的蛋白质的基因启动子。如图2C所示，第1亚单元内具有多组由启动子和 编码转录调节因子的DNA构成的组，能够将各个启动子设定为后部絹丝腺启动子和中部絹 丝腺启动子运样不同的组合。应予说明，图2A~C中，作为编码转录调节因子的DNA，例示 GAL4基因。
[0115] 第2亚单元含有由上述第1亚单元编码的上述转录调节因子的祀启动子及与该祀 启动子的下游功能性结合的asRNA编码DM而成。图2D和E表示第2亚单元的一例。图2D中，作 为GAL4的祀启动子，例示UAS。另外，第2亚单元，除了如图2D所示在1个祀启动子控制下含有 1个asRNA编码DNA的系统夕h还可W是如图沈所示在1个祀启动子控制下含有2个W上asRNA 编码DM的系统。应予说明，asRNA表达载体含有编码目标肤的外源性基因时，优选包含于第 2亚单元。
[0116] 本构成的asRNA表达载体，如上述所示W第1和第2亚单元的1组发挥功能。通过絹 丝腺表达启动子的活化，由第1亚单元表达的转录调节因子活化第2亚单元的祀启动子，从 而表达目的asRNA。另外，第2亚单元可W由含有相同的或不同的asRNA编码DNA的2个W上亚 单元构成。此时，由1个第1亚单元表达的转录调节因子，通过活化多个第2亚单元的祀启动 子，能够表达由各个第2亚单元编码的asRNA。
[0117] 本构成的asRNA表达载体，介由由第1亚单元编码的转录调节因子能够使第2亚单 元的asRNA编码DNA的表达扩增。因此，在第1亚单元的絹丝腺表达启动子的表达能力不高 时，特别优选。
[011引本构成的asRNA表达载体，只要仅将第2亚单元的asRNA编码DNA区域W表达框与其 他asRNA编码DNA区域交换，就存在第1亚单元能够共同使用的情形。即，第1亚单元也能够利 用已有的基因表达载体或导入其的基因重组家蚕系统。因此，由2个基因表达单元构成的 asRNA表达载体，在制造表达单元、基因重组家蚕的成本方面W及劳动方面也是方便的。
[0119] 应予说明，asRNA表达载体由第1亚单元和第2亚单元2个亚单元构成时，本实施方 式的外源性基因表达增强剂，原则上由含有第1亚单元作为有效成分的第1外源性基因表达 增强剂和含有第2亚单元作为有效成分的第2外源性基因表达增强剂的2剂1组的形式构成。 如上述所示，第1亚单元由于能够共同使用，因此第1外源性基因表达增强剂和第2外源性基 因表达增强剂并不一定需要是1对1的对应，也能够得到将第1外源性基因表达增强剂作为 共同剂，仅交换第2外源性基因表达增强剂的各种2剂1组的组合的构成。另外，给予本实施 方式的外源性基因表达增强剂的宿主昆虫，如果是染色体内已经具有第1亚单元的基因重 组昆虫，那么本实施方式的外源性基因表达增强剂可W仅由将与该第1亚单元对应的第2亚 单元作为有效成分的第2外源性基因表达增强剂构成。
[0120] 1-3-2.担载体
[0121] 本发明的外源性基因表达增强剂，根据需要能够含有可接受的担载体。"可接受的 担载体"可举出昆虫学领域中通常使用的溶剂、辅助剂等。
[0122] 溶剂中，例如，可举出水或水溶液、或者对于家蚕可接受的有机溶剂。作为水溶液， 例如，可举出缓冲液(憐酸盐缓冲液、乙酸钢缓冲液等）、生理食盐水、等张溶液。通常，使用 水或水溶液。
[0123] 辅助剂中，例如，可举出辅助载体。辅助载体，例如，含有编码转座子转移酶的DNA。 作为外源性基因表达增强剂的有效成分的asRNA表达载体具有转座子的末端反向重复序列 时，辅助载体通过生产转座子转移酶，能够实现asRNA表达载体插入宿主昆虫的染色体内。 作为辅助载体，如果宿主昆虫是家蚕的情形，例如，可举出抑A3PIG。作为其他辅助剂可举出 葡萄糖、D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钢、其他也可W是低浓度的非离子性表面活 性剂、聚氧乙締脱水山梨醇脂肪酸醋类等。
[0124] 2.基因重组家蚕
[0125] 2-1.概要
[0126] 本发明第2实施方式是基因重组家蚕。本实施方式的基因重组家蚕，其特征在于， 具有上述第1实施方式记载的asRNA表达载体。本实施方式基因重组家蚕进一步具有外源性 基因表达载体时，由asRNA表达载体表达的asRNA抑制成为其祀的丝胶蛋白、門b Η链等内源 性基因的表达。由此，能够在家蚕絹丝腺内高效生产由外源性基因编码的目标肤。
[0127] 2 - 2.构成
[0128] 本发明的基因重组家蚕具有上述第1实施方式记载的asRNA表达载体。关于asRNA 表达载体的构成，由于与第1实施方式记载的asRNA表达载体相同因此省略其说明，此处对 本实施方式的基因重组家蚕特有的构成进行说明。
[0129] 基因重组家蚕中，第1实施方式记载的asRNA表达载体，可W在家蚕细胞内暂时存 在，此外也可导入染色体中的状态等稳定持续存在。通常，优选稳定且持续存在。
[0130] 基因重组家蚕能够具有第1实施方式记载的不同的2个W上的asRNA表达载体。例 如，基因重组家蚕，可W具有由1个基因表达单元构成的表达载体和由2个基因表达单元构 成的表达载体运二者。此时，各个asRNA表达载体可W含有相同的或不同的asRNA编码DNA。
[0131] 基因表达单元如上述所示由第1亚单元和第2亚单元2个构成，各自在家蚕的染色 体上存在时，各亚单元可W在相同染色体上存在，也可W在不同的染色体上存在。各亚单元 在不同的染色体上存在时，通过将仅具有第1亚单元(优选为纯合子）的基因重组家蚕的系 统和仅具有第2亚单元(优选为纯合子)的基因重组家蚕的系统交配，在F1中能够容易得到 具有第1亚单元和第2亚单元的本发明的基因重组家蚕。此时，上述仅具有第1亚单元的基因 重组家蚕的系统，如第1实施方式记载所示，能够共同用于与各种仅具有第2亚单元的基因 重组家蚕的系统的交配。
[0132] 另一方面，第1亚单元和第2亚单元在相同染色体上存在时，为了在传代过程中不 因重组导致彼此分离，优选亚单元间的距离近，相互关联。
[0133] 本实施方式的基因重组家蚕，并不一定需要含有编码目标肤的外源性基因。如上 述所示，运是因为已经具备通过具有asRNA表达载体抑制祀基因的表达的、作为本实施方式 的基因重组家蚕的功能。但是，如果是仅具有asRNA表达载体的构成，不能实现在家蚕絹丝 腺提高由外源性基因编码的目标肤的生产效率运一本发明的目的。为了在家蚕絹丝腺提高 目标肤的生产效率，本实施方式的基因重组家蚕需要作为应发挥该功能的对象物的外源性 基因的存在。因此，将本实施方式的基因重组家蚕作为蛋白质的大量生产系统使用时，除了 asRNA表达载体，还需要进一步具有编码目标肤的外源性基因的表达系统(外源性基因表达 载体）。外源性基因表达载体，根据需要，可本实施方式的基因重组家蚕预先保有的方 式制备。应予说明，asRNA表达载体含有编码目标肤的外源性基因时，本实施方式的基因重 组家蚕通过具有asRNA表达载体也能够同时实现本发明的目的。
[0134] 2-3.制作方法
[0135] 本实施方式的基因重组家蚕的制作方法是能够制作由上述第1实施方式记载的表 达载体表达目的asRNA的重组家蚕的方法即可，也能够采用任意的方法，没有特别限制。作 为制作运样的重组家蚕的方法，例如，可举出将上述第1实施方式的外源性基因表达增强剂 对作为宿主的家蚕给予的方法、将在不同的染色体上具有第1实施方式记载的asRNA表达载 体的第1亚单元和第2亚单元的基因重组家蚕进行交配的方法。
[0136] 将上述第1实施方式的外源性基因表达增强剂对家蚕给予的方法，可W通过能够 将作为外源性基因表达增强剂的有效成分的asRNA表达载体导入家蚕的本领域公知的方法 进行。例如，将第1实施方式的外源性基因表达增强剂对家蚕卵给予时，能够利用将基因表 达载体导入家蚕的Tamura等的方法（Tamura T.et al.,2000,化 1:ure Biotechnology,18, 81-84)。具体而言，按照包含的asRNA表达载体成为适