肺炎链球菌的检测的制作方法
【专利说明】肺炎链球菌的检测
[0001] 发明背景
[0002] 肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae)是脈毒症（sepsiS)的致病剂，并且能够 特异性检测其在血液中的存在将会是方便的。肺炎链球菌还是社区获得性肺炎 (community-acquired pneumonia)的主要成因。非常重要的是，能够区分肺炎链球菌与链 球菌族群的其他成员，从而确定样品中存在的任何链球菌是否实际上对应于致病肺炎链球 菌种，或对应于宿主中组成性地存在的不引起疾病的其他无害链球菌种。
[0003] 已经进行了许多尝试W检测肺炎链球菌并且将其与链球菌族群的其他成员区分 (Wessels 等人，J. Clin.Microbiol. 2012年4 月，第50卷，第4期，1171-1177)。运些包括培养 物测试和常规生物化学和表型测试，如革兰氏染色形态、奥普托欣敏感性、菌落形态、和羊 血琼脂上的α-溶血。所使用的另外的技术包括:MALDI-T0F(MS基质辅助激光解吸电离-飞行 时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry))、若干基因的序列分析、和包括实时PCR测定在内的分子测定。然而，归因于 不同种之间的高度序列相似性，运些技术中的大多数不能将肺炎链球菌与链球菌族群的其 他成员区分。其他技术包括用于检测链球菌属细菌的基于基因 rpoB区域的扩增的分子方 法。在EP 1558637和EP 1694861中提供了运种方法的两个具体实例。
[0004] EP 1558637利用巧oB基因的724bp片段(在W0 2004/041841 中显示为沈Q IDN212 )，用于检测可能存在于样品中的链球菌属细菌。可W通过指定片段的扩增来进行运样的检 测。然而，没有为链球菌属的不同种的特异性检测提供特定的探针。
[0005] 在EP1694861中，利用对于所有链球菌属的种常见的一对引物扩增rpoB基因的片 段。从而得到扩增产物，而如在W上EP 1558637中的，与可W存在于样品中的特定种无关。 在本情况中，提供了探针，其预期用于肺炎链球菌和酿脈链球菌（Streptococcus pyogenes)的特异性检测（相应WO 2005/059156的表3)。然而，一些探针之间的最小序列差 异可W证实W下是困难的:运样的探针可W实际上用于它们祀向的两种不同链球菌种的特 异性检测（例如：SEQ IDN24和SEQ IDN95的探针，分别对应于酿脈链球菌和肺炎链球菌， 仅有两个核巧酸的差异）。没有提供对应于链球菌属的其他种的其他探针。
[0006] 考虑到W上信息，需要提供基于探针杂交的用于相对于链球菌属的其他种特异性 检测肺炎链球菌的有效方法。换句话说，非常理想的是提供允许差异检测样品中存在的肺 炎链球菌的的方法，即与链球菌属的其他种相区别的肺炎链球菌的特异性检测。
[0007] 发明概述
[000引本发明要解决的问题是提供用于检测样品中存在的肺炎链球菌的方法，其允许特 异性地区分肺炎链球菌与链球菌属的其他种。
[0009] 解决方案基于同时使用包含SEQ IDN叫和SEQ (参见W下表1)或由其组成 的探针W检测样品中肺炎链球菌的存在。在一个实施方案中，探针由SEQ IDN&1:或SEQ ID 组成。
[0010] 如W上所指出的，在链球菌属的不同种之间存在高序列相似性；当试图通过探针 杂交检测肺炎链球菌并且将其与其他链球菌种特异性区分时，运种情况构成了沉重的负 担。SEQ IDN21和SEQ 10^?的探针W及因此的本发明的各种方面允许有效地检测肺炎链 球菌并且将肺炎链球菌与链球菌属的至少W下种区分：星座链球菌（S化eptococcus(S.) constellatus)、咽峡炎链球菌（S.anginosus)、轻型链球菌（S.mitis)、解没食子酸链球菌 (S. gallolyticus)、停乳链球菌（S. dysgalactiae)、酿脈链球菌（S.pyogenes)、猪链球菌 (S. suis)、中链球菌（S. intermedins)、血链球菌（S. sanguinis)、口腔链球菌（S.oralis)和 副血链球菌（5.9日招3日雌11；[]113)。
[0011] 根据本发明的各种方面，通过与如SEQ ID：N21和SEQ IDN22中定义的两个探针的 杂交进行同时检测，用于肺炎链球菌的特异性检测。仅当样品中存在的DNA对应于肺炎链球 菌时，才发生与运两种探针的结合。在没有或仅一种SEQ IDN21和SEQ 的探针结合 样品中存在的DNA的情况下，该DNA不对应于肺炎链球菌，而是对应于链球菌属的其他种。唯 一的例外是含有轻型链球菌的DNA的样品的情况，在运种情况中，样品DNA与SEQ IDN:叫的 探针结合，还在一定水平上发生了DNA与SEQ IDN^的探针的结合，但是比与SEQ IDN91的 探针结合低得多的程度(参见W下实施例2)。"低得多的程度"理解为意味着与利用SEQ ID N21获得的结合水平相比20 % W下的结合水平。
[0012] 表1.
[0013]
[0014] 如由表1的SEQ IDN23、SEQ IDN94和SEQ ID护5定义的探针也结合肺炎链球菌 的核酸。然而，已经证实它们是非特异性的，因为它们也任意地结合链球菌属的其他种的核 酸，而不遵循任何类型的可预测模式。
[0015] 发明人不清楚现有技术水平中或探针序列中存在任何线索（pointer)，w解释为 什么与SEQ IDN叫和SEQ 的探针的同时杂交会导致W将会允许将其与链球菌属的其 他种W特定方式区分的方式检测肺炎链球菌。在解链溫度、核巧酸的数量、％GC(表1)方面 或运些探针区别于肺炎链球菌野生型序列的核巧酸数量方面没有要发现的解释(表2)。
[0016] 表2. SEQ IDN21至5的探针区别于肺炎链球菌野生型序列和链球菌属的其他种的 序列的核巧酸数量：
[0017]
[
[0019] 有时已经检测了某些种的序列的不同变体。运是为什么有时某个探针区别于链球 菌的某个种的序列的核巧酸数量在两个值之间的范围内的原因。
[0020] 发明人因此已经意外地发现，利用如由SEQ IDN21和SEQ IDN22定义的探针同时 溫育允许检测肺炎链球菌并且特异性地区分肺炎链球菌与链球菌属的其他种。因此，SEQ IDN^l和SEQ IDN22的探针的同时使用提供了对于样品中肺炎链球菌的特异性检测的问 题的解决方案。运对于将肺炎链球菌与其他微生物相区分是非常重要的;尤其是，与宿主中 组成性地存在的并且不引起疾病的无害链球菌种(尤其是呼吸道中的）相区分。运对于作为 脈毒症的致病剂存在于血液中的肺炎链球菌的检测来说也是重要的。
[0021] 本发明的方面之一因此对应于一种用于检测试验样品中肺炎链球菌的方法，所述 方法包括使所述样品与由SEQ IDN-91和SEQ IDN92定义的探针接触。探针可W设置在微阵 列中。
[0022] 本发明的第二方面对应于一种用于检测试验样品中肺炎链球菌的试剂盒，其中所 述试剂盒包含一个阵列容器或一组阵列容器，其各自包含其中设置SEQ ID神η和SEQ ID N22的探针的微阵列。
[0023] 本发明的第Ξ和第四方面分别对应于探针组，所述探针组包括探针SEQ IDN^l和 SEQ IDN22,并且对应于一种微阵列，所述微阵列包含该探针组。另一个方面设及由SEQ ID N21组成的分离的核酸序列并且设及包含SEQ IDN21的微阵列。在一个实施方案中，分离的 核酸序列用可检测部分标记。另一个方面设及由SEQ 10^^吗组成的分离的核酸序列并且设 及包含SEQ IDN22的微阵列。在一个实施方案中，分离的核酸序列用可检测部分标记。另一 个方面设及包含沈Q IDN^I和/或沈Q IDN?2的组合物。
[0024] 本发明的另外的方面对应于本发明的方法、试剂盒、微阵列、分离的核酸序列或探 针组用于检测肺炎链球菌W及用于诊断患者中由肺炎链球菌导致的感染的用途。尤其是， 感染是脈毒性感染或呼吸道感染。
[0025] 在另一个方面中，本发明设及一种用于诊断患者中由肺炎链球菌导致的感染的方 法，所述方法包括使来自所述患者的样品与由SEQ IDN^l和SEQ IDN02定义的探针接触。
[0026] 附图简述
[0027] 图1.
[0028] 图1示出了本发明的实施例1的扩增产物(事先变性)与具有包含本发明的SEQ ID N21和SEQ IDN22的探针的微阵列杂交的可视化。
[0029] 被矩形包围的"斑点"对应于SEQ IDN21和SEQ IDN92的探针的位置。在被每个矩 形包围的两个"斑点"中，第一个对应于SEQ IDN21，并且第二个对应于SEQ IDN22。矩形外 显示信号的"斑点"对应于位置标记物。
[0030] 含有肺炎链球菌的实施例1的样品在对应于SEQ IDlsfl和SEQ 的探针的两 个位置处显示阳性信号并且具有相等的强度。运归因于样品的扩增并变性的DNA与运两种 探针的特异性结