中，所使用 的标记是生物素。然而，可W使用任何本领域中已知的其他类型的标记（例如洋地黄毒巧 (digoxigeniη))。在优选的方面中，在5 '端用生物素标记所使用的引物中的至少一个。此 夕h可W备选地通过将携带标记的修饰的核巧酸(例如，生物素化的或洋地黄毒巧加 ΤΡ衍生 物)加入至PCR混合物来实现扩增的DNA的标记。在某些实施方案中，可W使用放射性标记， W及巧光团。
[0072] 可W使用技术人员已知的可W使得能够检测任何扩增产物及其相应探针之间相 互作用的备选方法，包括隐含（imp ly)探针的标记的方法。
[0073] 可W将变性的扩增产物与固定在微阵列中的探针溫育，所述变性的扩增产物是其 本身，或与本领域技术人员已知的包含盐和洗涂剂的杂交溶液混合W促进DNA分子之间的 相互作用。
[0074] 归因于样品DNA的标记，每当样品分子与微阵列的表面上的探针分子相互作用时， 报告试剂结合于标记并且产生可W通过检测装置检测的可见信号。通过微阵列的表面上的 信号的位置来确定相互作用的探针和样品分子。在其中用生物素标记样品扩增产物的具体 情况中，报告试剂可W是共价连接至链霉亲和素的辣根过氧化物酶。后者与生物素特异性 地结合，并且过氧化物酶引起底物如四甲基联苯胺(TMB)或邻联茵香胺的沉淀。
[0075] 任何现有技术水平中已知的其他检测方法，如巧光，可W用于检测扩增产物和相 应探针之间的相互作用。
[0076] 可W等同地使用任何引起在阵列元件上沉淀并且可W用于检测祀标和探针分子 之间相互作用的其他反应。
[0077] 在优选的实施方案中，祀标分子及其相应特异性或对照探针之间的相互作用的可 视化由w下步骤组成：
[0078] -首先，使用光学器件捕获阵列的图像；
[0079] -之后，分析图像；
[0080] -最后，提供含有结果的说明的报告。
[0081] 优选地，用适当的软件分析图像。可W使用任何适用于运种处理的装置。
[0082] 在优选的实施方案中，可W在本发明中处理的试验样品的类型是鼻咽渗出物、鼻 咽洗出液、疲、支气管-肺泡吸出物、和支气管-肺泡洗出液。运些将会是用于呼吸道感染的 诊断的最适合的样品。根据本发明的方法和试剂盒处理的另外的样品是血液和血液培养物 样品，在患有脈毒症的患者的情况下它们是最适合的。还可W使任何来自个体的其他体液、 或组织进行本发明的方法和试剂盒。个体是人。
[0083] 试验样品可W等同地为从原始样品中提取的遗传物质。可W通过现有技术水平的 自动提取技术W及手动提取技术二者进行遗传物质的提取。
[0084] 在最优选的实施方案中，自动提取系统是BioMerieux的NucliSENS easyMAG 化P1694813)，其与用于来自宽范围的样品体积和类型的总核酸的通用分离的BioMerieux 的BOOM饭技术组合使用磁性粒子。可W等同地使用其他自动提取技术。
[0085] 技术人员还将清楚用于手动处理样品W提取核酸的技术和方法;并且可W使用任 何运种适合的方法。
[0086] 在具体实例中，从待测试的样品中提取核酸。优选地，最初体积在20化1至1ml的范 围内。在提取步骤之后，将沉淀物在25μ1至80μ1体积的无 RNA酶水中重悬。在具体的实施方 案中，将包含从试验样品中提取的遗传物质的25至80μ1中的化1添加至含有扩增反应物的 容器中，最终体积为50μ1。
[0087] 在本说明书中提及的全部文献通过引用其整体结合在本文中。
[0088] 除非另外指出，本文中使用的"和/或"应理解为具体公开了多个指定特征或组分 中的每一个，并且在每个组合中具有或不具有其他特征或组分。例如，"Α、Β和/或C"应理解 为具体公开了。)4、（^)8、（^。(：、。乂^和8，（乂)8和(：或者(乂。4和8和(：中的每一个，如同 每个在本文中单独地给出。
[0089] 如在本文中和在所附权利要求中使用的，单数形式"一个(a)"、"一个(an)"、和"所 述(the)"包括复数的所指对象，除非上下文另外指出。
[0090] 除非上下文另外指出，W上给出的特征的描述和定义不限于本发明的任何具体方 面或实施方案并且等同地应用于所描述的全部方面和实施方案。
[0091] W下提供的实施例仅是说明本发明并且不W任何方式限制所附权利要求的范围。 实施例
[0092] 实施例1:
[0093] 得到对肺炎链球菌阳性的血液培养物的样品，并且借助BioMerieux的NucliSENS easyMAG试剂盒从其中提取DNA。所使用的血液抬养物的最初体积为1ml，而洗脱之后的最终 体积为80μ1。
[0094] 接下来，选取化1的洗脱体积并且用W下试剂的混合物对其进行扩增：
[0097] 通过在95°C溫育10分钟使扩增产物变性。之后，在标准杂交溶液的存在下，将扣1 的变性PCR产物与固定在已知位置处的包含SEQ ID巧和SEQ IDN92的探针的微阵列溫育。
[0098] 在一系列标准洗涂和封闭步骤之后，拍摄图像，得到图1中示出的最终结果的可视 化。
[0099] 实施例2
[0100] 得到对轻型链球菌阳性的血液培养物的样品，并且针对肺炎链球菌进行实施例1 中描述的相同步骤。在图2中显示了最终结果的可视化。
[0101] 实施例3
[0102] 得到对口腔链球菌阳性的血液培养物的样品，并且针对肺炎链球菌进行实施例1 中描述的相同步骤。
[0103] 在图3中显示了最终结果的可视化。
[0104] 实施例4:
[0105] 得到对停乳链球菌阳性的血液培养物的样品，并且对其进行针对肺炎链球菌的实 施例1中描述的相同步骤。在图4中显示了最终结果的可视化。
【主权项】
1. 一种用于检测试验样品中肺炎链球菌（Streptococcus pnumoniae)的方法，所述方 法包括使所述样品与SEQ丨D NH和SEQ丨D N2的探针接触。2. 权利要求1所述的方法，其中在与所述探针接触前，对所述样品进行PCR扩增。3. 权利要求2所述的方法，其中使用两条分别包含SEQ ID Ns6和SEQ1DN3的核 酸序列作为PCR扩增引物。4. 权利要求1至3所述的方法，其中在与SEQID:N21和SEQIDNs2^所述探针接触 之前，由所述样品或由任何由其得到的PCR扩增产物得到单链寡或多核苷酸。5. 权利要求4所述的方法，其中通过使所述样品中或由其得到的所述扩增产物中存在 的任何双链寡或多核苷酸变性得到单链寡或多核苷酸。6. 权利要求1至5所述的方法，其中SEQ ID N4和SEQ .丨D N2的所述探针设置在微 阵列中。7. 权利要求1至6所述的方法，其中SEQ: ID NS1和SEQ ID N22的所述探针包含在单 个阵列容器中，或者包含在一组阵列容器中。8. -种用于检测试验样品中肺炎链球菌的试剂盒，其中所述试剂盒包含一个阵列容器 或一组阵列容器，其各自包含其中设置SEQ丨D N4和SEQ ID 的探针的微阵列。9. 权利要求8所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含： i)用于使核酸与所述微阵列的所述探针的杂交可视化的试剂，和 i i)具有PCR扩增引物的扩增混合物。10. 权利要求9所述的试剂盒，其中所述扩增混合物包含两条分别包含SEQ 1D 1^%和 SEQ ID N27的核酸序列作为PCR扩增引物。11. 探针组，所述探针组包括SEQ ID 和SEQ丨D ^^2的探针。12. -种分离的核酸序列，所述分离核酸序列由SEQ ID N21定义。13. -种分离的核酸序列，所述分离核酸序列由SEQ ID Ny2定义。14. 一种微阵列，所述微阵列包含权利要求11、12或13中定义的所述探针组。15. 权利要求1至7的所述的方法、权利要求8至10所述的试剂盒、权利要求11所述的探 针组、权利要求12或13所述的分离的核酸或权利要求14所述的微阵列用于检测肺炎链球菌 的用途。16. 权利要求1至7的所述的方法、权利要求8至10所述的试剂盒、权利要求11所述的探 针组、权利要求12或13所述的分离的核酸或权利要求14所述的微阵列用于诊断患者中由肺 炎链球菌导致的感染的用途。17. 权利要求16所述的用途，其中所述感染是脓毒性感染或呼吸道感染。18. -种用于诊断患者中由肺炎链球菌导致的感染的方法，所述方法包括使来自所述 患者的样品与由SEQ丨D Nyl fllSEQ丨D Ny2定义的探针接触。
【专利摘要】本发明基于样品中肺炎链球菌的检测方法，其允许特异性地区分肺炎链球菌与链球菌属的其他种。此外，本发明涉及(i)试剂盒，其包含在其中设置本发明的探针的微阵列；(ii)探针组本身；(iii)微阵列，其包含探针组；和(iv)以上方法、试剂盒、探针组、和微阵列用于检测样品中肺炎链球菌的用途。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105683395
【申请号】
【发明人】安娜·伊莎贝尔·莫拉加金塔尼利亚, 玛丽亚·路易莎·比利亚埃尔莫萨贾因
【申请人】基诺米加公司
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2014年10月16日