用于肺癌EGFR基因Sanger测序前样品质控的分子指标、试剂盒及方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于肺癌EGFR基因Sanger测序前样品质控的分子指标、试剂盒及方法。本发明所述Sanger测序前样品质控的分子指标含有以下基因：β?actin，PRPH，GABARAPL2，ACTG1，NDUFA7，UQCRC1，MYC和MIF；本发明的试剂盒含有上述基因的引物对。本发明以β?actin、PRPH、GABARAPL2、ACTG1、NDUFA7、UQCRC1、MYC和MIF 8种基因作为肺癌组织Sanger测序前样本质控的分子指标，可提高EGFR基因Sanger测序成功率和检测效率，降低不必要的时间、人力以及资金。
【专利说明】
用于肺癌EGFR基因 Sanger测序前样品质控的分子指标、试剂 盒及方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种样品质控的分子指标、试剂盒及方法，具体设及一种用于肺癌 EGFR基因 Sanger测序前样品质控的分子指标、试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 肺癌已成为当前世界各国常见的恶性肿瘤，国内外公认肺癌的"两个第一"，即"发 病率第一"、"死亡率第一"。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高， 男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第 二位，成为对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤。普通CT扫描筛查能有效地降低约20% 的肺癌死亡率，但其进展却远不及其他常见的恶性肿瘤，如乳腺癌、前列腺癌和结肠癌。部 分原因是因为肺癌患者通常表现为晚期疾病，不再可行治愈性手术，因此早期诊断对于改 善疾病的转归至关重要。
[0003] 精准化医疗已逐渐成为现代医疗的共识，目前肺癌的治疗仍W手术治疗、放射治 疗和药物治疗为主。个体精准化治疗是基于肺癌患者的驱动基因表达状态，即根据肺癌患 者是否存在驱动基因的个体化治疗。其中，上皮生长因子受体化GFR)突变是重要的癌症驱 动因子，我国肺癌患者EGFR突变率达30 % W上，不吸烟女性腺癌患者中比较多见，约有50 % 左右的突变率。EGFR广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细 胞表面，是上皮生长因子EGF参与细胞增殖和信号传导的受体。EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能 缺失或其相关信号通路中关键因子的活性或细胞定位异常，与肿瘤细胞的增殖、血管生成、 肿瘤侵袭、转移及细胞调亡的抑制有关。目前临床上使用较多和广泛的特罗凯和易瑞沙就 是W上通路的可逆性生物抑制剂。大量临床研究显示检测EGFR突变可W筛查对祀向药敏感 的人群，从而实现对患者的祀向个体化治疗。
[0004] 目前EGFR突变的检测步骤包括标本获得、DNA抽提、EGFR突变检测和结果分析。检 巧化勺方法包括:DNA测序、ARMS及其它如DHPLC等。DNA直接测序法应用广泛，可检测已知的突 变和未知的突变，但对标本的肿瘤细胞含量要求较高，一般要求标本中肿瘤细胞的比例在 50 % W上，至少不低于30 %。基于实时巧光定量PCR基础上的方法(如ARMS法)较直接测序法 更加敏感，可检测样品中1.0%~0.1%的突变基因，更适合用于肿瘤细胞含量较少的小标 本检测。我方采用的是基于毛细管的单基因测序的第一代技术Sanger测序法检测EGFR突 变。Sanger法核屯、原则是：由于ddNTP的2'和3'都不含径基，其在DNA的合成过程中不能形成 憐酸二醋键，因此可W用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例 带有放射性同位素标记的ddNTP (分为:ddATP，ddCTP，ddGTP和ddTTP)，通过凝胶电泳和放射 自显影后可W根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。Sanger测序法测序读长长，能达 到800-化bp，且只需要几十分钟即可完成一次测序，准确度高，目前仍是测序的金标准。
[0005] 进行Sanger测序前还需要对肺癌样本进行质量的检查，目的是为了提高检测质 量，同时降低不必要的成本，避免时间和人力的浪费。目前对肺癌组织样本的质控主要是较 宏观的方面，如样本的固定时间、皿染色观察肿瘤区域的大小W及测定提取的DNA浓度。有 的肺癌样本上述方面都没有出入，但是进行EGFR Sanger测序还是反应样本组织不合格，所 W寻找新的样本质控指标成为Sanger测序前的重要准备部分。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种用于肺癌EGFR基因 Sanger测序前样品质控的分子指标和试剂盒，采用该分子指标或试剂盒对样品进行质控， 能提高EGFR基因 Sanger测序的成功率。
[0007] 同时，本发明还提供了一种用于肺癌EGFR基因 Sanger测序前样品质控的方法。
[000引为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于肺癌EGFR基因 Sanger测序 前样品质控的分子指标，其含有W下基因 ：e-act in，PRPH，GABARA化2，ACTGl，NDUFA7， UQCRCl，MTC和MIF。
[0009] 本申请发明人随机挑选出肺癌组织石蜡切片W及正常肺组织石蜡切片，进行肺癌 EGFR基因 Sanger测序，将成功测序的样本与测序失败的样本进行基因组分析，统计数据用 COX风险回归分析得到了肺癌组织样本中各个DNA与EGFR基因 Sanger测序成功的关系，找出 与EGFR基因 Sanger测序成功有明显相关的基因，并进行具体实验验证。经过长期大量的检 测实验后，发明人筛选出 e-ac t in、PRPH、GABARA化 2、ACTG1、NDUFA7、UQCRC1、MYC 和MIF8 种基 因作为肺癌组织Sanger测序前样本质控的分子指标。W所述8种基因作为样本质控的分子 指标，可提高EGFR基因 Sanger测序成功率和检测效率，降低不必要的时间、人力W及资金。
[0010] 另外，本发明还提供了一种用于肺癌EGFR基因 Sanger测序前样品质控的试剂盒， 其含有下述基因的引物对:e-act in，PRPH，GABARA化2，ACTG1，NDUFA7，UQCRCl，MYC和MIF。
[0011] 作为本发明所述用于肺癌EGFR基因 Sanger测序前样品质控的试剂盒的优选实施 方式，所述0-日。1:;[]1的正义引物如56〇1〇^:1所示，0-日(31:;[]1的反义引物如56〇1〇^:2所 示;所述PRPH的正义引物如SEQ ID N0:3所示，PRPH的反义引物如SEQ ID N0:4所示;所述 GABARA化2的正义引物如沈Q ID N0:5所示，GABARAPL2的反义引物如沈Q ID N0:6所示；所 述ACTGl的正义引物如SEQ ID NO: 7所示，ACTGl的反义引物如SEQ ID NO: 8所示；所述 NDUFA7的正义引物如SEQIDN0:9所示，NDUFA7的反义引物如SEQIDN0:10所示；所述 UQCRCl的正义引物如SEQ ID NO: 11所示，UQCRCl的反义引物如沈Q ID NO: 12所示;所述MYC 的正义引物如SEQ ID NO: 13所示，MYC的反义引物如SEQ ID NO: 14所示;所述MIF的正义引 物如SEQ ID NO: 15所示，MIF的反义引物如SEQ ID NO: 16所示。本发明所选择的8对引物具 有W下优点：1)退火溫度等反应条件基本相同；2)扩增产物长度不一，在电泳凝胶中容易区 分开;3)引物之间不容易形成引物二聚体;4)在DNA质量不同样本之间，条带有明显差异。
[0012] 作为本发明所述用于肺癌EGFR基因 Sanger测序前样品质控的试剂盒的优选实施 方式，所述试剂盒还含有:PCR缓冲溶液、dNTP、CDNA、BSA和DNA聚合酶。反应体系中加入BSA， 可抑制引物形成二聚物。
[0013] 作为本发明所述用于肺癌EGFR基因 Sanger测序前样品质控的试剂盒的优选实施 方式，所述试剂盒还含有超纯水。
[0014] 作为本发明所述用于肺癌EGFR基因 Sanger测序前样品质控的试剂盒的优选实施 方式，所述试剂盒含有aOXPCR缓冲溶液、lOmmol/L dNTP、50ngW上cDNA、0.祉g/化BSA和 rTaq酶。作为本发明所述用于肺癌EGFR基因 Sanger测序前样品质控的试剂盒的更优选实施 方式，所述试剂盒中，PCR缓冲溶液、dNTP、基因的引物对、CDNA、BSA、r化q酶、超纯水的体积 比为：3:〇.8:3:1:2.5:〇.4:19.3。其中，基因的引物对指的是0-曰。^11，口1?口山64841?4化2， ACTGl ,NDUFA7 ,UQCRCl ,MTC和MIF的引物对。
[0015] 作为本发明所述用于肺癌EGFR基因 Sanger测序前样品质控的试剂盒的优选实施 方式，所述试剂盒还含有固定液、染色液和DNA提取试剂。作为本发明所述用于肺癌EGFR基 因 Sanger测序前样品质控的试剂盒的更优选实施方式，所述固定液为中性福尔马林，所述 染色液为苏木精和伊红。
[0016] 最后，本发明还提供了一种用于肺癌EGFR基因 Sanger测序前样品质控的方法，其 包括W下步骤：
[0017] (1)固定肺癌组织样本；
[0018] (2)染色鉴定肺癌组织样本的肿瘤区域；
[0019] (3)提取肺癌组织样本的DNA;
[0020] (4)挑选出固定时间为12-24h、肿瘤区域为IOOW上个肿瘤细胞、提取DNA浓度为 1 .5-2. Ong/化的肺癌组织样本；W挑选出的样本的DNA为模板，We-act in、PRPH、 GABARAPL2、ACTG1、NDUFA7、UQCRC1、MYC和MIF的引物对为引物进行PCR扩增，再进行电泳，选 择出含有 e-act in、PRPH、GABARA化2、ACTG1、NDUFA7、UQCRCl、MYC和MIF 中 5个 W 上基因条带 的样本。
[002。本发明的有益效果为：本发明 We-actin、PRPH、GABARAPL2、ACTGl、NDUFA7、 UQCRCl、MYC和MIF 8种基因作为肺癌组织Sanger测序前样本质控的分子指标，可提高EGFR 基因 Sanger测序成功率和检测效率，降低不必要的时间、人力W及资金。
【附图说明】
[0022] 图1为采用本发明方法进行样本质控所得到的合格肺癌组织样本的电泳图；其中， M表示DNA marker, 1-12表示样本 1-12;
[0023] 图2为采用本发明方法进行样本质控所得到的合格肺癌组织样本的Sanger测序 图；
[0024] 图3为本发明实施例3所述阳性对照样本EGFR测序结果。
【具体实施方式】
[0025] 为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对 本发明作进一步说明。
[0026] 在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术 人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学和分子生物学相关术语 和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本 发明，下面提供相关术语的定义和解释。
[0027] EGFR:化pidermal Growth Factor Receptor)是上皮生长因子化GF)细胞增殖和 信号传导的受体。EGFR属于化bB受体家族的一种，该家族包括EGFR化rbB-1)，皿R2/c-neu 化rbB-2) ,Her 3化rbB-3)和Her 4巧rbB-4)eEGFR也被称作肥RUErbBl,突变或过表达一般 会引发肿瘤。EGFR是一种糖蛋白，属于酪氨酸激酶型受体，细胞膜贯通，分子量170KDanEGFR 位于细胞膜表面，靠与配体结合来激活，包括EGF和TG阳（transforming growth factora)。 [00%] Sanger测序:是根据核巧酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终 止，并且在每个碱基后面进行巧光标记，产生WA、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核巧 酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。
[0029] BSA:牛血清白蛋白。
[0030] 实施例1:分子指标
[0031] 本发明实施例的一种用于肺癌EGFR基因 Sanger测序前样品质控的分子指标，其为 W 下基因：e-act in，PRPH，GABARA化2，ACTGl，NDUFA7，UQCRCl，MYC和MIF。
[0032] 实施例2:试剂盒
[0033] 本发明实施例的一种用于肺癌EGFR基因 Sanger测序前样品质控的试剂盒，所述试 剂盒含有下述基因的引物对:e-act in、PRPH、GABARA化2、ACTG1、NDUFA7、UQCRC1、MYC和MIF; 该试剂盒还含有10 X PCR缓冲溶液、1 Ommo 1 /L dNTP、50ng W上cDNA、0.祉g/化BSA、Thq酶 和超纯水;PCR缓冲溶液、dNTP、基因的引物对、cDNA、BSA、rTaq酶、超纯水的体积比为：3 : 0.8:3:1:2.5:0.4:19.3〇
[0034] 其中，所述0-actin的正义引物如SEQ ID NO: 1所示，0-actin的反义引物如SEQ ID NO: 2所示;所述PRPH的正义引物如SEQ ID NO: 3所示，PRPH的反义引物如SEQ ID NO:4所示； 所述GABARAPL2的正义引物如沈Q ID N0:5所示，GABARAPL2的反义引物如SEQ ID N0:6所 示;所述ACTGl的正义引物如SEQ ID NO:7所示，ACTGl的反义引物如SEQ ID NO:8所示;所述 NDUFA7的正义引物如SEQIDN0:9所示，NDUFA7的反义引物如SEQIDN0:10所示；所述 UQCRCl的正义引物如SEQ ID NO: 11所示，UQCRCl的反义引物如沈Q ID NO: 12所示;所述MYC 的正义引物如SEQ ID NO: 13所示，MYC的反义引物如SEQ ID NO: 14所示;所述MIF的正义引 物如SEQ ID NO: 15所示，MIF的反义引物如SEQ ID NO: 16所示。
[0035] 上述基因的引物序列如表1所示。
[0036] 表1
[0037]
^pnool
[0039] 进一步，所述试剂盒还含有固定液、染色液和DNA提取试剂;所述固定液为中性福 尔马林，所述染色液为苏木精和伊红。
[0040] 实施例3:肺癌EGFR基因 Sanger测序前样品质控的方法
[0041] 本发明实施例的一种用于肺癌EGFR基因 Sanger测序前样品质控的方法，其包括W 下步骤：
[0042] (1)采用10%中性福尔马林固定肺癌组织样本，皿染色鉴定肺癌组织样本的肿瘤 区域，并采用QIAgen_FFPE_DNA_kit提取肺癌组织样本的DNA;
[0043] (2)挑选出固定时间为12-24h、肿瘤区域为100 W上个肿瘤细胞、提取DNA浓度为 1 .5-2. Ong/化的肺癌组织样本；W挑选出的样本的DNA为模板，We-act in、PRPH、 GABARAPL2、ACTGl、NDUFA7、UQCRCl、MYC和MIF的引物对为引物进行PCR扩增，PCR反应体系如 实施例2所述的试剂盒，具体见表2; PCR反应条件见表3;
[0044] (3)将步骤(2)得到的PCR产物进行电泳，电泳的条件为：琼脂糖浓度：2%;电压： 120V;电泳的时间：6Omin ;上样量1 Ou 1;在电泳图中检测到e-ac t in，PRPH，GABARAPL2， ACTGl，NDUFA7，UQCRCl，MYC，MIF中的5个W上基因条带即为合格肺癌组织样本;合格肺癌组 织样本的电泳图如图1所示。
[0045] 表 2
[0046]
[0047]
[004引 表2中，Primer Mix表示(6-actin、PRPH、GABARAPL2、ACTGl、NDUFA7、UQCRCl、Mre和 MIF的引物对，WGA product即为cDNA。
[0049]表 3 [(K)加 ]
[0051] 将得到的合格肺癌组织样本进行Sanger测序（Sanger测序的流程为：提取总DNA， PCR扩增，DNA凝胶电泳，胶回收，测序反应，纯化，毛细管电泳，数据分析）并计算成功率。 Sanger测序结果如图2所示。结果表明，实验检测的120个合格肺癌组织样本，测序成功率达 到100 %。
[0052] 此外，我们还对此次实验进行了阳性对照验证，W确保此次试验的准确性。阳性对 照样本EGFR测序结果如图3所示。
[0化3] 对比例1
[0054] 本对比例对两组对照组样本进行Sanger测序（Sanger测序的步骤与条件均同实施 例3)并计算测序的成功率。其中，第一组对照组为:不做任何筛选的肺癌组织样本;第二组 对照组为:按照实施例3步骤(1)所述方法，固定肺癌组织样本，皿染色鉴定肺癌组织样本的 肿瘤区域，并提取肺癌组织样本的DNA，挑选出固定时间适当、肿瘤区域大小合适、提取DNA 浓度适宜的肺癌组织样本。
[0055] 研究表明，W所述两组对照组作为样本进行Sanger测序，测序成功率均为70% W 下。
[0化6]比较本对比例所述两组对照组样本与实施例3所得合格肺癌组织样本Sanger测序 的成功率，通过数据分析挑选出的分子标签与测序成功率的关系。
[0057]最后所应当说明的是，W上实施例仅用W说明本发明的技术方案而非对本发明保 护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当 理解，可W对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质 和范围。
【主权项】
1. 一种用于肺癌EGFR基因 Sanger测序前样品质控的分子指标，其特征在于:所述分子 指标含有以下基因：β-ac t in，PRPH，GABARAPL2，ACTG1，NDUFA7，UQCRC1，MYC 和 MIF。2. -种用于肺癌EGFR基因 Sanger测序前样品质控的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒 含有下述基因的引物对:β-ac t in，PRPH，GABARAPL2，ACTG1，NDUFA7，UQCRC1，MYC 和 MIF。3. 如权利要求2所述的用于肺癌EGFR基因 Sanger测序前样品质控的试剂盒，其特征在 于:所述β-actin的正义引物如SEQIDN0 :l所示，β-actin的反义引物如SEQIDN0:2所示； 所述PRPH的正义引物如SEQ ID N0:3所示，PRPH的反义引物如SEQ ID N0:4所示；所述 GABARAPL2的正义引物如SEQIDN0:5所示，GABARAPL2的反义引物如SEQIDN0:6所示；所 述ACTG1的正义引物如SEQIDN0 :7所示，ACTG1的反义引物如SEQIDN0:8所示；所述 NDUFA7的正义引物如SEQIDN0:9所示，NDUFA7的反义引物如SEQIDN0:10所示 ；所述 UQCRC1的正义引物如SEQIDN0:11所示，UQCRC1的反义引物如SEQIDN0:12所示 ；所述MYC 的正义引物如SEQ ID NO: 13所示，MYC的反义引物如SEQ ID NO: 14所示;所述MIF的正义引 物如SEQIDN0:15所示，MIF的反义引物如SEQIDN0:16所示。4. 如权利要求2或3所述的用于肺癌EGFR基因 Sanger测序前样品质控的试剂盒，其特征 在于:所述试剂盒还含有:PCR缓冲溶液、dNTP、cDNA、BSA和DNA聚合酶。5. 如权利要求4所述的用于肺癌EGFR基因 Sanger测序前样品质控的试剂盒，其特征在 于:所述试剂盒还含有超纯水。6. 如权利要求4或5所述的用于肺癌EGFR基因 Sanger测序前样品质控的试剂盒，其特征 在于:所述试剂盒含有：10 XPCR缓冲溶液、10mmol/L dNTP、50ng以上cDNA、0·8yg/yL BSA和 rTaq 酶。7. 如权利要求6所述的用于肺癌EGFR基因 Sanger测序前样品质控的试剂盒，其特征在 于:所述试剂盒中，PCR缓冲溶液、dNTP、基因的引物对、cDNA、BSA、rTaq酶、超纯水的体积比 为:3:0·8:3:1:2·5:0·4:19·3〇8. 如权利要求2~7任一项所述的用于肺癌EGFR基因 Sanger测序前样品质控的试剂盒， 其特征在于:所述试剂盒还含有固定液、染色液和DNA提取试剂。9. 如权利要求8所述的用于肺癌EGFR基因 Sanger测序前样品质控的试剂盒，其特征在 于:所述固定液为中性福尔马林，所述染色液为苏木精和伊红。10. -种用于肺癌EGFR基因 Sanger测序前样品质控的方法，其特征在于：包括以下步 骤： (1) 固定肺癌组织样本； (2) 染色鉴定肺癌组织样本的肿瘤区域； (3) 提取肺癌组织样本的DNA; (4) 挑选出固定时间为12-24h、肿瘤区域为100以上个肿瘤细胞、提取DNA浓度为1.5-2 . Ong/yL的肺癌组织样本；以挑选出的样本的DNA为模板，以0-actin、PRPH、GABARAPL2、 ACTG1、NDUFA7、UQCRC1、MYC和MIF的引物对为引物进行PCR扩增，再进行电泳，选择出含有0_ ac t in、PRPH、GABARAPL2、ACTG1、NDUFA7、UQCRC1、MYC 和 MIF 中 5 个以上基因条带的样本。
【文档编号】C12N15/11GK105861681SQ201610290312
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月3日
【发明人】柯尊富, 王连唐, 杨冬成
【申请人】中山大学附属第医院, 中山大学附属第一医院