一种乌司他丁治疗三阴性乳腺癌的模型构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种乌司他丁治疗三阴性乳腺癌的模型构建方法，该模型构建方法包括：构建CCL22过表达和敲低的TNBC细胞模型；用CCL22过表达及敲低的4T1细胞构建小鼠荷瘤模型；采用4T1细胞构建小鼠移植瘤模型，本发明同时公开一种检测乌司他丁治疗三阴性乳腺癌的影响与机制的方法，检测乌司他丁对TNBC细胞分泌的趋化因子CCL22量的抑制；检测CCL22对肿瘤细胞周围treg细胞的招募，检测treg细胞表面GITR的表达。本发明针对乌司他丁在乳腺癌中的治疗价值的研究在国内外均属首例，针对该药物影响肿瘤微环境机制的研究将为该药物应用于乳腺癌治疗特别是三阴性乳腺癌治疗的临床使用提供应用基础研究。
【专利说明】
-种乌司他τ治疗Ξ阴性乳腺癌的模型构建方法
技术领域
[0001] 本发明属于乳腺癌治疗领域，尤其设及一种乌司他下治疗Ξ阴性乳腺癌的模型构 建方法。
【背景技术】
[0002] 发明人通过前期研究工作发现：
[0003] 1)乌司他下抑制乳腺癌细胞增殖、促使细胞调亡，其机制可能与乌司他下降低免 疫/炎症因子TNF-a、比-6和IL-10的表达和调节免疫微环境有关。
[0004] 2)乌司他下和泰索帝均可显著抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭、转移，乌司他下 可增强泰索帝的抑制作用，机制可能与下调TGF-β的表达，抑制血管形成，上皮间皮转化有 关，同时，也与乌司他下下调乳腺癌细胞CXCR4的表达水平相关。
[0005] 3)乌司他下联合泰索帝抑制乳腺癌增殖及转移，可能与调节乳腺癌微环境中CD4+ CD25+Foxp3巧/CD4 巧相关。
[0006] 研究表明，乌司他下具有抑制乳腺癌包括Ξ阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC)增殖转移的作用，其中对肿瘤免疫微环境中化eg的影响可能起着关 键作用。
[0007] Treg促进肿瘤发生免疫逃逸是通过肿瘤细胞产生的大量趋化因子CCL22招募高表 达趋化因子受体CCR4的Treg到肿瘤周围，一方面使肿瘤组织处于免疫抑制环境中，从而促 进肿瘤细胞的增殖；另一方面，Treg大量聚集在肿瘤组织周围，形成富含Treg的细胞层，可 有效阻碍自然杀伤性细胞(natural killer cell，NK)和Tc等淋己细胞对肿瘤细胞的攻击。 而肿瘤分泌趋化因子(XL22过程中存在着TGF-e-microRNA-34a-(XL22轴，活化的TGF-β可抑 审lJmicroRNA-34a基因的表达，从而使趋化因子CCL22产生增加，说明转化生长因子TGF-β与 趋化因子C化22呈正相关，因此可W假设乌司他下通过TGF-曲iicroRNA-34a-C化22轴影响肿 瘤细胞产生的CCL22数量。而前期的研究W及文献均提示乌司他下可降低肿瘤细胞及淋己 细胞分泌的TGF-β。因此前期工作中发现乌司他下降低肿瘤组织周围及瘤内的Treg,可能是 通过作用于TGF-f3microRNA-34a-(XL22轴，降低肿瘤细胞分泌(XL22的数量，从而减少肿瘤 组织周围化eg的聚集，减少肿瘤发生免疫逃逸，抑制肿瘤增殖、侵袭及远处转移。另有研究 显示，Treg表面抑制性免疫受体糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(旨111(3〇(3〇的;[(301(1- induced1:umor necrosis factorreceptor，GITR)，可与DC表面的GITR配体结合，促进Treg 的增殖，并抑制DC表面GITR配体的数量，使其与其他效应性T细胞的结合力下降，抑制效应 性T细胞的功能。由此可见，肿瘤细胞分泌的(XL22和Treg表面的GITR，是调节乳腺癌免疫微 环境的潜在祀点。
[000引目前，关于乌司他下可能是通过抑制肿瘤细胞分泌(XL22,并降低化eg表面GITR的 表达，抑制Ξ阴性乳腺癌微环境中调节性T细胞的数量与功能，控制肿瘤生长及转移的资料 尚未报道。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于提供乌司他下治疗Ξ阴性乳腺癌的模型构建方法，旨在研究关 于乌司他下可能是通过抑制肿瘤细胞分泌CCL22,并降低Treg表面GITR的表达，抑制Ξ阴性 乳腺癌微环境中调节性T细胞的数量与功能，控制肿瘤生长及转移，为Ξ阴性乳腺癌的有效 治疗提供新方向的问题。
[0010]本发明是运样实现的，
[0011] 一种乌司他下治疗Ξ阴性乳腺癌的模型构建方法，所述的乌司他下治疗Ξ阴性乳 腺癌的模型构建方法包括：
[001。构建CCL22过表达和敲低的TNBC细胞模型；
[0013] 用CCL22过表达及敲低的4T1细胞构建小鼠荷瘤模型；
[0014] 采用4T1细胞构建小鼠移植瘤模型。
[0015] 本发明另一目的在于提供一种检测乌司他下治疗Ξ阴性乳腺癌的影响与机制的 方法，所述检测乌司他下治疗Ξ阴性乳腺癌的影响与机制的方法包括W下步骤：
[0016] 步骤一、通过构建CCL22过表达和敲低的TNBC细胞模型，采用定量PCR与Western b 101检测乌司他下对TNBC细胞分泌的趋化因子CCL22量的抑制；
[0017] 步骤二、通过用CCL22过表达及敲低的4T1细胞构建小鼠荷瘤模型，采用流式细胞 术与Western blot方法检测CCL22对肿瘤细胞周围treg细胞的招募，验证CCL22对肿瘤免疫 微环境的影响；
[0018] 步骤Ξ、通过采用4T1细胞构建小鼠移植瘤模型，应用Western blot方法检测treg 细胞表面GITR的表达，验证乌司他下通过Treg细胞功能的改变对肿瘤细胞生物学行为的影 响。
[0019] 进一步，所述检测乌司他下对TNBC细胞分泌的趋化因子CCL22量的抑制，采用的方 法为：
[0020] 通过TNBC细胞模型检测验证乌司他下对TNBC细胞中分泌的趋化因子CCL22的量的 改变；
[0021 ] 应用乌司他下处理TNBC细胞，提取细胞RNA，确认RNA质量；
[0022] 通过实时巧光定量PCR检测CCL22在mRNA水平的表达改变；
[0023] 应用乌司他下处理TNBC细胞，提取细胞总蛋白，确认蛋白质量；
[0024] 通过Western blot检测相应细胞中的蛋白表达情况，通过比较明确乌司他下对 (XL22在蛋白水平的表达影响；
[0025] 应用乌司他下处理TNBC细胞，收集培养基中蛋白质，确认蛋白质质量；
[00%] 通过化ISA检测培养基中CCL22的水平，验证乌司他下对TNBC细胞中分泌的CCL22 的量的改变。
[0027]进一步，所述检测CCL22对肿瘤细胞周围化eg细胞的招募，验证CCL22对肿瘤免疫 微环境的影响的方法为：
[002引构建CCL22过表达和敲低的TNBC细胞模型，
[0029] 用CCL22过表达及敲低的4T1细胞构建小鼠荷瘤模型，
[0030] 取肿瘤组织，流式细胞术检测肿瘤组织及肿瘤周围淋己结中化eg的量，验证检测 (XL22对化eg的招募作用；检测肿瘤体积大小，肿瘤组织中化eg表达的免疫因子比-10、TGF- 0的表达差异，W及肿瘤远处转移情况，通过分析检测Treg的数量对肿瘤生长及转移的影 响。
[0031] 进一步，所述检测化eg细胞表面GITR的表达，验证乌司他下通过化eg细胞功能的 改变对肿瘤细胞生物学行为的影响的方法为：
[0032] 通过采用4T1细胞构建小鼠移植瘤模型，用乌司他下处理，比较肿瘤生长转移情 况，研究乌司他下对移植瘤的影响；
[0033] 取肿瘤组织，流式细胞术检测肿瘤组织及肿瘤周围淋己结中Treg的量，同时用 western blot法检测Treg细胞中GITR的表达；
[0034] 通过分析检测乌司他下对GITR的表达调节作用W及对化eg细胞招募的影响和肿 瘤生物学行为的影响。
[0035] 进一步，所述的分析采用SPSS. 19.0统计学软件处理数据，数据表示，采用 单因素方差分析进行多组间比较，组间两两比较采用LSD-t或Tamhane法，检验水准α = 0.05。
[0036] 本发明针对乌司他下在乳腺癌中的治疗价值的研究在国内外均属首例，针对该药 物影响肿瘤微环境机制的研究(如，最新有价值的发现:乌司他下联合化疗药物可降低乳腺 癌肿瘤微环境中CD4+CD25+FOXP3+/CD4巧细胞的比值)将为该药物应用于乳腺癌治疗特别 是Ξ阴性乳腺癌治疗的临床使用提供应用基础研究。
【附图说明】
[0037] 图1是本发明提供的检测乌司他下治疗Ξ阴性乳腺癌的影响与机制的方法流程 图。
【具体实施方式】
[0038] 为能进一步了解本发明的
【发明内容】
、特点及功效，兹例举W下实施例，并配合附图 详细说明如下。
[0039] 通过本发明：
[0040] 1)、乌司他下与环憐酷胺或泰索帝配伍，抑制乳腺癌细胞MCF-7/DA-MB-231增殖， 其机制可能与乌司他下降低免疫、炎症因子了^-曰、化-6和化-10的表达和调节免疫微环境 有关。
[0041] 2)、乌司他下和泰索帝均可显著抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭、转移，乌司他下 可增强泰索帝的抑制作用，机制可能与下调￥66。-(：、66。1?、41〇\了6。-0的表达，抑制血管形 成，上皮间皮转化有关，也与乌司他下下调乳腺癌细胞CXCR4的表达水平相关。
[0042] 3)、乌司他下和泰索帝均可显著抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭，机制可能与Ε服 受抑，uPA、uPAR、MMP-9表达下调有关。
[0043] 4)、乌司他下抑制乳腺癌细胞增殖、促使细胞调亡，可能与通过抑制JNk-2和NF-KB 通路减少IGF-1R、PDGFA生成有关。
[0044] 5)、乌司他下联合多西他赛抑制对乳腺癌生长及转移，与降低肿瘤微环境中CD4+ CD25+FOXP3+/CD4巧细胞的比值有关。
[0045] 下面结合附图对本发明详细描述。
[0046] 一种乌司他下治疗Ξ阴性乳腺癌的模型构建方法，所述的乌司他下治疗Ξ阴性乳 腺癌的模型构建方法包括：
[0047] 构建CCL22过表达和敲低的TNBC细胞模型；
[004引用CCL22过表达及敲低的4T1细胞构建小鼠荷瘤模型；
[0049] 采用4T1细胞构建小鼠移植瘤模型。
[0050] 如图1所示:一种检测乌司他下治疗Ξ阴性乳腺癌的影响与机制的方法，所述检测 乌司他下治疗Ξ阴性乳腺癌的影响与机制的方法包括W下步骤：
[0化1] S101:通过构建(XL22过表达和敲低的TNBC细胞模型，采用定量PCR与Western b 1 ot检测乌司他下对TNBC细胞分泌的趋化因子CCL22量的抑制；
[0052] S102:通过用CCL22过表达及敲低的4T1细胞构建小鼠荷瘤模型，采用流式细胞术 与Western blot方法检测(XL22对肿瘤细胞周围treg细胞的招募，验证(XL22对肿瘤免疫微 环境的影响；
[0化3] S103:通过采用4T1细胞构建小鼠移植瘤模型，应用Western blot方法检测treg细 胞表面GITR的表达，验证乌司他下通过化eg细胞功能的改变对肿瘤细胞生物学行为的影 响。
[0054] 所述检测乌司他下对TNBC细胞分泌的趋化因子CCL22量的抑制，采用的方法为:通 过构建CCL22过表达和敲低的TNBC细胞模型，
[0055] 应用乌司他下处理TNBC细胞，提取细胞RNA，确认RNA质量；
[0056] 通过实时巧光定量PCR检测CCL22在mRNA水平的表达改变；
[0057] 应用乌司他下处理TNBC细胞，提取细胞总蛋白，确认蛋白质量；
[005引通过Western blot检测相应细胞中的蛋白表达情况，通过比较明确乌司他下对 (XL22在蛋白水平的表达影响；
[0059] 应用乌司他下处理TNBC细胞，收集培养基中蛋白质，确认蛋白质质量；
[0060] 通过化ISA检测培养基中CCL22的水平，验证乌司他下对TNBC细胞中分泌的CCL22 的量的改变。
[0061] 所述检测CCL22对肿瘤细胞周围treg细胞的招募，验证CCL22对肿瘤免疫微环境的 影响的方法为：
[0062] 构建CCL22过表达和敲低的TNBC细胞模型，
[0063] 通过用CCL22过表达及敲低的4T1细胞构建小鼠荷瘤模型，取肿瘤组织，流式细胞 术检测肿瘤组织及肿瘤周围淋己结中化eg的量，验证检测CCL22对化eg的招募作用;检测肿 瘤体积大小，肿瘤组织中Treg表达的免疫因子IL-10、TGF-i3的表达差异，W及肿瘤远处转移 情况，通过分析检测Treg的数量对肿瘤生长及转移的影响。
[0064] 所述检测化eg细胞表面GITR的表达，验证乌司他下通过化eg细胞功能的改变对肿 瘤细胞生物学行为的影响的方法为：
[0065] 通过采用4T1细胞构建小鼠移植瘤模型，用乌司他下处理，比较肿瘤生长转移情 况，研究乌司他下对移植瘤的影响；
[0066] 取肿瘤组织，流式细胞术检测肿瘤组织及肿瘤周围淋己结中Treg的量，同时用 western blot法检测Treg细胞中GITR的表达；
[0067] 通过分析检测乌司他下对GITR的表达调节作用W及对化eg细胞招募的影响和肿 瘤生物学行为的影响。
[0068] 所述的分析采用SPSS. 19.0统计学软件处理数据，数据WY±S表示，采用单因素 方差分析进行多组间比较，组间两两比较采用LSD-t或Tamhane法，检验水准α = 0.05。
[0069] 本发明针对乌司他下在乳腺癌中的治疗价值的研究在国内外均属首例，针对该药 物影响肿瘤微环境机制的研究将为该药物应用于乳腺癌治疗特别是Ξ阴性乳腺癌治疗的 临床使用提供应用基础研究。
[0070] 结合实施例对本发明进一步说明。
[0071 ]验证乌司他下在TNBC细胞中对CCL22表达的影响与机制的具体方法包括：
[0072] 步骤一、应用空白对照及乌司他下(分低浓度400UI/ml、中浓度800UI/ml、高浓度 1600UI/ml)处理TNBC细胞(4Tl及MDA-MB-231)，于第12、24、36、48小时提取细胞RNA，检测 RNA浓度并确认RNA质量良好；
[0073] 步骤二、取上述RNA通过逆转录构建cDNA文库，通过实时巧光定量PCR检测CCL22在 mRNA水平的表达，比较乌司他下处理与空白对照组表达差异及不同浓度乌司他下分组间 (XL22表达的差异，明确乌司他下对CCL22mRNA表达的影响；
[0074] 步骤Ξ、应用空白对照及不同浓度的乌司他下处理TNBC细胞(4T1及MDA-MB-231)， 不同时间提取细胞总蛋白，应用BCA试剂盒检测蛋白浓度并确认蛋白质量良好；
[0075] 步骤四、取上述蛋白进行Western blot分析，通过CCL22抗体识别，检测CCL22在蛋 白水平的表达，比较乌司他下处理与空白对照组表达差异及不同浓度乌司他下分组间 (XL22表达的差异，明确乌司他下对CCL22蛋白表达的影响。
[0076] 步骤五、应用空白对照及乌司他下(分低浓度400UI/ml、中浓度800UI/ml、高浓度 1600UI/ml)处理TNBC细胞(4T1及MDA-MB-231)，于第24、48、72小时收集细胞培养基，富集培 养基中蛋白，应用BCA试剂盒检测蛋白浓度并确认蛋白质量良好；
[0077] 步骤六、取上述蛋白进行化ISA分析，通过CCL22抗体识别，检测(XL22的量，比较乌 司他下处理与空白对照组表达差异及不同浓度乌司他下分组间CCL22量的差异，明确乌司 他下对TNBC细胞外分泌CCL22蛋白量的影响。
[0078] 探讨CCL22通过免疫诱导对肿瘤生物学行为的影响，具体方法为：
[0079] 步骤一、构建CCL22过表达质粒和siRNA干扰质粒，通过病毒载体包装，感染TNBC细 胞(4T1细胞），通过筛选得到(XL22过表达及敲低的细胞株(4T1-(XL22和4T1-C化22-down细 胞），通过实时巧光定量PCR及Western blot在mRNA及蛋白水平验证过表达及干扰效果；
[0080] 步骤二、培养4T1细胞、4T1-(XL22和4Tl-CCL22-down细胞，收集细胞，行皮下注射 构建小鼠荷瘤模型，每组动物为8-10只；
[0081] 步骤Ξ、每3天观察，测量瘤体体积，绘制移植瘤生长曲线。至移植瘤直径约1cm时 处死小鼠，取肿瘤组织，一半石蜡包埋用于皿染色及免疫组化检测，半定量分析肿瘤组织周 围化eg细胞的量;一半制作细胞悬液通过流式细胞术定量分析组织中化eg的量，通过上述 实验验证CCL22对Treg的招募作用。同时取小鼠内脏组织，分析肿瘤远处转移情况；
[0082] 步骤四、用上述石蜡包埋组织切片，采用免疫组化法检测肿瘤组织中化eg表达的 免疫因子IL-10、TGF-i3等的表达差异，通过与肿瘤大小及远处转移情况相关分析确认化eg 的数量对肿瘤生长及转移的影响。
[0083] 进一步，探讨乌司他下对化eg细胞中GITR表达的影响的具体方法为：
[0084] 步骤一、培养上述4T1细胞，收集细胞，行皮下注射构建小鼠荷瘤模型，计划使用动 物24只；
[0085] 步骤二、分空白对照及不同浓度的乌司他下处理实验动物，每组8-10只小鼠，共用 2周。每3天观察，测量瘤体体积，绘制移植瘤生长曲线，比较肿瘤生长转移情况，通过比较分 析明确乌司他下对移植瘤的影响；
[00化]步骤Ξ、至移植瘤直径约1cm时处死小鼠，取肿瘤组织，一半石蜡包埋用于皿染色 及免疫组化检测，半定量分析肿瘤组织周围化eg细胞的量;一半制作细胞悬液通过流式细 胞术定量分析组织中化eg的量，通过上述实验验证CCL22对化eg的招募作用。同时取小鼠内 脏组织，分析肿瘤远处转移情况；
[0087] 步骤四、用上述石蜡包埋组织切片，采用免疫组化法半定量分析肿瘤组织中化eg 细胞中GITR的表达，通过相关分析明确乌司他下对GITR表达的调节，同时与肿瘤生长情况 及转移情况进行相关分析，探讨乌司他下通过调节GITR对移植瘤生物学行为的影响。
[0088] 体内验证乌司他下的免疫调节作用的具体方法为：
[0089] 步骤一、在临床中选择TNBC乳腺癌患者80例，随机分组，用安慰剂(n = 40)对照及 乌司他下（1600U/人/天）（n = 40)处理2周；
[0090] 步骤二、用药3-4周后采患者静脉血10ml，通过离屯、机浓聚血细胞，流式细胞仪患 者检测血中化eg细胞的量；
[0091] 步骤四、比较不同处理对患者Treg细胞的影响，在体内明确乌司他下对化eg细胞 的调节作用。
[0092] 本发明针对乌司他下在乳腺癌中的治疗价值的研究在国内外均属首例，针对该药 物影响肿瘤微环境机制的研究将为该药物应用于乳腺癌治疗特别是Ξ阴性乳腺癌治疗的 临床使用提供应用基础研究。
[0093] W上所述仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制， 凡是依据本发明的技术实质对W上实施例所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于 本发明技术方案的范围内。
【主权项】
1. 一种乌司他丁治疗三阴性乳腺癌的模型构建方法，其特征在于，所述的乌司他丁治 疗三阴性乳腺癌的模型构建方法包括： 构建CCL22过表达和敲低的TNBC细胞模型； 用CCL22过表达及敲低的4T1细胞构建小鼠荷瘤模型； 采用4T1细胞构建小鼠移植瘤模型。2. -种利用权利要求1所述方法检测乌司他丁治疗三阴性乳腺癌的影响与机制的方 法，其特征在于，所述检测乌司他丁治疗三阴性乳腺癌的影响与机制的方法包括以下步骤： 步骤一、通过构建CCL22过表达和敲低的TNBC细胞模型，采用定量PCR与Western blot 检测乌司他丁对TNBC细胞分泌的趋化因子CCL22量的抑制； 步骤二、通过用CCL22过表达及敲低的4T1细胞构建小鼠荷瘤模型，采用流式细胞术与 Western blot方法检测CCL22对肿瘤细胞周围treg细胞的招募，验证CCL22对肿瘤免疫微环 境的影响； 步骤三、通过采用4T1细胞构建小鼠移植瘤模型，应用Western blot方法检测treg细胞 表面GITR的表达，验证乌司他丁通过Treg细胞功能的改变对肿瘤细胞生物学行为的影响。3. 如权利要求2所述的检测乌司他丁治疗三阴性乳腺癌的影响与机制的方法，其特征 在于，所述检测乌司他丁对TNBC细胞分泌的趋化因子CCL22量的抑制，采用的方法为:通过 构建CCL22过表达和敲低的TNBC细胞模型， 应用乌司他丁处理TNBC细胞，提取细胞RNA，确认RNA质量； 通过实时荧光定量PCR检测CCL22在mRNA水平的表达改变； 应用乌司他丁处理TNBC细胞，提取细胞总蛋白，确认蛋白质量； 通过Western blot检测相应细胞中的蛋白表达情况，通过比较明确乌司他丁对CCL22 在蛋白水平的表达影响； 应用乌司他丁处理TNBC细胞，收集培养基中蛋白质，确认蛋白质质量； 通过EL ISA检测培养基中CCL22的水平，验证乌司他丁对TNBC细胞中分泌的CCL22的量 的改变。4. 如权利要求2所述的检测乌司他丁在三阴性乳腺癌的影响与机制的方法，其特征在 于，所述检测CCL22对肿瘤细胞周围treg细胞的招募，验证CCL22对肿瘤免疫微环境的影响 的方法为： 构建CCL22过表达和敲低的TNBC细胞模型， 用CCL22过表达及敲低的4T1细胞构建小鼠荷瘤模型， 取肿瘤组织，流式细胞术检测肿瘤组织及肿瘤周围淋巴结中Treg的量，验证检测CCL22 对Treg的招募作用;检测肿瘤体积大小，肿瘤组织中Treg表达的免疫因子IL-HKTGF-β的表 达差异，以及肿瘤远处转移情况，通过分析检测Treg的数量对肿瘤生长及转移的影响。5. 如权利要求2所述的检测乌司他丁在三阴性乳腺癌的影响与机制的方法，其特征在 于，所述检测treg细胞表面GITR的表达，验证乌司他丁通过Treg细胞功能的改变对肿瘤细 胞生物学行为的影响的方法为： 通过采用4T1细胞构建小鼠移植瘤模型，用乌司他丁处理，比较肿瘤生长转移情况，研 究乌司他丁对移植瘤的影响； 取肿瘤组织，流式细胞术检测肿瘤组织及肿瘤周围淋巴结中Treg的量，同时用western blot法检测Treg细胞中GITR的表达； 通过分析检测乌司他丁对GITR的表达调节作用以及对Treg细胞招募的影响和肿瘤生 物学行为的影响。6.如权利要求4-5任意一项所述的检测乌司他丁在三阴性乳腺癌的影响与机制的方 法，其特征在于，所述的分析采用SPSS. 19.0统计学软件处理数据，数据以Z土S表示，采用 单因素方差分析进行多组间比较，组间两两比较采用LSD-t或Tamhane法，检验水准α = 0.05〇
【文档编号】C12Q1/02GK105920041SQ201610255982
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月22日
【发明人】孙治君, 陈建生, 高峰, 赵晓亮, 罗杰, 钟彪, 王宏, 王宁, 孙昕
【申请人】孙治君