专利名称：贝类选择性杂交制种方法
技术领域：
本发明涉及贝类制种技术，具体地说是一种利用分子标记辅助育种技术有选择地利用不同地理群体间贝类分别积累的遗传变异、通过杂交产生可以直接应用的杂种优势的贝类选择性杂交制种方法。
背景技术：
皱纹盘鲍Haliotis discus hannai Ino是我国鲍科(Haliotidea)种类中最重要的经济种类之一。主要分布于日本列岛北部、朝鲜半岛和中国的黄海北部及渤海海峡的一部分水域。皱纹盘鲍雌雄异体，异体受精，成熟个体性腺雌性为深蓝色，雄性为乳白色，繁殖期在黄渤海区为7～8月。我国比较集中的海区有辽宁省的大连市区、长海县，山东的烟台、成海和青岛海域。皱纹盘鲍在鲍科中属中型种类，但在我国海域分布的种类中却是体形最大的，其肉质细腻柔韧、口感好，是我国鲍科各种类中品质最好、价格最高、最受欢迎的种类。皱纹盘鲍也是我国黄渤海区唯一进行规模养殖鲍科种类。
栉孔扇贝Chlamys farreri(Jones & Preston)隶属于扇贝科(Pectinidae)，分布于日本北部、俄罗斯远东、朝鲜半岛和我国黄渤海区。栉孔扇贝为雌雄异体，性成熟时，雌性腺呈鲜桔红色，雄性腺呈乳白色，卵在体外受精和发育。栉孔扇贝现已经成为我国重要的海水养殖种类之一，其养殖在贝类养殖中占有举足轻重的地位。
皱纹盘鲍和栉孔扇贝都是我国北方海区最重要的经济贝类，都已经在我国开展大规模养殖。但近年来由于频繁发生病害，使皱纹盘鲍和栉孔扇贝的产量急剧下降，给产业造成了重大损失。为了解决上述问题，在病因尚未清楚的情况下，利用“杂种优势”提高养殖对象的抗逆性和活力，可能会缓解目前病害的危害，提高皱纹盘鲍和栉孔扇贝等贝类养殖的生产力水平。
遗传育种的理论与实验都已证明培育杂交种的关键在于找到强优势的杂交组合，亲本间遗传差异大时，它们的杂交种优势亦强。遗传差异的本质是DNA序列水平的差异。用DNA分子生物学方法能正确地测定亲本间的分子差异或分子遗传距离，从而可作为预测杂交种优势的重要指标，帮助育种学家减少配制杂交组合时的盲目性。分析和了解皱纹盘鲍群体间个体及其子一代的遗传结构是获得较大杂种优势的重要途径之一，现代分子生物学技术为此提供了先进的方法和手段。二十世纪九十年代以来，随着人类基因组计划的实施，分子生物学技术得到了突飞猛进的发展，而随机扩增多态脱氧核糖核酸(Random Amplified Polymorphic DNA，缩写RAPD)技术作为其中的一员，因其具有不需要知道所研究物种的遗传背景，并且检测DNA多态性的方式具有独到、快速、简便的特点而得到广泛应用，该技术已迅速渗透到遗传分析的各个领域。RAPD标记现已用于动植物遗传作图、基因快速定位、特殊染色体区段的鉴定和分离、性别鉴定以及群体遗传变异及遗传分化的研究中，近期其在杂种优势预测方面的应用又引起越来越多学者的关注。对于海洋贝类，进行DNA多态性研究的比较多，主要用于种内与种间不同群体间的变异与分化研究，种质鉴定与系统进化研究，在预测杂种优势等有关分子标记辅助育种及选择性杂交方面的研究还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用分子标记辅助育种技术的贝类选择性杂交制种方法。
本发明的技术方案是通过常规分子生物学的随机扩增多态脱氧核糖核酸技术确定种内不同地理群体间的遗传距离，分别从遗传距离较大的群体随机获取一定数量的个体作为亲本进行杂交，其操作步骤为1)种贝的选择取具有不同自然地理分布区的群体，随机取样比较不同群体间的遗传距离，其中容易获得的群体为雌性亲本，雄性亲本为不易获得的、与雌性亲本群体遗传距离较远的、随机取样性成熟的个体，所述杂交所用群体间的遗传距离0.01～0.25；2)种贝促熟取大小为群体内中等偏上的性成熟个体，以雌贝使用量的10～20％为雄贝的使用量；置于16～21℃的水体中，达一定有效积温，培育密度为25～100枚/m3，饲以天然饵料，每天全量换水一次，充天然空气以补充氧气的不足；3)催产将性腺发育成熟的个体经过阴干、升温和紫外线诱导进行催产，具体为在16～21℃条件下阴干1～2小时，然后种贝分别置于15～20L容器内，或全部雌性个体集中于一专用水槽内，雌雄个体严格分离，注入升温至20～23℃、照射强度为300～800mwh/L的紫外线处理海水，在0.5～1.5小时内可以获得雌雄配子；4)将分别获得的雌雄配子进行人工杂交受精；步骤3)中在获得种贝的雌雄配子比较困难时也可解剖性腺，经揉碎离心去除杂质，上清液加热到60～65℃，冷却至正常水温后撒泼到待催产水体中，轻轻搅动或微充自然空气，以促进精卵的排放；步骤2)中所述种贝的配子发生所采用人工促熟的方法也可用自然成熟的方法代替；
所述种贝饲以的天然饵料为大型藻类、单胞藻中之一或其组合；所述杂交为经济杂交；所述用于进行杂交的贝类为经济贝类；所述经济贝类为雌雄异体的、群体间具有所述遗传距离的经济贝类；步骤2)中所述性成熟个体为皱纹盘鲍时，所述群体内中等偏上的性成熟个体为壳长6～8cm，置于19～21℃水中，积温达800～1500℃·日，密度为25～50枚/m3，所述天然饵料投喂量以日计为促熟皱纹盘鲍全重的25～35％，培育环境应尽量保持黑暗；成熟性状为性腺饱满，表面有光泽，突出壳口面，在消化腺与性腺结合部形成一明显的印痕，雌性性腺呈深蓝色，雄性性腺呈乳白色；其有效积温最佳值为1000～1200℃·日；步骤3)中所述性腺发育成熟的个体为皱纹盘鲍的催产阴干条件为18～21℃，注入升温至22～23℃紫外线处理海水中；所述种贝为皱纹盘鲍时天然饵料为大型藻类中之一或其组合；步骤2)中所述性成熟个体为栉孔扇贝时，所述群体内中等偏上的性成熟个体为壳高5～8cm，置于16～18℃水中，有效积温150～350℃·日，培育密度为50～100枚/m3，天然饵料投喂量每天18～40万细胞/ml，分5～6次投喂，控制光照为300～800Lux；性腺成熟的性状为性腺饱满，表面有光泽，雌性性腺呈桔红色，雄性性腺呈乳白色；其有效积温最佳值为180～230℃·日；步骤3)中所述性腺发育成熟的个体为栉孔扇贝的催产阴干条件为16～18℃，注入升温至20～22℃紫外线处理海水中；所述种贝为栉孔扇贝时天然饵料为单胞藻饵料中之一或其组合。
本发明具有如下优点1.具有较强的可操作性。该方法在分子辅助标记研究结果的指导下，选择贝类种内遗传距离相对较远的不同群体进行杂交，以增强其抗逆性和生长势，而且种内群体配子间适配性好，故杂交的受精率高，杂交操作性强，是一种具有广泛应用前景的育种方法。
2.杂交具有方向性。由于本发明采用遗传距离较远、具有选择性的群体作为杂交亲本，因此，这种杂交组合一般会产生杂交优势，成活率高(达50％以上)，生长快。
3.由于采用较小比例的雄贝作为杂交亲本，故降低了生产成本。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1(皱纹盘鲍)通过常规分子生物学的随机扩增多态脱氧核糖核酸技术(RAPD)确定种内不同地理群体间的遗传距离，分别从遗传距离较大的群体随机获取一定数量的个体作为亲本进行杂交，其中容易获得的群体为雌性亲本，其操作步骤为
1)取具有不同自然地理分布区的群体，随机取样比较不同群体间的遗传距离，其中容易获得的群体为雌性亲本，雄性亲本为不易获得的、与雌性亲本群体遗传距离较远的、随机取样性成熟的个体，具体取分布于日本岩手海区的雄性皱纹盘鲍20枚与中国大连长海獐子岛产雌性皱纹盘鲍150枚，经过分子遗传分析，两群体间的遗传距离为0.01，经过人工促熟达性腺成熟后即可进行人工杂交；2)种贝促熟取壳长6～8cm的皱纹盘鲍在20℃条件下置于水体中，积温达到1200℃·天，密度为50枚/m3，饲以海带、裙带菜大型藻类天然饵料，投放量以日计为促熟种贝整体体重的30％，每天全量换水一次，充天然空气以补充氧气的不足，培育环境应尽量保持黑暗，成熟性状为在消化腺与性腺结合部形成一明显的印痕，性腺饱满，表面有光泽，突出壳口面，雌性性腺呈深蓝色，雄性性腺呈乳白色；3)催产将性腺发育成熟的个体，皱纹盘鲍在20℃条件下阴干1小时，然后每个个体分别置于15～20L容器内，注入升温至23℃、照射强度为700mwh/L的紫外线处理海水，此后一般在0.5～1.5小时内可以获得雌雄配子；4)获得雌雄配子后进行杂交受精；5)杂交后的受精卵按正常方法培育。
培育60天后统计，杂交皱纹盘鲍种苗的个体平均大小达到0.2～0.5cm，成活率平均达到50％以上。在20℃条件下发生进程情况见表1。
表1 皱纹盘鲍杂交子代发生的情况发生过程 受精后时间第一极体排出 20分钟第二极体排出 30分钟2细胞期40分钟4细胞期80分钟8细胞期120分钟16细胞期 160分钟囊胚期 190分钟原肠期 6小时担轮幼虫期 11小时初期面盘幼虫期 15小时后期面盘幼虫期 28小时匍匐幼体 3～4天上足分化幼体 19天稚鲍 45天所述皱纹盘鲍日本和中国群体杂交组合体重与大小的平均值见表2表2 皱纹盘鲍日本和中国群体杂交组合体重与大小的平均值(8个月)AJCBCCCCJDJJ平均体重1.59 0.91 1.60 1.06平均大小18.18×11.55 14.92×9.29 18.96×12.28 16.56×10.13AJC为中国雌×日本雄组合，BCC为中国自交组合，CCJ中国雌×日本雄组合，DJJ为日本自交组合。体重单位g；大小单位mm。
实施例2(皱纹盘鲍)与实施例1不同之处在于1)雄性亲贝来自韩国，其中雄性皱纹盘鲍30枚与中国大连长海獐子岛产雌性皱纹盘鲍280枚；两群体间的遗传距离为0.01；2)种贝促熟取壳长6～8cm的皱纹盘鲍在18℃条件下置于水体中，积温达到1000℃·天，密度为25枚/m3，饲以海带、裙带菜大型藻类天然饵料，投放量以日计为促熟贝体整体体重的35％；3)催产将性腺发育成熟的个体，皱纹盘鲍在18℃条件下阴干1.5小时，然后将全部雌性个体集中于一专用水槽内，注入升温至22℃、照射强度为400mwh/L的紫外线处理海水，此后一般在0.5～1.5小时内可以获得雌雄配子。
4)获得雌雄配子后进行杂交受精。
5)杂交后的受精卵按正常方法培育。
本实施例发育情况和生长等情况与实施例1没有明显的差别。
实施例3(栉孔扇贝)与实施例1不同之处在于1)雄性亲本来自日本，其中雄性栉孔扇贝20枚与中国大连产雌性栉孔扇贝130枚；两群体间的遗传距离为0.07；2)种贝促熟将壳高5～8cm的栉孔扇贝置于18℃水体内，有效积温160℃·天，密度为60枚/m3，饲以金藻、硅藻、小球藻、塔胞藻等天然饵料，投喂量为每天20万细胞/ml，分6次投喂，每天全量换水1次，充天然空气以补充氧气的不足，控制光照为400Lux；发育成熟时性腺饱满，表面有光泽，雌性性腺呈桔红色，雄性性腺呈乳白色。
3)催产将性腺发育成熟的个体，在17℃条件下阴干1小时，然后雌雄个体分别置于15～20L不同的容器内，再注入升温至22℃、照射强度为500mwh/L的紫外线处理海水，此后一般在0.5～1.5小时内可以获得雌雄配子。
4)获得雌雄配子后进行杂交受精。
5)杂交后的受精卵按正常方法培育。
在受精卵培育85天后统计，扇贝种苗的个体平均大小达到3～4mm，成活率平均达到60.5％；栉孔扇贝自体受精胚胎在18℃条件下发生进程情况见表3。
表3.栉孔扇贝杂交子代发生的情况发生过程受精后时间第一极体排出15～20分种第二极体排出25分钟2细胞期 80分钟4细胞期 15分钟8细胞期 225分钟32细胞期300分钟囊胚期 510分钟原肠期 16小时担轮幼虫期 21小时面盘幼虫期 28小时壳顶初期4～5天壳顶后期7～8天匍匐幼虫13～14天稚贝15天所述栉孔扇贝日本和中国群体杂交子代体重与大小的平均值见表4。
表4 栉孔扇贝日本和中国群体杂交子代体重与大小的平均值(3个月)AJCBCCCCJDJJ壳高4.10±1.2 3.23±2.1 4.08±2.22 3.56±1.90AJC为中国雌×日本雄组合，BCC为中国自交组合，CCJ中国雌×日本雄组合，DJJ为日本自交组合；壳高单位mm。
实施例4(栉孔扇贝)与实施例3不同之处在于
1)雄性亲贝来自韩国的东海岸，其中雌性栉孔扇贝40枚与中国大连产雌性栉孔扇贝200枚；两群体间的遗传距离为0.25；2)种贝促熟将壳高5～8cm的栉孔扇贝置于16℃水体内，有效积温300℃·天，密度为100枚/m3，饲以饲以金藻、硅藻、小球藻饵料等单胞藻饵料，投喂量为每天40万细胞/ml，分5次投喂，每天全量换水1次，充天然空气以补充氧气的不足，控制光照为700Lux；3)催产将性腺发育成熟的个体，在18℃条件下阴干1.5小时，然后将全部雌雄个体分别集中于一专用水槽内，再注入升温至20℃、照射强度为800mwh/L的紫外线处理海水，此后一般在0.5～1.5小时内可以获得雌雄配子；4)获得雌雄配子后进行杂交受精；5)人工授精后即可按正常方法进行培育；本实施例发育情况与实施例3没有明显的差别。
实施例5与实施例4不同之处在于在获得种贝的雌雄配子比较困难时也可解剖性腺，经揉碎离心去除杂质，上清液加热到60～65℃，冷却至正常水温后撒泼到待催产水体中，轻轻搅动或微充自然空气，以促进精卵的排放。
另外，凡其它雌雄异体、群体间具有所述遗传距离的经济贝类也为本发明所述创意思想之所及，如虾夷扇贝等；本发明步骤2)中所述种贝的配子发生采用人工促熟的方法也可用自然成熟的方法代替。
权利要求
1.一种贝类选择性杂交制种方法，其特征是通过常规分子生物学的随机扩增多态脱氧核糖核酸技术确定不同地理群体间的遗传距离，分别从遗传距离较大的种内不同地理群体随机获取一定数量的个体作为亲本进行杂交，其操作步骤为1)种贝的选择取具有不同自然地理分布区的群体，随机取样比较不同群体间的遗传距离，其中容易获得的群体为雌性亲本，雄性亲本为不易获得的、与雌性亲本群体遗传距离较远的、随机取样性成熟的个体，所述杂交所用群体间的遗传距离0.01～0.25；2)种贝促熟取大小为群体内中等偏上的性成熟个体，以雌贝使用量的10～20％为雄贝的使用量；置于16～21℃的水体中，达一定有效积温，培育密度为25～100枚/m3，饲以天然饵料，每天全量换水一次，充天然空气以补充氧气的不足；3)催产将性腺发育成熟的个体经过阴干、升温和紫外线诱导进行催产，具体为在16～21℃条件下阴干1～2小时，然后种贝分别置于15～20L容器内，或全部雌性个体集中于一专用水槽内，雌雄个体严格分离，注入升温至20～23℃、照射强度为300～800mwh/L的紫外线处理海水，在0.5～1.5小时内可以获得雌雄配子；4)将分别获得的雌雄配子进行人工杂交受精。
2.按照权利要求1所述制种方法，其特征是步骤3)中在获得种贝的雌雄配子比较困难时也可解剖性腺，经揉碎离心去除杂质，上清液加热到60～65℃，冷却至正常水温后撒泼到待催产水体中，轻轻搅动或微充自然空气，以促进精卵的排放。
3.按照权利要求1所述制种方法，其特征是步骤2)中所述种贝的配子发生所采用人工促熟的方法也可用自然成熟的方法代替。
4.按照权利要求1或2所述制种方法，其特征是所述种贝饲以的天然饵料为大型藻类、单胞藻中之一或其组合。
5.按照权利要求1、2或3所述制种方法，其特征是所述杂交为经济杂交。
6.按照权利要求1、2或3所述制种方法，其特征是所述用于进行杂交的贝类为经济贝类。
7.按照权利要求6所述制种方法，其特征是所述经济贝类为雌雄异体的、群体间具有所述遗传距离的经济贝类。
8.按照权利要求1所述制种方法，其特征是步骤2)所述性成熟个体为皱纹盘鲍时，所述群体内中等偏上的性成熟个体为壳长6～8cm，置于19～21℃水中，积温达800～1500℃·日，密度为25～50枚/m3，所述天然饵料投喂量以日计为促熟皱纹盘鲍全重的25～35％，培育环境应尽量保持黑暗；成熟性状为性腺饱满，表面有光泽，突出壳口面，在消化腺与性腺结合部形成一明显的印痕，雌性性腺呈深蓝色，雄性性腺呈乳白色。
9.按照权利要求1或8所述制种方法，其特征是步骤2)中所述性成熟个体为皱纹盘鲍时有效积温最佳值为1000～1200℃·日。
10.按照权利要求1所述制种方法，其特征是步骤3)中所述性腺发育成熟的个体为皱纹盘鲍的催产阴干条件为18～21℃，注入升温至22～23℃紫外线处理海水中。
11.按照权利要求4所述制种方法，其特征是所述种贝为皱纹盘鲍时天然饵料为大型藻类中之一或其组合。
12.按照权利要求1所述制种方法，其特征是步骤2)中所述性成熟个体为栉孔扇贝时，所述群体内中等偏上的性成熟个体为壳高5～8cm，置于16～18℃水中，有效积温150～350℃·日，培育密度为50～100枚/m3，天然饵料投喂量每天18～40万细胞/ml，分5～6次投喂，控制光照为300～800Lux；性腺成熟的性状为性腺饱满，表面有光泽，雌性性腺呈桔红色，雄性性腺呈乳白色。
13.按照权利要求1或12所述制种方法，其特征是所述性成熟个体为栉孔扇贝时有效积温最佳值为180～230℃·日。
14.按照权利要求1所述制种方法，其特征是步骤3)中所述性腺发育成熟的个体为栉孔扇贝的催产阴干条件为16～18℃，注入升温至20～22℃紫外线处理海水中。
15.按照权利要求4所述制种方法，其特征是所述种贝为栉孔扇贝时天然饵料为单胞藻饵料中之一或其组合。
全文摘要
本发明涉及贝类选择性杂交制种方法。它通过RAPD技术确定种内不同地理群体间的遗传距离，分别从遗传距离较大的群体随机获取其个体作为亲本进行杂交，步骤为1)种贝所取雄性亲本为不易获得的、与雌性亲本群体遗传距离较远的、随机取样性成熟的个体；2)促熟取性成熟个体，以雌贝使用量的10～20％为雄贝的使用量；置于16～21℃的水体中，达一定有效积温；3)催产在16～21℃条件下阴干1～2小时，分别置于15～20L容器内，雌雄个体严格分离，注入升温至20～23℃、照射强度300～800mwh/L的紫外线处理海水，获得雌雄配子；4)杂交受精。它利用分子辅助育种技术、有选择地利用不同地理群体间贝类分别积累的遗传变异，通过杂交产生可以直接应用的杂种优势。
文档编号A01K67/00GK1399870SQ0112800
公开日2003年3月5日 申请日期2001年8月3日 优先权日2001年8月3日
发明者张国范, 赵洪恩 申请人:中国科学院海洋研究所