专利名称：含鹅膏肽毒素基因的苏云金杆菌工程菌双效杀虫剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种苏云金杆菌杀虫剂，尤其是经基因克隆的苏云金杆菌杀虫剂。
背景技术：
中国专利申请号011114592.7提出的是一种产生Bt毒蛋白和经基因克隆后产生蛛毒蛋白的苏云金杆菌双效工程菌制剂，同时也提出了包括构建苏云金杆菌工程菌和生产苏云金杆菌工程菌剂的方法。Bt晶体毒蛋白在幼虫肠道的碱性条件下降解成毒性核心片段，作用细胞膜上导致穿孔形成离子通道，引起害虫死亡。而蜘蛛内毒素对昆虫的神经活动有特异的抑制作用，引起昆虫麻痹死亡，因此双效工程菌制剂解决Bt杀虫剂存在的问题和基因杀虫植物尚未解决的问题。但是如何更快的杀灭昆虫，以及扩大杀虫谱和提高安全性是需要不断解决的问题。
发明内容
本发明旨在进一步提高含鹅膏肽毒素基因的苏云金杆菌工程菌剂的速杀效果、扩大杀虫谱和提高安全性。
解决本发明目的的技术方案是含鹅膏肽毒素基因的苏云金杆菌工程菌双效杀虫剂除产生Bt毒蛋白外，经基因克隆后还能产生鹅膏肽类毒素蛋白，该杀虫剂的工程菌剂的活芽孢含量在80亿-100亿/ml，制剂的效价在8000国际单位/μg以上，制剂对鳞翅目、双翅目与鞘翅目的幼虫杀虫率达90-96％。工程菌质粒上除携带Bt毒蛋白基因有cry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cry1Ax、cry1Cb与cry2Ac外，还有携带鹅膏肽类毒素蛋白的基因α-amanitin、phalloin、viroidin。
下面结合附图进一步详述本发明
图1质粒pHT3101结构图；图2鹅膏肽类毒素基因和氨基酸序列以及氨基酸分子图示；图3菌株4.0718质粒上ICPs基因强启动子及SD序列获取示意图；图4鹅膏菌肽类毒素基因表达载体构建示意图；图5融合蛋白整合到Bt菌染色体上示意图；图6双效杀虫工程菌发酵生产工艺流程示意图；
本发明的受体菌是经选育的苏云金杆菌高效杀虫新菌株4.0718(Bacillus thuringiensis subsp.Kurstaki，国家菌种保藏号CCTCC NOM200016)及苏云金亚种(Bacillus thuringiensis subsp.thuringiensis)、库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki)、蜡螟亚种(Bacillus thuringiensis subsp.galleriae)、武汉亚种(Bacillusthuringiensis subsp.wuhanensis)、中华亚种(Bacillus thuringiensissubsp.chinensis)。
鹅膏菌肽类毒素蛋白是从鹅膏菌属(amanita)的多种真菌中分离纯化的肽类毒素，多为7-8个氨基酸组成的双环或单环多肽，主要包括鹅膏毒肽、鬼笔毒肽和毒伞毒肽三类。其中鹅膏毒肽能抑制RNA聚合酶II的活性引起真核细胞细胞核片裂而死亡，鬼笔毒肽和毒伞毒肽能破坏真核细胞中丝状肌动蛋白和球状肌动蛋白的动态平衡从而导致细胞功能萎缩，引起细胞死亡。鹅膏毒肽(α-amanitin)是一种双环八肽，分子量为918.99；鬼笔毒肽(phalloin)是一种双环七肽，分子量为772.9；毒伞毒肽(viroidin)是一种单环七肽，分子量为864.89；此三种毒肽都能在短时间内杀死昆虫细胞，导致昆虫机体功能丧失而死亡。
本发明将鹅膏菌肽类毒素基因克隆进工程菌质粒的载体是一种能在Bt及E.coli都能复制的穿梭载体PHT3101(结构见
图1)。
鹅膏菌肽类毒素蛋白的基因序列和氨基酸序列见表2。
鹅膏菌肽类毒素蛋白的苏云金杆菌工程菌的构建如下(1)可调控表达载体的构建用Triton X-100温和法抽提菌株4.0718总质粒，在Pst I/BamH I双酶切以后，得到4Kb左右的基因片段，用琼脂糖凝胶电泳分离纯化，另用Pst I/BamH I双酶切穿梭载体pHT3101，得到带有两个不同粘性末端的链状DNA。用碱性磷酸酶去磷酸化，将分离纯化的4Kb左右的基因片段与去磷酸化的载体pHT3101混合，用T4 DNA连接酶连接，产生质粒pXLZ601，电转化质粒pXLZ601的无晶体突变株，通过红霉素平板筛选转化子，通过革兰氏染色镜检选择产生晶体的转化子，在LB培养基上活化、培养转化子，用TritonX-100提取质粒，经琼脂糖凝胶电泳分离纯化，用pst I/BamHI双酶切或双酶切后通过CsCl密度梯度离心，Glass-milk法获得带有完整的ICPS开放阅读框的片段，将片段测序后用计算机软件对序列进行分析，确定其启动序列及SD序列，上述片段通过PCR扩增起始密码子ATG前的全长启动序列，并在5’端和3’端分别加上ECoR I、Sal I位点，经纯化，用ECoR I/Sal I双酶切。载体pHT3101同样用ECoR I/Sal I双酶切，用碱性磷酸酶去磷酸化，两者混合，用T4 DNA连接酶在ATP存在的条件下将两者连接起来，形成质粒pXLZ602，转化E.coli DH5α中扩增；(2)鹅膏菌肽类毒素基因的化学合成及domain II序列的获取依据鹅膏菌肽类毒素基因序列采用化学合成方法，合成毒素多肽全长基因，在基因的5’端和3’端分别带有ECoRI、XbaI位点，同时在3’端另加终止密码子TGA，在Gene Bank中查找已有的ICPs domain II序列。通过序列分析软件，阵列比较保守区，并与测序片段比较。根据保守区确定其domain II边界，用化学合成和PCR方法获得domain II基因片段，分别在5′端和3′端带有Sal I、ECoR I酶切位点，在5′端另加起始密码子ATG，通过PCR即可获得domain II区段，用碱裂解法提取质粒pXLZ602，用Sal I/Xba I双酶切后，用碱性磷酸酶去磷酸化，另将已获得的domain II序列用EcoR I酶切后，与化学合成的在5′端带有EcoR I位点的毒素基因混合，用T4 DNA连接酶连接，在连接片段纯化后，用Xba I酶切并与去磷酸化的链状质粒pXLZ602混合，用T4 DNA连接酶连接，形成质粒pXLZ603，转化无质粒突变株，通过红霉素平板选择转化子；(3)将带有启动序列的融合蛋白基因整合到Bt菌DNA上稳定遗传将野生型转痤子Tn5401两端用核酸外切酶去除转座酶识别的边界，用酶切的方法删除转座酶，纯化剩余片段，用T4DNA连接酶连接，插入到pHT3101中，形成质粒pXLZ604，转入E.coli DH5α中扩增，用Triton X-100温和法分别提取质粒pXLZ603、pXLZ604，分离纯化pXLZ603的重组片段，插入到pXLZ604中删除了转座酶的位点上，用酶切去除质粒pXLZ604中的Bt复制子，产生质粒pXLZ605。用电转化、基因枪或金属离子诱导法转化E.coli DH5α中扩增，氨苄青霉素平板选择转化子，将野生型转座子Tn5401转入苏云金杆菌4.0718的染色体上，产生新菌株，将质粒pXLZ605电转化新菌株，改造后的Tn5401及全长融合基因整合到已存在于染色体上的野生型转座子Tn5401中，用红霉素平板选择转化子；工程菌菌剂的生产发酵工艺流程见图5，主要包括菌种活化、一级种子罐发酵培养、二级种子罐发酵培养和生产用发酵罐培养。工程菌剂的活芽孢含量在80亿-100亿/ml，制剂的效价在8000国际单位/μg以上。
本发明与现有的生物农药相比具有以下优点(1)速杀效果好由于工程菌株分别带有多种杀虫毒素Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Ac、α-amanitin、phalloin、viroidin除了自身的杀虫能力外还具有显著的正协同作用，能对害虫产生胃毒及触杀双重效果，因此杀虫效价更高，迅速杀灭害虫。
(2)杀虫谱广工程菌自身带有多种杀虫毒素，同时由于α-amanitin、phalloin、viroidin等鹅膏菌肽类毒素基因与改造后的ICPs domain II区域以融合蛋白形式表达，使其可识别的范围增大，同时能对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等多类害虫有效，因此在使用上防治面很广，成本相对较低。
(3)安全性更高由于工程菌所携带的毒素均为天然毒素，容易为自然界中的微生物所降解和易受阳光紫外线破坏、不形成残留；同时，各种毒素对人、畜均无害。因此，在生态环境保护、出口创汇及促进人类健康等方面形成极大的优势。
权利要求
1.一种含鹅膏肽毒素基因的苏云金杆菌工程菌双效杀虫剂，能产生Bt毒蛋白，其特征在于该工程菌双效杀虫剂经基因克隆后还能产生鹅膏肽类毒素蛋白，该杀虫剂的工程菌剂的活芽孢含量在80亿-100亿/ml，制剂的效价在8000国际单位/μg以上，制剂对鳞翅目、双翅目与鞘翅目的幼虫杀虫率达90-96％。
2.按权利要求1所述的含鹅膏肽毒素基因的苏云金杆菌工程菌双效杀虫剂，工程菌质粒上携带Bt毒蛋白的基因有cry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cry1Ax、cry1Cb与cry2Ac，其特征在于工程菌质粒上还携带有鹅膏肽类毒素蛋白的基因α-amanitin、phalloin、viroidin。
全文摘要
本发明涉及一种经基因克隆的苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)工程菌菌剂。本发明以苏云金杆菌4.0718菌株及苏云金杆菌类等亚种为宿主,经过可调控表达载体的构建,将带有强启动序列和含有domainI工序列融合蛋白基因的鹅膏菌肽类毒素蛋白基因整合到Bt菌DNA上稳定遗传,构建产生鹅膏菌肽类毒素蛋白和Bt毒蛋白的基因工程菌,经发酵生产制备双效杀虫剂;该菌剂效价在8000国际单位/μg以上,对鳞翅目、双翅目与鞘翅目的幼虫杀虫率为90－96%,该菌剂为绿色农药,无残留,对人、畜安全,有利保护生态环境。
文档编号A01N63/00GK1341362SQ0112866
公开日2002年3月27日 申请日期2001年10月9日 优先权日2001年10月9日
发明者夏立秋, 丁学知, 莫湘涛, 陈作红, 陈宇, 谢伟岸, 张何 申请人:湖南师范大学