专利名称：形成日本松蕈的人工shiro的方法
相关申请的交叉引用本申请基于2001年1月26日提交的在先日本专利申请2001-018691，并要求其优先权，该文献引入本文作参考。
但是，在自然环境中，腐生生物和糖真菌优先在美加红松(即日本松蕈的宿主植物)生长的营养部位增殖。鉴于此，日本松蕈(共生真菌)难以形成其Shiro。
很久以前就曾进行日本松蕈(Tricholoma Matsutake(S.Ito et Imai)Sing.)人工栽培的各种研究。但是，仍不能人工栽培日本松蕈。
日本松蕈人工栽培的研究结果将在以下进行描述。
Masui试验表明日本松蕈形成与美加红松根相连的菌根(Masui，K.(1927)，Mem.Coll.Sci.Kyoto Univ.B(2)2，149-279)。Tominaga研究了日本松蕈菌丝生长的最佳条件(Tominaga，Y.(1965)Bull.Hiroshima Agri.Coll.2242-246)。Ogawa等通过纯性培养研究了日本松蕈子实体原基的形成(Ogawa，M和Hamada，M(1975)，Trans.Mycol.Soc.Japan 16406-415)。但是，还未见报道成功诱导日本松蕈Shiro形成。
为了完成本发明，本发明的发明者集中于日本松蕈菌丝生长极为缓慢的事实上。他们考虑菌丝生长缓慢可能是阻止日本松蕈人工栽培进步的因素之一。到目前为止，为了大量生产日本松蕈，曾试图通过将日本松蕈菌丝接种到宿主植物生长的森林中而人工形成新的Shiro。但是，通过此尝试，日本松蕈菌丝没有生长达到实际应用程度地形成Shiro。因此，目前认为难以人工栽培日本松蕈。
本发明的发明者发现了能够促进日本松蕈菌丝生长的活性成分(active principle)。基于这一发现，他们建立了在短期内增殖日本松蕈菌丝的方法，从而完成了本发明。更具体地说，通过以下描述的手段实现本发明。
(1)形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其包括在含有作为活性成分的能够控制菌丝的细胞膜通透性的物质的培养基中培养日本松蕈菌丝。
(2)形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其包括在含有作为活性成分的能够增强菌丝的亲水性质的物质的培养基中培养日本松蕈菌丝。
(3)形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其包括在含有作为活性成分的表面活性剂和/或天然植物油的培养基中培养日本松蕈菌丝。
(4)形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其包括在含有作为活性成分的脂肪酸酯的培养基中培养日本松蕈菌丝。
(5)形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其包括通过无菌均化日本松蕈菌丝菌落，并在液体营养培养基中无菌培养得到的菌丝来诱导日本松蕈菌丝的生长；通过用不含碳源的液体营养培养基无菌替换含有诱导生长的日本松蕈菌丝的液体营养培养基而制备日本松蕈菌丝接种物；以及在含有作为活性成分的能够控制菌丝的细胞膜通透性的物质的培养基中无菌培养日本松蕈菌丝接种物。
(6)形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其包括通过无菌均化日本松蕈菌丝菌落，并在液体营养培养基中无菌培养得到的菌丝来诱导日本松蕈菌丝的生长；通过用不含碳源的液体营养培养基无菌替换含有诱导生长的日本松蕈菌丝的液体营养培养基而制备日本松蕈菌丝接种物；以及在含有作为活性成分的能够增强菌丝的亲水性质的物质的培养基中无菌培养日本松蕈菌丝接种物。
(7)形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其包括
通过无菌均化日本松蕈菌丝菌落，并在液体营养培养基中无菌培养得到的菌丝来诱导日本松蕈菌丝的生长；通过用不含碳源的液体营养培养基无菌替换含有诱导生长的日本松蕈菌丝的液体营养培养基而制备日本松蕈菌丝接种物；以及在含有作为活性成分的表面活性剂和/或天然植物油的培养基中无菌培养日本松蕈菌丝接种物。
(8)形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其包括通过无菌均化日本松蕈菌丝菌落，并在液体营养培养基中无菌培养得到的菌丝来诱导日本松蕈菌丝的生长；通过用不含碳源的液体营养培养基无菌替换含有诱导生长的日本松蕈菌丝的液体营养培养基而制备日本松蕈菌丝接种物；以及在含有作为活性成分的脂肪酸酯的培养基中无菌培养日本松蕈菌丝接种物。
(9)按照(1)至(8)中的任一项的形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其中将含有浓度为0.2-10％(重量)的活性成分的溶液用作活性成分。
(10)按照(1)至(9)中的任一项的形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其中将用有机溶剂和蒸馏水制备的含有活性成分的溶液用作活性成分。
(11)按照(1)至(10)中的任一项的形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其中将粒积为3毫米或3毫米以下的土壤或粒积为2毫米或2毫米以下的人工培养基用作培养基。
(12)按照(1)至(11)中的任一项的形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其中将活性成分以含有活性成分的溶液的状态加入培养基中，且含有活性成分的溶液与总重量的重量比为15-30％(重量)。
本发明的其它目的和优点将在下面的叙述中阐明，部分将从说明书中明显得出，或者可以在本发明的实践中得到。本发明的目的和优点可以通过本文以下特别指出的手段和组合实现并得到。
图1显示通过加入吐温80，日本松蕈菌丝的量的增加。
图2显示通过加入橄榄油，日本松蕈菌丝的量的增加。
作为本发明中使用的日本松蕈菌株，可以使用可从ATCC(美国典型培养物保藏中心)得到的商品化菌株，如ATCC 34979、ATCC34981和ATCC 34988。优选地，从商品化的菌株中筛选优良菌株并可以将其投入使用。
日本松蕈菌株可以在通常在本领域中用于供养共生真菌的培养基中增殖，这些培养基诸如Ohta培养基(Ohta，A.(1990)Trans.Mycol.Soc.Japan 31323-334)、MMN培养基(Marx，D.H.(1969)Phytopathology 59153-163)，以及Hamada培养基(Hamada(1964)Matsutake(日本松蕈)，97-100)。在它们中，从其增殖效率的角度而言，Ohta培养基优选用于日本松蕈菌株的增殖。通常，培养基可以是固体培养基(例如琼脂)或液体培养基。
通常，日本松蕈菌株在暗处，在约20-25C的温度下无菌传代培养。
在本发明中，可以使用在上述培养基中在上述条件下传代培养的任何日本松蕈储备菌株的菌丝。活性成分的类型及其制备在本发明的一个方面，在含有作为活性成分的能够控制菌丝的细胞膜通透性的物质的培养基中培养日本松蕈菌丝。在本发明中，能够控制菌丝的细胞膜通透性的物质没有特别的限制，只要其增强菌丝的细胞膜通透性。几种类型的这些物质可以组合使用。认为这种能够控制菌丝的细胞膜通透性的物质促进酶，如纤维素酶(存在于菌丝中)从菌丝的释放。这些能够控制菌丝的细胞膜通透性的物质的优选的实例可以是表面活性剂和天然植物油。
在本发明的另一个方面，在含有作为活性成分的能够增强菌丝的亲水性质的物质的培养基中培养日本松蕈菌丝。在本发明中，能够增强菌丝的亲水性质的物质没有特别的限制，只要其促进菌丝侵入培养基并对增加菌丝吸收营养物的量有贡献。几种类型的这些物质可以组合使用。能够增强菌丝的亲水性质的物质的优选的实例可以是表面活性剂和天然植物油。
在本发明的另一个方面，在含有作为活性成分的表面活性剂和/或天然植物油的培养基中培养日本松蕈菌丝。可以含有表面活性剂或天然植物油作为活性成分，或者可以含有二者。在本发明中，只要物质在表面活性剂或天然植物油的范畴内，即使其不一定控制菌丝的细胞膜通透性，也可以用作本发明的活性成分。类似地，在本发明中，只要物质在表面活性剂或天然植物油的范畴内，即使其不一定增强菌丝的亲水性质，也可以用作本发明的活性成分。
在本发明中使用的表面活性剂没有特别的限制，只要其被称为表面活性剂。优选地，可以使用非离子表面活性剂，更优选地，可以使用吐温类表面活性剂，如吐温80和吐温40。几种类型的表面活性剂可以组合使用。
在本发明中使用的天然植物油没有特别的限制，只要其被称为天然植物油。例如，可以使用橄榄油、红花油或葡萄籽油。几种类型的天然植物油可以组合使用。
按照另一方面，在本发明中优选使用的活性成分还可以是脂肪酸酯。在本发明的一个方面，在含有作为活性成分的脂肪酸酯的培养基中培养日本松蕈菌丝。在本发明中，脂肪酸酯优选是高级脂肪酸酯，更优选是具有12-18个碳原子的脂肪酸酯，进一步优选是具有12-18个碳原子的不饱和脂肪酸酯，更进一步优选是油酸酯。例如，可以将含有上述优选脂肪酸酯的脂肪和油用作活性成分。几种类型的脂肪酸酯可以组合用作活性成分。并且，脂肪酸酯可以与能够控制菌丝的细胞膜通透性的非脂肪酸酯物质组合使用。脂肪酸酯可以与能够增强菌丝的亲水性质的非脂肪酸酯物质组合使用。
脂肪酸酯可以在本发明中用作活性成分这一事实被认为与一些表面活性剂和天然植物油含有上述脂肪酸酯这一事实密切相关。因此，如果一种物质在脂肪酸酯的范畴内，且表面活性剂或天然植物油含有该物质，自然其可以在本发明中用作活性成分。
上述活性成分优选以含有活性成分的溶液的状态加入培养基中。含有活性成分，如能够控制菌丝的细胞膜通透性的物质(例如，表面活性剂和/或天然植物油)的溶液优选如下制备用有机溶剂(优选为乙醇)和蒸馏水将其稀释至期望浓度，然后将其加入培养基中。含有能够控制菌丝的细胞膜通透性的物质的溶液优选通过将其稀释到0.2-10％(重量)的浓度而制备。类似地，含有能够增强菌丝的亲水性质的物质的溶液优选通过将其稀释到0.2-10％(重量)的浓度而制备。
更具体地说，当表面活性剂用作活性成分时，表面活性剂的稀释浓度通常是0.2％(重量)或更高，优选是0.2-10％(重量)，更优选是1-5％(重量)。低于0.2％(重量)的稀释浓度不优选的原因是不能发生表面活性剂对菌丝生长的显著影响。
当天然植物油用作活性成分时，天然植物油的稀释浓度通常是0.2％(重量)或更高，优选是0.2-5％(重量)，更优选是0.5-2％(重量)。类似地，低于0.2％(重量)的稀释浓度不优选的原因是不能发生天然植物油对菌丝生长的显著影响。
在表面活性剂和天然植物油共同用作活性成分时，将总稀释浓度设置在0.2％(重量)或更高，优选是0.2-10％(重量)，更优选是0.5-5％(重量)。
当脂肪酸酯用作活性成分时，脂肪酸酯的稀释浓度通常为0.2％(重量)或更高，优选是0.2-10％(重量)，更优选是0.5-5％(重量)。
含有活性成分的溶液优选通过将其如下稀释而制备。将活性成分，如能够控制菌丝的细胞膜通透性的物质(例如表面活性剂和/或天然植物油)溶解在有机溶剂(优选为乙醇)中，将得到的溶液搅拌5到10分钟，得到匀匀溶液。然后，将蒸馏水加入到匀匀溶液中，得到含有期望浓度活性成分的溶液。有机溶剂的终浓度通常调到0.2-5％(重量)，优选是约2％(重量)。用于制备溶液的有机溶剂没有特别的限制，只要它对日本松蕈菌丝的生长没有负面影响。优选使用乙醇。例如，含有1％(重量)吐温80的溶液可以通过将1克吐温80(商品化的)和2毫升99.5％乙醇混和，然后向其中加入98毫升蒸馏水而制备。以这种方式，可以制备含有活性成分，如表面活性剂和/或天然植物油的均匀溶液(本文以下也称为“含有活性成分的制备溶液”)。培养基的制备用于添加上述活性成分(如能够控制日本松蕈菌丝的细胞膜通透性的物质)的培养基没有特别的限制，只要日本松蕈菌丝能够在其中生长。从自然环境中采集的土壤和人工培养基(例如，比例为1∶1的土壤和蛭石)都可以用作培养基。在本发明的实施例中，使用黑土，其含有Kanto Plain的壤土层作为基底。
这种培养基优选通过筛进行筛分，使培养基的粒积较小并且均一。优选将土壤粒积调节到约3毫米或3毫米以下，更具体地说，调节到约2-3毫米。对于人工培养基的情况，优选将粒积调节到约2毫米或2毫米以下，更具体地说，调节到约1-2毫米。
如上所述使粒积均一的培养基可通过干热干燥。作为实例，如果在约60℃进行约20-30小时，那么干热是充分的。
向干燥的培养基中加入前述活性成分。优选地，向干燥的培养基中加入含有期望浓度活性成分如表面活性剂和/或天然植物油的制备溶液。此时，制备溶液优选在培养基中完全扩散，使得所得的培养基不以湿状态获得，而以接触干燥(dry-touched)的状态获得。换句话说，优选将培养基制备为含有制备溶液的量为总重量的15-30％(重量)，更优选是20-25％(重量)。将活性成分如表面活性剂和/或天然植物油加入培养基中，然后将其灭菌，并用作日本松蕈菌丝的培养基。灭菌可以通过，例如在120℃高压灭菌30分钟或者50-60千戈瑞的γ-射线照射而进行。
用这种方式制备的培养基适于日本松蕈菌丝生长。日本松蕈菌丝的培养将如上述制备的含有活性成分的培养基加入无菌容器(培养皿等)中。将含有日本松蕈菌丝的菌丝溶液接种到无菌容器中的培养基中，使菌丝溶液在培养基中完全扩散。日本松蕈菌丝的培养可以在25±1℃在暗处进行。培养日本松蕈菌丝1到3个月后，取一片生长的菌丝(即Shiro)作为样品，基于麦角固醇的量确定菌丝的生长量。麦角固醇可以如下定量。将Shiro样品冻干(EYELA，FDU-830)后，取1克样品，并用2.5毫升乙醇(99.5％)提取。将得到的提取物加载于HPLC(高效液相色谱；HITACHI，L-7300柱，L-7400UV检测器；L-7200自动进样器；L-7100泵；D-7500积分仪)以定量提取物中的麦角固醇。就定量过程的细节而言，应参阅Martin等，(1990)Mycol.Res.941059-1064。培养开始约1周后，观察到菌丝在培养基的表面上生长。培养开始约4周后，发现菌丝的生长量增加。
如上所述，当在含有活性成分(例如，表面活性剂和/或天然植物油)的培养基中培养日本松蕈菌丝时，该日本松蕈菌丝的生长量明显高于在不含活性成分的培养基中培养的日本松蕈菌丝的生长量。根据本发明的形成人工Shiro的方法，可能在短至几个月的培养期间形成含有菌丝的Shiro，其含菌丝的量相当于产日本松蕈森林中的天然Shiro所含菌丝的量。因此，本发明的人工Shiro形成方法极为有用，因为其成为人工栽培日本松蕈的基础。
如上所述，可以通过在含有前述活性成分如能够控制日本松蕈菌丝的细胞膜通透性的物质(例如，表面活性剂和/或天然植物油)的培养基中培养日本松蕈菌丝来诱导日本松蕈的人工Shiro。优选地，首先制备活跃生长的日本松蕈菌丝接种物，然后在含有前述活性成分的培养基中培养该接种物。制备活跃生长的日本松蕈菌丝接种物的方法包括(1)诱导日本松蕈菌丝生长的步骤，和(2)制备日本松蕈菌丝接种物的步骤。
以下将解释这两个步骤。两个步骤均无菌进行。
(1)诱导日本松蕈菌丝生长的步骤通过无菌均化日本松蕈菌丝菌落，并在液体营养培养基中无菌培养得到的菌丝来进行诱导日本松蕈菌丝生长的步骤。
在这一步骤中，作为日本松蕈菌丝菌落，可以使用在固体培养基上无菌传代培养的日本松蕈菌丝菌落。优选地，可以通过取一片在固体培养基上传代培养的菌落，将其接种到具有相同成分的液体培养基中，并在20-25℃在暗处进一步培养2-3周而制备菌落(即，菌丝体)。
从培养基中取一片前述菌落，将具有相同成分的新鲜液体培养基加入菌落中，并将其无菌均化，从而得到菌丝细胞的悬浮液。本文中的无菌均化指每个菌丝细胞本身不被破坏，但是彼此分离。例如，无菌均化可以通过使用干热灭菌匀浆器在超净工作台中进行。可以用匀浆器均化菌落，匀浆器的转速为80×100转/分钟到120×100转/分钟，优选为100×100转/分钟，均化约4到8秒，优选是6秒。
将通过均化得到的菌丝细胞的悬浮液在相同的液体培养基中在前述条件下进一步培养3-5天。以这种方式，可能获得活跃生长的日本松蕈菌丝的悬浮液。
通过均化上述菌落，将形成菌落的每个菌丝细胞粗略地彼此分离。由于分离，可以获得具有快速生长能力的日本松蕈菌丝细胞。估计这是因为，与菌落形式的菌丝细胞相比，每个分离的菌丝细胞从培养基中高速摄取营养，这加速菌丝细胞的顶端生长。
(2)制备日本松蕈菌丝接种物的步骤通过用不含碳源的液体营养培养基无菌替换含有上述步骤(1)中得到的诱导生长的日本松蕈菌丝的液体营养培养基而进行制备日本松蕈菌丝接种物的步骤。
更具体地说，接种物的制备可以如下进行。首先通过使用尼龙筛孔滤器(平均孔径大小为24×30微米)过滤含有日本松蕈菌丝的液体营养培养基(优选是含有在上述步骤(1)中得到的具有快速生长能力的日本松蕈菌丝的液体培养基)。
然后，将通过过滤得到的菌丝用经改性使其不含碳源的液体培养基(本文以下也称为“改性液体培养基”)无菌淋洗。优选用10毫升改性液体培养基进行至少三次淋洗。用于淋洗的改性液体培养基没有特别的限制，只要其是通过从能够用于菌丝培养的液体培养基中去除碳源而得到的。优选地，使用通过从SH液体培养基中去除葡萄糖而制备的改性液体培养基(Schenk R.U.和Hildebrandt A.C.(1972)Can.J.Bot.50199-204)。
淋洗菌丝后，将适量改性液体培养基加入菌丝，从而获得菌丝接种物，其中初始液体培养基被不含碳源的改性液体培养基代替。
当使用步骤(1)和(2)中制备的活跃生长的菌丝接种物诱导日本松蕈的人工Shiro时，本发明的有利效果更为显著。
(1)日本松蕈菌丝接种物的制备从日本松蕈菌株(Tm 89；保存于本发明的发明者的实验室)储备菌丝取一片菌丝，在Ohta琼脂培养基上培养4周。Ohta培养基的成分如下。
表1 Ohta培养基
*N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸**无机溶液(每1000毫升)FeCl35毫克，MnSO4·4-6H2O50毫克，ZnSO4·7H2O 300毫克，CoSO4·7H2O 50毫克，CuSO4·5H2O 100毫克，NiSO4·6H2O 200毫克，乙酰丙酮3毫升***维生素溶液(每1000毫升)盐酸硫胺素300毫克，烟酸5毫克，叶酸3毫克，生物素5毫克，盐酸吡多醇0.5毫克，氯化肉碱1毫克，腺嘌呤·硫酸·2H2O 3毫克，氯化胆碱3毫克。
将生长的菌丝从琼脂培养基以2毫米×2毫米的大小切下，并将其在新鲜液体Ohta培养基中培养3周。将得到的菌丝菌落用匀浆器均化并再培养3天。培养后，将得到的菌丝用无葡萄糖的液体培养基(改性SH液体培养基)淋洗三次，并悬浮于同样的无葡萄糖液体培养基中。以这种方式制备日本松蕈菌丝接种物。无葡萄糖培养基的成分如下所示。
表2 改性SH液体培养基
(2)表面活性剂(吐温80)添加剂的制备将吐温80(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯，可从WakoPure Chemical Industries，Ltd.得到)与99.5％乙醇混合，并搅拌5分钟。向得到的吐温80/乙醇溶液中加入蒸馏水，以制备吐温80添加剂。例如，通过将1克吐温80(商品化的)加入到2毫升99.5％的乙醇中，接着加入98毫升蒸馏水而制备1％(重量)的吐温80添加剂。乙醇的终浓度为约2％(重量)。
(3)用于培养日本松蕈菌丝的土壤的制备土壤取自东京大学校园矮灌木下的位置。通过筛对土壤进行筛分，以将粒积调节至3毫米或3毫米以下。将土壤(粒积均一)用干热灭菌器在60℃干燥24小时。将含有0％(重量)、1％(重量)、2％(重量)或5％(重量)吐温80的吐温80添加剂(在实施例1的步骤(2)中制备)加入土壤中并充分混合。在含有0％(重量)吐温80的添加剂的情况中，加入与含1％(重量)、2％(重量)和5％(重量)吐温80的吐温80添加剂的情况中等量的乙醇，乙醇浓度在每种吐温80添加剂中为2％。这样制备土壤以使其含有占总重量20％(重量)的吐温80添加剂，然后将土壤在高压灭菌器中于121℃灭菌30分钟。以这种方式得到用于培养日本松蕈菌丝的土壤。
(4)日本松蕈菌丝的接种将用于培养的土壤(实施例1步骤(3)中制备)以30毫升的量加入无菌培养皿(直径为90毫米)中。将5毫升日本松蕈菌丝溶液(即实施例1步骤(1)中制备的接种物)接种到培养皿中的土壤中，以使其在土壤中完全扩散。此后，将培养皿在暗处于25±1℃培养。培养开始1个月后，测定麦角固醇的量以确定菌丝的量，麦角固醇是日本松蕈菌丝细胞膜的成分(Martin等，(1990)Mycol.Res.941059-1064)。麦角固醇的量指示日本松蕈菌丝的量。麦角固醇量的测定如下进行从每个样品收集土壤(1克)，从中提取麦角固醇，并定量。作为对照，从产日本松蕈森林(Ina，Nagano县，十月，2000年)中的天然Shiro取土壤，并进行相同的测定。从麦角固醇的测定结果(
图1)发现，通过加入吐温80使日本松蕈菌丝的生长显著增强。另一方面，来自产日本松蕈森林(Ina)的天然Shiro中麦角固醇的量为59.68微克/克干燥土壤。
(2)天然植物油(橄榄油)添加剂的制备将橄榄油(Ajinomoto Co.Inc.)与99.5％的乙醇混合，并搅拌5分钟。向所得的橄榄油/乙醇溶液混合物中加入蒸馏水，以制备橄榄油添加剂。例如，通过将1克橄榄油(商品化的)和2毫升99.5％的乙醇混合，接着加入98毫升蒸馏水而制备含有1％(重量)橄榄油的添加剂。乙醇的终浓度为约2％(重量)。
(3)用于培养日本松蕈菌丝的土壤的制备除了将含有0％、1％或2％橄榄油的橄榄油添加剂(在实施例2步骤(2)中制备)加入用于培养的土壤中之外，以与实施例1步骤(3)中所描述的相同的方式进行用于培养日本松蕈菌丝的土壤的制备。
(4)日本松蕈菌丝的接种将用于培养的土壤(实施例2步骤(3)中制备)以30毫升的量加入无菌培养皿(直径90毫米)中。将5毫升日本松蕈菌丝溶液(即，实施例2步骤(1)中制备的接种物)接种到培养皿中的土壤中，以使其在土壤中完全扩散。此后，将培养皿在暗处于25±1℃培养。培养开始3个月后，测定麦角固醇的量以确定菌丝的量，麦角固醇是日本松蕈菌丝细胞膜的成分(Martin等，(1990)Mycol.Res.941059-1064)。麦角固醇量的测定如下进行从每个样品收集土壤(1克)，从中提取麦角固醇，并定量。作为对照，从产日本松蕈森林(Ina，Nagano县，十月，2000年)中的天然Shiro取土壤，并进行相同的测定。从麦角固醇的测定结果(图2)发现，通过加入橄榄油使日本松蕈菌丝的生长显著增强。另一方面，来自产日本松蕈森林(Ina)的天然Shiro中麦角固醇的量为59.68微克/克干燥土壤。通过加入橄榄油，经3个月的培养后所得到的人工Shiro中的麦角固醇量增加，其水平几乎与来自产日本松蕈森林的天然Shiro中的水平相同。本发明的优点目前，还没有实现人工培养日本松蕈。
本发明的优点在于，通过向培养基如无菌土壤或人工培养基中加入活性成分，如能够控制菌丝的细胞膜通透性的物质和/或能够增强菌丝的亲水性质的物质，将日本松蕈菌丝的生长诱导到令人满意的水平，而不使用其他营养成分。本发明的方法在以下方面具有优势在短时期内形成日本松蕈Shiro，其含有与产日本松蕈森林中的天然存在的Shiro同样量的菌丝。
可以通过使用本发明的方法诱导的人工Shiro将日本松蕈菌丝直接接种到天然美加红松森林中。本发明的快速形成日本松蕈的人工Shiro的方法成为建立人工栽培日本松蕈技术的基础。
本发明的其他优点和改进对本领域技术人员而言是容易想到的。因此，本发明不限于本文所示和描述的具体细节和代表性实施方案。因此，在不背离本所附权利要求书所定义的总的发明构思的实质和范围的前提下，可以对本发明进行各种修改。
权利要求
1.形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其特征在于包括在含有作为活性成分的能够控制菌丝的细胞膜通透性的物质的培养基中培养日本松蕈菌丝。
2.形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其特征在于包括在含有作为活性成分的能够增强菌丝的亲水性质的物质的培养基中培养日本松蕈菌丝。
3.形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其特征在于包括在含有作为活性成分的表面活性剂和/或天然植物油的培养基中培养日本松蕈菌丝。
4.形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其特征在于包括在含有作为活性成分的脂肪酸酯的培养基中培养日本松蕈菌丝。
5.形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其特征在于包括通过无菌均化日本松蕈菌丝菌落，并在液体营养培养基中无菌培养得到的菌丝来诱导日本松蕈菌丝的生长；通过用不含碳源的液体营养培养基无菌替换含有诱导生长的日本松蕈菌丝的液体营养培养基而制备日本松蕈菌丝接种物；以及在含有作为活性成分的能够控制菌丝的细胞膜通透性的物质的培养基中无菌培养日本松蕈菌丝接种物。
6.形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其特征在于包括通过无菌均化日本松蕈菌丝菌落，并在液体培养基中无菌培养得到的菌丝来诱导日本松蕈菌丝的生长；通过用不含碳源的液体营养培养基无菌替换含有诱导生长的日本松蕈菌丝的液体营养培养基而制备日本松蕈菌丝接种物；以及在含有作为活性成分的能够增强菌丝的亲水性质的物质的培养基中无菌培养日本松蕈菌丝接种物。
7.形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其特征在于包括通过无菌均化日本松蕈菌丝菌落，并在液体营养培养基中培养得到的菌丝来诱导日本松蕈菌丝的生长；通过用不含碳源的液体营养培养基无菌替换含有诱导生长的日本松蕈菌丝的液体营养培养基而制备日本松蕈菌丝接种物；以及在含有作为活性成分的表面活性剂和/或天然植物油的培养基中无菌培养日本松蕈菌丝接种物。
8.形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其特征在于包括通过无菌均化日本松蕈菌丝菌落，并在液体营养培养基中无菌培养得到的菌丝来诱导日本松蕈菌丝的生长；通过用不含碳源的液体营养培养基无菌替换含有诱导生长的日本松蕈菌丝的液体营养培养基而制备日本松蕈菌丝接种物；以及在含有作为活性成分的脂肪酸酯的培养基中无菌培养日本松蕈菌丝接种物。
9.根据权利要求1至8中的任一项权利要求的形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其特征在于将含有浓度为0.2-10％(重量)的活性成分的溶液用作活性成分。
10.根据权利要求1至9中的任一项权利要求的形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其特征在于将含有用有机溶剂和蒸馏水制备的活性成分的溶液用作活性成分。
11.根据权利要求1至10中的任一项权利要求的形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其特征在于将粒积为3毫米或3毫米以下的土壤或粒积为2毫米或2毫米以下的人工培养基用作培养基。
12.根据权利要求1至11中的任一项权利要求的形成日本松蕈的人工Shiro的方法，其特征在于将活性成分以含有活性成分的溶液的状态加入培养基中，且含有活性成分的溶液与总重量的重量比为15-30％(重量)。
全文摘要
本发明涉及形成日本松蕈的人工Shiro的方法,所述方法包括在含有作为活性成分的能够控制菌丝的细胞膜通透性的物质的培养基中培养日本松蕈菌丝;本发明还涉及另一种形成日本松蕈的人工Shiro的方法,所述方法包括在含有作为活性成分的能够增强菌丝的亲水性质的物质的培养基中培养日本松蕈菌丝。
文档编号A01G1/04GK1366804SQ0210285
公开日2002年9月4日 申请日期2002年1月25日 优先权日2001年1月26日
发明者铃木和夫, 亚历克西·介朗－朗盖特, 禄敏·瓦里奥 申请人:东京大学