专利名称：小麦抗赤霉病种质创制新方法
技术领域：
本发明属于植物细胞工程育种领域，具体地说，涉及小麦抗赤霉病细胞工程育种新方法。本发明设计了双层培养基、即愈伤组织培养基为上层和供菌体生长的马铃薯蔗糖下层培养基，对外植体进行抗性和突变体的筛选，从而获得抗赤霉病的小麦优质品种。
近年来，一些实验结果表明，采用细胞培养筛选小麦抗赤霉病突变体可能是很有希望的。抗病突变体细胞选择与植株水平选择相比较，具有群体大、周期短、效率高的优点，而且还可以解决缺乏抗源的病害、兼抗多种病害等难题。目前，用培养细胞进行抗病突变体筛选的实验体系，主要包括活菌接种选择体系、利用温度敏感型病原接种选择、原位筛选法、无选择压力法选择和抗毒素筛选体系。在这些体系中，抗毒素细胞选择体系较为成熟，只是在一些具体的技术参数上有待完善；另外，选择体系的技术思路和原始材料的选择尚有革新的空间。
中国科学院遗传研究所长期从事小麦核质杂种育种新技术研究，在创制和研究异源细胞质小麦的遗传变异过程中，采用田间植株麦穗单花定位注射接种法和室内离体麦穗接种鉴定技术，发现偏凸山羊草和粗厚山羊草细胞质能诱发并提高部分小麦的赤霉病抗性。如粗厚山羊草细胞质鉴26小麦×欧柔的杂种子一代表现为抗病，病小穗率为5.60％、穗轴侵染率为1.06％；而其反交组合欧柔×粗厚山羊草细胞质鉴26的子一代表现为中抗→中感，病小穗率为11.2％、穗轴侵染率为12.94％。偏凸山羊草细胞质小麦和节节麦细胞质小麦也有类似的研究结果。中国科学院遗传研究所是国内较早开展细胞培养筛选小麦抗赤霉病突变体研究的单位之一，是“七五”、“八五”国家攻关相关项目和“八五”、“九五”中国科学院重大项目相关课题的主要承担者之一。中国科学院遗传研究所曾与黑龙江省合江地区农科所合作，从偏凸山羊草细胞质小麦和粗厚山羊草细胞质小麦中选出抗或中抗赤霉病的新品系7个；之后，中国科学院遗传研究所又选出抗或中抗赤霉病的新品系18个，并参加了相关不同地区的抗病性鉴定。这些研究结果为细胞培养筛选小麦抗赤霉病突变体研究奠定了材料和相关的技术方法基础，也为从植株个体和群体水平鉴定抗赤霉病突变体材料奠定了必要的技术方法基础。本发明的目的是建立以偏凸山羊草细胞质小麦和粗厚山羊草细胞质小麦为材料、采用抗病原菌毒素细胞选择技术，高效筛选小麦抗赤霉病突变体和育种材料的新方法。
用生物测定法鉴定供用毒素液的毒性强弱以小麦发芽种子在高压灭菌毒素液和活菌毒素液中(设置无毒素液对照)胚根生长、胚芽生长的抑制率为参数，确定不同赤霉病菌株毒素的毒性强弱，确定及用于毒素筛选(诱导、分化、绿苗)的最佳菌种和毒素溶液。如发芽力正常的晋2148小麦品种的种子置于不同菌种的毒素液中发芽时，菌株M-10和SF-1的毒素液完全抑制了种子发芽和根生长；菌株76F17的毒素液虽然对种子发芽、生根也有抑制作用，但毒性明显较弱，约有50％种子的芽和根可以不同程度的生长。
2、以甲基硫菌灵和多菌灵为抑菌剂。根据抑菌剂的毒性和既能有效抑制赤霉菌菌丝体生长、又不影响愈伤组织的诱导发生，45-55mg/L的多菌灵为首选。
3、愈伤组织诱导培养基为MS+2mg/L 2，4-D。培养基中添加毒素液的体积比例为25％、30％、50％、70％，分化培养基和壮苗培养基中都补加毒素液。双层培养基的下层培养基为马铃薯、蔗糖培养基，在无菌条件下接种赤霉病菌丝体，25℃恒温培养24-72小时；上层培养基为MS+2mg/L 2，4-D+抑菌剂，加入时的温度为45℃。配置好后放入4℃冰箱保存，72小时后用于实验，包括用于赤霉病菌株培养和用于愈伤组织的诱导、分化的培养基外植体接种。
4、选择幼穗、幼胚为接种的外植体。所取幼穗长5-10mm，在室内剥去老叶、仅留一片心叶，用70％酒精消毒1分钟、01％升汞消毒5分钟，将幼穗切成3mm长小段接种于(上层)培养基。幼胚取自幼嫩种子，用70％酒精消毒1分钟、01％升汞消毒8分钟，剥出幼胚、盾片朝上接种于(上层)培养基。鉴于幼穗对毒素较敏感，更适合于作离体抗性鉴定和筛选的培养材料。
5、根据赤霉菌毒素对愈伤组织诱导、生长、存活、分化的抑制作用参数，抗性的最佳鉴定时间和突变体的最佳筛选期确定在外植体接种7-14天以后。
6、根据赤霉菌毒素对植株分化的影响(以毒素培养基上愈伤组织分化率和绿苗率为参数)，确定30％-50％的毒素浓度为适宜的筛选浓度。
7、细胞水平抗性鉴定(毒素培养基上愈伤组织的诱导率、分化率)与植株水平鉴定(麦穗单花定位注射接种鉴定--离体室内接种鉴定、田间植株接种鉴定)的关系分析。结论为细胞水平抗毒素能力较强的材料，植株水平抗病性也较强。如在70％浓度的毒素培养基上愈伤组织的相对诱导率(与不含毒素培养基)，晋2148为53.6％、VDKP2282为92.9％；植株抗性鉴定，晋2148表现感病、VDKP2282表现为中抗水平。
8、用于植株抗赤霉病鉴定的离体麦穗单花定位注射接种技术在抽穗到始花期阶段，自剑叶节下断剪取麦穗，放入特制的接种箱内，接种禾谷镰刀菌株M-10、SF-1所培养的分生孢子液。用滴管将分生孢子液滴入麦穗中部经剪颖、标记的一朵小花内，置于25℃和高湿条件下。接种8-10天后比较病穗率和反应级。
田间植株麦穗接种鉴定技术在抽穗到始花期阶段，选取抽穗期一致的穗子，以上述离体单花定位注射方法接种，套袋喷水保湿，15天后调查病害发生情况，以病小穗率和穗轴浸染率进行评价。
发病区田间抗病鉴定根据供试材料的生态特点，参加黑龙江省佳木斯地区、湖北省襄樊地区、江苏省南京地区等地的小麦赤霉病抗病鉴定圃统一试验，采用一般通用的田间鉴定方法。本发明的优点就筛选或选择效率而言具有群体大、周期短、效率高的优点；而且还可以解决缺乏抗源的病害、兼抗多种病害等难题。
在组织培养与筛选技术上方面中国科学院遗传研究所建立了赤霉病菌株选择、毒素筛选与鉴定、用于愈伤组织诱导的外植体选择、基于最佳选择的培养时间界定和绿苗分化等完整的技术方法体系。近年来，又探索出一种更为有效的筛选鉴定技术，即双层培养与活菌毒素筛选相结合的方法，活菌毒素筛选与灭菌提取毒素筛选相比，其有效性更接近于自然浸染状态，只是这种方法要选择好抑菌剂并控制好其浓度(达到真菌生长与选择压力的协调)。
在材料选择上核质杂种小麦与一般的小麦材料不同，一部分核质组合的赤霉病抗性具有细胞质正效应；核质杂种材料的诱变频率比常规品种高。部分核质杂种小麦不但幼穗愈伤组织细胞抗赤霉病能力明显超过常规小麦品种(系)，而且在毒素培养基上愈伤组织的诱导率、分化率和绿苗率也明显提高，有利于筛选并获得抗赤霉病突变体植株。
植株的抗病性鉴定技术试验条件易于控制，简易方便，结果较稳定能较好地鉴别材料的抗病性。
实施例材料偏凸山羊草细胞质小麦VDKP系统技术抗赤霉菌毒素细胞筛选小麦抗赤霉病新种质265-1-9用于抗性细胞突变体筛选与鉴定的毒素来源于三个菌种M-10、SF-1、76F17。用于接种诱导愈伤组织的外植体为幼穗，幼穗先置于含或不含毒素的培养基(MS+2mg/L 2，4-D)上诱导愈伤组织产生，存活下来的愈伤组织连续移植到毒素浓度逐次提高的培养基上，进行继代多次细胞筛选，培养基中添加粗毒素的比例按体积计算分别为25％、30％、50％、70％；分化培养基和壮苗培养基中都补加毒素液。
以VDKP2282和VDKP2301为材料(偏凸山羊草细胞质小麦新品系)、以抗病品种苏麦3号为对照，依据幼穗在30％赤霉菌毒素培养基(MS+2mg/L 2，4-D+毒素)上的愈伤组织诱导率和存活率参数，并经两次重复细胞抗赤霉菌毒素筛选和抗病性鉴定，获得小麦抗赤霉病突变新株系265和VDKP2301-1。抗性鉴定结果为株系265的抗赤霉病反应级为1.8，略高于VDKP2282(反应级为2.01)。
以抗赤霉病新株系265和VDKP2301-1为材料、以抗病品种苏麦3号和感病品种欧柔为对照，设计毒素浓度梯度为30％→50％→70％的抗病突变体的筛选和鉴定培养基，通过幼穗愈伤组织的诱导、突变、分化和绿苗，得到一批抗病性很强的突变体，其中来源于新株系265的突变系265-1在田间鉴定试验中表现最为突出。
在温室中，从突变系265-1的群体中鉴定并选择出高抗单株265-1-9；继而进行大田的重复鉴定，得到了相同的结果接种病菌孢子后，只有接种的小穗上长出少量菌丝，不扩展到穗轴和上下部临近的小穗上；并且，株系内各单株间的抗性表现一致。
以抗病品种苏麦3号和感病品种欧柔为对照，采用离体麦穗单花定位注射接种技术3次重复鉴定抗病突变系265-1-9的抗性强弱与等级，结果见下表，突变系265-1-9的抗赤霉病能力明显超过VDKP2282和抗病对照品种苏麦3号。
权利要求
1.一种小麦抗赤霉病细胞工程育种的方法，该方法的具体步骤如下a.选择禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)或其毒素液作为细胞筛选剂；b.以甲基硫菌灵，多菌灵为抑菌剂；c.由愈伤组织细胞诱导培养基，MS+2mg/L 2，4-D和马铃薯蔗糖培养基组成的双层培养基；d.将幼穗或幼胚作为外植体接种于双层培养基上，进行抗性和突变体筛选。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的细胞筛选剂包括M-10，SF-1，76F17和病原菌的毒素液。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述的抑菌剂首选45-55mg/L的多菌灵。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述的愈伤组织细胞诱导培养基为含有病原菌毒素液的MS+2mg/L2，4-D的培养基。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述的病原体毒素液的浓度范围为30％至50％。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述的双层培养基，上层为含有毒素液、抑菌剂的愈伤组织细胞诱导培养基，下层为M-10，SF-1或76F17菌体生长时所需要的马铃薯蔗糖培养基。
7.根据权利要求1所述的方法，外植体接种于双层培养基7至14天后进行抗体和突变体的筛选。
全文摘要
本发明属于植物细胞工程育种领域，具体地说，涉及小麦抗赤霉病细胞工程育种新方法。本发明设计了双层培养基、即愈伤组织培养基为上层和供菌体生长的马铃薯蔗糖下层培养基，对外植体进行抗性和突变体的筛选，从而获得抗赤霉病的小麦优质品种。
文档编号A01H1/04GK1446455SQ0210788
公开日2003年10月8日 申请日期2002年3月26日 优先权日2002年3月26日
发明者刘春光, 侯宁, 刘根齐, 吴郁文, 张翠兰, 张炎 申请人:中国科学院遗传研究所