利用家蚕生物反应器生产有机磷农药消解酶的制作方法

专利名称：利用家蚕生物反应器生产有机磷农药消解酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和酶制剂领域，具体而言，特指用家蚕生物反应器生产有机磷农药消解酶的方法，通过这种方法可以大量、廉价地生产有机磷农药消解酶，用于水果、蔬菜及其他农产品的残留农药的酶法降解、无农药污染农产品的生产，也可用于土壤、水域等环境中的残留农药分解净化。。
有机磷农药均具有抑制人体乙酰胆碱酯酶的功能，对人均存在着程度不同的毒性，急性中毒可引起人肌肉痉挛、瞳孔收缩、呼吸困难直至死亡(陈茹玉等，有机磷农药化学，上海科学技术出版社，1995)。残留在蔬菜、水果等食品上的低剂量有机磷农药对人可产生慢性毒性，会诱导多发性神经病、中风等。
有机磷消解酶(Organophosphorus acid hydrolase，EC 3.1.8.2)可降解有机磷农药分子而使其脱毒。由于各种有机磷农药都有类似的结构，只是取代基不同，所以一种有机磷消解酶往往可降解多种有机磷农药。有机磷消解酶目前已被公认为是净化农药污染的最有潜力的新方法(虞云龙等，环境科学进展，Vol.4，No.3，28～36，1996)。多种微生物都能产生有机磷消解酶，如假单胞菌、曲霉等，但在这些微生物中含量太低，难以大量生产，生产成本高昂，到目前为止国内外均还没有商品化生产和实际应用。
早在七十年代就发现有些土壤微生物对农药具有降解作用，目前发现的农药降解微生物包括细菌(Munnecke，Appl.Microbiol.，Vol.28，No.2，p212～217，1974；Brown，Soil Biol.Biochem.，Vol.12，p105～112，1979；)、真菌(Bujacz，Appl.Environ.Microbiol.，Vol.61，No.8，p2905～2910，1995；Omar，Biodegradation，Vol.9，p327～336，1998)、放线菌和藻类，细菌中包括假单胞菌、节细菌、黄杆菌等二十余种，真菌中有曲霉、青霉、木霉等。进一步研究发现这些微生物之所以能降解有机磷农药是因为它们能分泌一种能水解磷酸酯键的酶(有机磷消解酶)。八十年代Munnecke等(J.Agric.Food Chem.，Vol48，No.1，p105～111，1980)发现有机磷消解酶比产生这类酶的微生物菌体更能忍受异常环境条件，如来源于假单胞菌的消解酶在10％的无机盐、1％的有机溶剂、50℃下都能保持高活性，而该酶的产生菌在同样的条件下却不能生长。而且，酶的降解效果远远胜于微生物本身，特别是对低浓度的农药。因此，人们的思路从应用微生物菌体净化农药污染转向利用有机磷消解酶。
目前有机磷消解酶的研究已成为世界性的研究热点之一。随着分子生物学的发展，对机磷消解酶的研究目前已进入到分子水平，数种微生物来源的机磷消解酶已得到分离纯化并进行了较深入的生理生化研究，如Munnecke等(J.Agric.Food Chem.，Vol48，No.1，p105～111，1980)分离到的机磷消解酶对试验用的甲基对硫磷、二嗪农、毒死蜱等7种有机磷农药均能有效降解，在22℃时降解效率比化学降解快1000～2450倍，且该酶不为农药及农药制剂中溶剂所抑制，对环境条件有较宽的忍受范围。
应用有机磷消解酶就必须解决一个关键性的问题—如何工业化廉价生产有机磷消解酶。有机磷消解酶在原始天然菌株中含量太低，难以大量生产、生产成本高昂。这也是目前世界上还未有商品化生产的有机磷消解酶产品及在生产实践上推广应用的关键原因。近年来，随着基因工程技术的飞速发展，人们意识到利用基因工程技术是解决这一问题最有效的方法，具体思路是通过基因工程的手段克隆有机磷消解酶编码基因，然后在重组生物反应器高效表达有机磷消解酶基因，使有机磷消解酶的单位表达量比原始天然菌株成百上千倍的提高，从而大幅度降低生产成本。
到目前为止，仅从细菌中分离到了3个有机磷消解酶的编码基因，一种是来源于假单胞菌(Mcdaniel，J Bacterol.，Vol170，No.5，p2306～11，1988；Sendar，Bio/technol.，Vol.7，p1151～55，1989)或黄杆菌(Mulbry，JBacteriol，Vol.171，No.12，p6740～46，1989)的消解酶基因opd，在这两种菌中，opd的序列是一样的(Chaudhry，Appl.Environ.Microbiol.Vol.54，No.2，p288～293，1988)。另一个是来源于节杆菌(Arthrobacter sp.)的消解酶基因oph(Ohshiro，J.Biosc.Bioeng.，Vol.57，No.4，p531～534，1999)。还有一个是来源于单胞菌(Alteromonas sp.)的有机磷消解酶基因oph(Cheng，Appl.Environ.Microbiol.，Vol.62，No.5，p1636～41，1996)。2001年我们从假单胞菌分离到一个有机磷农药消解酶基因opdA(中国发明专利，申请号01110725.1)，它与报道的来源于假单胞菌的opd在核苷酸序列上的同源性仅有76.5％，氨基酸序列同源性仅有83.6％，为一新的有机磷农药消解酶基因。
1985年Sendar等(Bio/technol.，Vol.3，p567～568，1985)首次尝试在大肠杆菌中表达有机磷消解酶，表达产物虽具有生物学活性，但表达量还未到原始天然菌株的十分之一。随后Sendar等(1989)将此酶基因前的SD序列及信号肽编码序列去除后再在大肠杆菌中表达，使表达量有所提高(Sendar，Bio/technol.，Vol.7，p1151～55，1989)。九十年代许多科学家都进行了机磷消解酶编码基因的克隆和高效表达的工作，如Cheng等(Cheng，Appl.Environ.Microbiol.，Vol.62，No.5，p1636～41，1996)从Alteromonassp.中克隆到一个机磷消解酶编码基因并在大肠杆菌中尝试表达，Ohshiro等(Ohshiro，J.Biosc.Bioeng.，Vol.57，No.4，p531～534，1999)从Arthrobacter sp.B-5中分离到机磷消解酶基因oph，也在大肠杆菌中进行了表达。以上的这些表达研究，从总体上看，其表达水平还较低，只比原始天然菌株高十几倍，一般都不超过100□g酶蛋白/mL发酵液，还达不到廉价生产机磷消解酶的要求，但却证实了利用基因工程手段来提高有机磷消解酶的表达、批量生产这一途径的有效性。
2001年我们曾在毕赤酵母中高效表达了来源于假单胞菌的有机磷农药消解酶基因opdA，其表达量达到5mg酶蛋白/mL发酵液，使有机磷农药消解酶的生产首次成为可能(中国发明专利，申请号01110725.1)发明简述本发明的目的是提供一种利用杆状病毒表达系统，尤其是家蚕(Bm)-家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统高效表达、生产有机磷消解酶的方法以期达到有机磷消解酶的大量、廉价生产，广泛应用于去除农产品的农药残留及环境中的农药残留。
本发明涉及一种利用重组杆状病毒(Baculovirus)在昆虫体内表达、生产有机磷消解酶的方法，包括将广适性、高比活基因opdA与杆状病毒载体进行重组；用重组病毒载体感染昆虫宿主；增减被感染的昆虫宿主使其进行有机磷农药消解酶的表达，表达量达到2mg/mL血淋巴液。
杆状病毒包括BmNPV、AcMNPV、ApNPV、BsSNPV、CfMNPV、EoSNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV、TnNPV等，昆虫宿主包括家蚕(Bombyx mori)、野蚕(Bombyxmandarina)、蓖麻蚕(Philosamia cynthia ricim)、樟蚕(Dictyoploca japanica)、樗蚕(Philosamia cynthia pryeri)、柞蚕(Antheraea pernyi)、日本柞蚕(Antheraea yamamai)、野天蚕(Antheraea polyphymus)、苜蓿尺蠖(Atographacaliforica)、茶尺蠖(Ectropis obliqua)、甘兰夜蛾(Mamestra brassicae)、斜纹夜蛾(Spodoptera littoralis)、秋粘虫(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、行军虫(Thaumetopoea wilkinsoni)、棉铃虫(Heliothisarmigera)、美国棉铃虫(Heliothis zea)、烟青虫(Heliothis assulta)、烟草夜蛾(Heliothis virescens)、东方粘虫(Pseudaletia separata)、舞毒蛾(Lymantriadispar)等。
杆状病毒表达系统这一生物反应器是八十年代建立起来的。自从1983年首次利用杆状病毒表达系统高效表达了人的α-干扰素以来(Smith，Mol.Cell Biol.，32156-2165，1983)，已有数十个外源基因得到了高效表达，仅我国就有α-干扰素(杨冠珍等，生物化学与生物物理学报，22355-361，1990)、慈菇蛋白酶抑制剂(季平等，蚕业科学，21223-227，1995)、马立克氏病毒糖蛋白B(肖庆利等，蚕业科学，23104-108，1997)等多种。利用此系统来生产消解酶的优点在于1.这一表达系统的表达效率极高，产量可达10毫克级/虫的水平，亦即每头蚕3000U以上。因而可大大降低消解酶的生产成本并使消解酶大规模生产成为可能；2.这一表达系统为真核表达系统，其表达的外源蛋白质可进行翻译后修饰，使其在生化性质和生物活性等与天然产品相似，这为表达出的消解酶具有正常的生物学活性提供了保证。3.用此系统生产的消解酶无需纯化，只需将表达消解酶的幼虫或蛹初步加工后直接做为饲料添加剂，大大降低了生产成本。目前，杆状病毒表达系统，尤其是其中的家蚕(Bm)-家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统是世界上最具有商业开发价值的真核生物个体表达系统之一。
采用杆状病毒表达系统，应用昆虫幼虫及蛹作为生物反应器大规模生产消解酶，在单胃动物及鱼的饲料或食品中应用，这一发明为国内外首次。本发明中优化的杆状病毒表达系统为家蚕(Bm)-家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统，通过基因重组，将消解酶基因opdA重组进家蚕杆状病毒BmNPV，获得重组家蚕杆状病毒rBmNPV(opd)，使携带消解酶基因的rBmNPV(opd)在不同发育阶段的家蚕(幼虫、蛹等)中繁殖，应用家蚕作为宿主的生物反应器生产消解酶。同样，利用别的杆状病毒表达系统，如AcMNPV、ApNPV、BsSNPV、CfMNPV、EoSNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV、TnNPV等也可按同样的方法表达生产消解酶。
用基因重组技术，将来源于各种微生物的消解酶基因构建到各种杆状病毒运载载体(如AcRP23-lacZ，AcRP6-SC，AcUW1-lacZ，BacPAK6，Bac toPac，Bacmid，BlueBacII(pETL)，p2Bac，p2Blue，p89B310，pAc360、373，pAcAB3、4，pAcAS3，pAcC129、C4、DZ1，pAcGP67，pAcIE1，pAcJP1，pAcMLF2、7、8，pAcMP1、2，pAcRP23、25，pAcRW4，pAcsMAG，pAcUW1、21、2A、2B、3、31、41、42、43、51，pAcVC2、3，pAcYM1，pAcJcC5，pBacl、2，pBlueBacIII，pBlueBacHis，pEV55、mXIV，pIEINeo，pJVETL，pJVNhe1，pJVP10，pJVrsMAG，pMBac，pP10，pPAK1，pPBac，pSHONEX1.1，pSYN XIV VI+，pSYNVI+wp，pSYNXIV VI-，pVL1391、1392、1393，pVL941、945、985，pVTBac，pBM030，pUAC-5)上，使消解酶基因在多角体启动子、p10启动子或别的病毒和真核生物的强启动子的控制之下，通过体内或体外(in vivo/in vitro)重组，将有机磷消解酶基因opdA整合到杆状病毒的基因组上，得到重组病毒。重组病毒可通过经口食下或采用各种手段透过表皮感染1-5龄(最优时间为四或五龄)的昆虫幼虫或蛹体(最优时间为1-2天的早期嫩蛹)，表达生产消解酶。本发明中最优化的方案是将有机磷农药消解酶基因opdA，插入到运载载体pVL1393上，再通过体内重组将opdA基因转移到家蚕杆状病毒亲本株BmNPV-ZJ8的基因组上，替代基因组上的Polyhedrin基因，通过空斑筛选技术和PCR检测技术，获得携带opdA的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(opd)。将其感染家蚕细胞系或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹，可大量繁殖rBmNPV(opd)。当rBmNPV(opd)在蚕体内复制时，opdA在多角体蛋白基因(polh)启动子控制下表达，产生有机磷农药消解酶。在感染3-6天(最佳为5天)后收集含有机磷农药消解酶的家蚕幼虫或蛹的体液(或整体匀浆)，杀灭感染性病原后，喷雾干燥后便得到有机磷农药消解酶制剂。
获得重组病毒rBmNPV(opd)感染家蚕幼虫或蛹体后，opdA基因得到高表达，每毫升蚕血淋巴可产生2毫克以上的OPDA蛋白，一条蚕(或蛹)产生的酶活力约为7万单位以上。


图1、重组运载载体BacPAK(opd)的构建图2、opdA基因在家蚕幼虫和蚕蛹表达的蛋白SDS-PAGE分析Lane1蛋白标准分子量Lane2亲本株Bm-BacPAK6病毒感染家蚕幼虫Lane3rBmNPV(opd)病毒感染家蚕幼虫
2.酶与试剂盒限制性内切酶、连接酶为Boehringer公司产品。
3.生化试剂IPTG、X-Gal、SDS及植酸钠为Sigma公司产品。过硫酸铵、TEMED、丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺为Promega公司产品。Lipofectin、低融点琼脂糖(LMP)、Nick Translation试剂盒、T4DNA连接酶、RNA酶、Proteinase K、家蚕细胞培养基TC-100、胎牛血清及其它试剂购于GIBCO BRL公司；4.培养基大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。家蚕细胞株BmN培养液为TC-100。
实验二本实验说明携带有机磷农药消解酶基因的载体pYY-01的DNA制备程序。将含有pYY-01质粒的大肠杆菌划线接种于含100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基上，37℃培养16小时，挑取单个菌落转接于3mL含100μg/mL Amp的LB培养基中，37℃振荡培养16小时(200转/分钟)，吸取1mL已活化的大肠杆菌加到100mL含100ug/mLAmp的LB培养基中，37℃继续振荡培养16小时(200转/分钟)，冰浴15分钟，离心(5000rpm×5min)收集菌体，菌体悬浮于3mL溶液I[50mM葡萄糖、10mM EDTA、25mMTris-HCl(pH8.0)、5mg溶菌酶]中，冰上放置20分钟，加入6mL溶液II(0.2NNaOH、0.1％SDS)，缓慢倒转数次使混匀，冰上放置10分钟，再加入4.5mL溶液III[3M NaAc(pH4.8)]，小心混匀，冰上放置30分钟，离心(12000rpm×20min)，收集上清液转入另一管中，加入2.5倍体积的95％乙醇，-20℃放置2小时后，离心(12000rpm×15min)，收集沉淀质粒DNA，冷冻干燥后沉淀用1mL TE[10mM Tris-HCl，1mM EDTA(pH8.0)]溶解，加入10μl RNA酶(10mg/mL)，37℃放置15～30分钟，上Sepharose 2B柱纯化质粒DNA，收集第一峰，用酚、氯仿各抽提一次，取上清液，加入1/10体积的3M NaAc(pH6.5)，并加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置2小时以上，离心(12000rpm×15min)沉淀质粒DNA，用75％乙醇洗沉淀一次，真空干燥，DNA溶于200μl TE中，-20℃保存备用。
实验三本实验说明运载质粒pBacPAK6 DNA的制备程序。含有运载质粒pBacPAK6的大肠杆菌在LB培养基中培养过夜后提取质粒DNA，方法同实验二。
实验四本实验说明家蚕核多角体病毒亲本株的繁殖扩增及病毒DNA的制备程序。按TC-100产品说明配制1×TC-100，用2N NaOH调至pH6.22，过滤除菌后的培养液补加10％胎牛血清，以此为培养液，27±1℃培养家蚕细胞BmN。在T-100培养液中培养约50mL的家蚕细胞(细胞个数约为107～108)，用家蚕核多角体病毒亲本株Bm-BacPAK6感染对数生长期的细胞，感染复数为1,27±1℃培养，3-4天后收集病毒感染液，离心(3000rpm×20min)，除去沉淀，上清液离心(25000rpm×60min)，除去上清，用1mL病毒DNA抽提液(1000mL中含Tris 12.1g、EDTA 33.6g、KCl 14.1g，pH7.5)悬浮病毒粒子沉淀，转移至1.5mL的离心管中，加入Proteinase K至终浓度为50μg/mL，50℃保温2小时，再加35％的Sarkorsel至终浓度为1％，继续50℃保温2小时，分别用等体积的苯酚、苯酚∶氯仿(1∶1)、氯仿依次抽提，将上层水相转移到一个新管中，添加1/10体积的3M NaAc，加2倍体积无水乙醇，-20℃放2小时，5000rpm离心10min，沉淀病毒DNA，沉淀用75％乙醇洗一次，冷冻干燥，溶解在50μl TE中，放置4℃保存备用。
实验五本实验说明病毒亲本株Bm-BacPAK6的DNA的线性化程序。取20μl病毒DNA(约为1～2μg)，2μl限制性内切酶Cvn I，3μl 10×酶切缓冲液，用无菌水补至体积30μl，37℃保温3～4小时，电泳检查表明酶切作用完全后，将酶切反应混合物放置65℃下10min，使酶完全失活，然后于4℃保存备用。
实验六本实验说明重组运载载体pBacPAK(opd)的构建程序(图1)。1.有机磷农药消解酶基因opdA的DNA片段的制备取备用的质粒pYY-01的DNA 30～50μg，10×内切酶EcoRI的缓冲液10μl，100unit的EcoRI，无菌双蒸馏水补至总体积100μl，37℃反应2小时，加样至1％的低融点琼脂糖凝胶上，在4℃条件下50V电泳60分钟，在紫外灯下切取含phyA2 DNA片段的凝胶，加1/10体积的3M NaCl，68℃加热10分钟溶解凝胶，37℃下苯酚抽提，离心(12000rpm×5min)，上清液再用苯酚、氯仿∶异戊醇(24∶1)依次抽提一次，加1/10体积的3M NaAc(pH6.5)，再加2倍体积的无水乙醇，-20℃放置2小时以上，离心(12000rpm×15min)，沉淀用75％乙醇洗一次，真空干燥，加25μl TE溶解，-20℃保存备用。2.运载质粒pBacPAK6的酶切取运载质粒DNA 2μg，10×内切酶EcoRI的缓冲液2μl，4U的EcoRI，无菌双蒸馏水补至总体积20μl，37℃反应1小时，取5μl加样至1％的琼脂糖凝胶上，电压100V电泳20分钟，紫外灯下检查酶切反应结果，酶切完全后，65℃水浴10分钟将酶失活，保存备用。3.opdA基因与运载质粒pBacPAK6的连接取步骤1中制备的opdA基因片段6μl，步骤2中制备的运载质粒pBacPAK6 DNA 1μl，5×T4DNA连接缓冲液2μl，T4连接酶1μl，无菌双蒸馏水补至总体积10μl，12～14℃连接反应过夜。4.大肠杆菌感受态细胞的制备用灭菌的牙签挑选大肠杆菌TG1单菌落，接种于3mL的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，取100μl过夜培养物接种到3mL LB培养基中，37℃振荡培养2～2.5小时，使O.D值在0.6左右，离心(5000rpm×5min)收集菌体，将菌体悬浮于预冷的800μl 100mM CaCl2中，然后冰浴30分钟，离心(5000rpm×5min)弃上清液，再加入200μl 100mM CaCl2，轻轻击打管壁，使沉淀悬浮并混合均匀，冰上放4～24小时用于转化。5.大肠杆菌的遗传转化取步骤三中制备的连接混合物5μl，加到200μl感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟，37℃热击5分钟，迅速置于冰上1～2分钟，加入已温育至37℃的LB培养基500μl，37℃培养1小时，取100-150μl涂布于含50μg/mLAmp的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜。6.携带重组运载质粒的阳性克隆子的鉴定从转化的LB平板上挑取单个菌落，按实验二中的方法制备质粒DNA，应用BamHI和EcoRI双酶切下插入的opdA基因，电泳后出现约1.1Kb的DNA条带的质粒为重组运载质粒，携带重组运载质粒的克隆子为阳性克隆子。制备的重组运载载体pBacPAK(opd)的DNA于-20℃保存备用。
实验七本实验说明重组家蚕杆状病毒的构建程序。1.重组杆状病毒rBmNPV(opd)的构建1μg线性化的家蚕杆状病毒亲本株Bm-BacPAK6 DNA和2μg的重组运载质粒pBacPAK6(opd)DNA混合，再加入30μl的Lipofectin，用无菌双蒸馏水补足到60μl，轻轻混合均匀，静置15分钟，加到含有1×106的BmN细胞的25cm2玻瓶中进行共转染，然后除去瓶中含有胎牛血清的1×TC-100培养液，用不含胎牛血清1×TC-100培养液洗3次，后加入3mL不含胎牛血清的1×TC-100培养液，将此混合物逐滴加入另一个培养瓶中，27℃培养4小时后补加3mL无胎牛血清的1×TC-100培养液和600μl的胎牛血清，27℃培养4～5天，收集上清液用于重组家蚕杆状病毒rBmNPV(opd)的筛选纯化；2.重组家蚕杆状病毒rBmNPV(opd)筛选和纯化家蚕核多角体病毒亲本株上携带LacZ基因，在侵染昆虫细胞后此基因的表达产物能将底物X-gal分解而使被侵染的细胞所形成的空斑呈兰色，外源基因整合到病毒基因组后将取代此基因，从而使空斑呈白色。利用这一标记可筛选到重组病毒。接种适量细胞(以可铺平平皿底部面积80％为宜)于60或35mm平皿中，待细胞贴壁后，吸去培养液，将上一步骤中得到的转染上清液按10-3、10-4、10-5的不同稀释度进行稀释，吸取1mL加入到贴壁细胞中，使其分布均匀，27℃感染1小时，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶溶化，冷到40℃左右，然后与40℃预热的2×TC-100(含20％的胎牛血清)混合均匀，再添加X-gal使其终浓度达到150μg，将此混合物滴加到平皿中(60mm平皿约加4mL，35mm平皿约加1mL)，待凝固后，27℃倒置培养4～7天，显微镜观察，将具有白色特征的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(opd)。3.重组病毒rBmNPV(opd)在家蚕细胞中的扩增将重组家蚕杆状病毒rBmNPV(opd)感染正常生长的BmN细胞，培养4天后收集上清液，上清液中即含有大量的重组病毒rBmNPV(opd)。
实验八本实验说明应用家蚕作为宿主生产有机磷农药消解酶的程序。
桑叶饲养家蚕到五龄，将蚕体表面用75％的乙醇消毒，用微量注射器分别吸取重组病毒，按每头注射106pfu病毒量(约5μl上清液)在腹节倒数第2和第3节间膜处穿刺接种重组病毒，24～25℃按常规桑叶饲养家蚕，并隔天添食氯霉素，饲养4～5天后，从蚕体中制备有机磷农药消解酶。
取化蛹后1～2天的嫩蛹，75％乙醇表皮消毒，用微量注射器分别吸取重组病毒，按每头注射106pfu病毒量(约5μl上清液)在腹节间膜处穿刺接种重组病毒，为防止细菌感染，在重组病毒液中加入10～20U/蛹的庆大霉素，24～25℃培养4～5天，从中制备表达的有机磷农药消解酶。
有机磷农药消解酶制备的具体方法如下收集幼虫和蛹的体液，或直接将蚕幼虫体和蛹体匀浆，然后经离心(10000rpm×10min)，去除沉淀和脂肪层，上清液中即含有表达的有机磷农药消解酶。上清液通过喷雾干燥干燥，制成有机磷农药消解酶制剂。
蚕幼虫体和蛹体感染重组病毒4～5天后，有机磷农药消解酶表达量达最大值，这时幼虫和蛹中的表达量分别高达2.1mg/mL血淋巴和2.6mg/mL血淋巴。表达的有机磷农药消解酶可通过蛋白凝胶电泳来证实，电泳结果(图2)显示，用重组家蚕杆状病毒感染家蚕幼虫或蚕蛹后，在38KD处出现一条特异性的有机磷农药消解酶蛋白条带，这证明opdA基因已得到了高效表达。
实验九本实验说明应用家蚕作为宿主生产的有机磷农药消解酶的酶活性测定的程序。
对感染后的幼虫和蛹血淋巴中的有机磷农药消解酶进行活性测定，测定方法为测定方法为0.1mL的酶稀释液中加入0.005mL 10mg/mL的对硫磷和0.9mL Tris-HCl缓冲液(pH8.5)，37℃保温10min，加入1mL 1％NaCO3显色，415nm测定水解产物对硝基酚含量。一个酶活性单位(U)定义为在一定条件下，每分钟释放出1μmol对硝基酚所需酶量为一个酶活性单位。结果表明，有机磷农药消解酶的表达量在重组病毒感染后48小时开始表达，到120小时时达到高峰，这时有机磷农药消解酶的表达量在幼虫和蛹中分别达到7.1×104U/mL血淋巴和7.9×104U/mL血淋巴。这一表达量较原始的有机磷农药消解酶基因来源菌株Pseudomonas sp.92高20000倍以上。
权利要求
1.一种利用重组杆状病毒在昆虫体内表达、生产有机磷农药消解酶的方法，包括将有机磷农药消解酶基因与杆状病毒载体进行重组；用重组病毒载体感染昆虫宿主；培养被感染的昆虫宿主使其进行有机磷农药消解酶表达；收集含有机磷农药消解酶的昆虫体。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的杆状病毒是BmNPV、ApNPV、BsSNPV、CfMNPV、EoSNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、S1MNPV、SeMNPV、或TeNPV。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的昆虫宿主是家蚕、野蚕、樟蚕、樗蚕、柞蚕、日本柞蚕、野天蚕、苜蓿尺蠖、茶尺蠖、甘兰夜蛾、秋粘虫、粉纹夜蛾、行军虫、棉铃虫、美国棉粘虫、烟青虫、烟草夜蛾、东方粘虫、或舞毒蛾。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的昆虫是家蚕，所述的杆状病毒是家蚕杆状病毒。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的杆状病毒运载载体AcRP23-lacZ，AcRP6-SC，AcUW1-lacZ，BacPAK6，Bac to Pac，Bacmid，BlucBacII(pETL)，p2Bac，p2Blue，p89B310，pAc360、373，pAcAB3、4，PAcAS3，pAcC129、C4、DZI，pAcGP67，pAcIE1，pAcJP1，pAcMLF2、7、8，pAcMP1、2，pAcRP23、25，pAcRW4，pAcsMAG，pAcUW1、21、2A、2B、3、31、41、42、43、51，pAcVC2、3，pAcYM1，pAcJcC5，pBacl、2，pBlueBacIII，pBlueBacHis，pEV55、mXIV，pIEINeo，pJVETL，pJVNhel，pJVP10，pJVrsMAG，pMBac，pP10，pPAK1，pPBac，pSHONEX 1.1，pSYN XIV VI+，pSYNVI+wp，pSYNXIV VI-，pVL1391、1392、1393、pVL941、945、985，pVTBac，pBM030，或pUAC-5。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重组病毒是通过口食或透过表皮来感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蛹体为1-2天的早期嫩蛹。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的有机磷农药消解酶是由有机磷农药消解酶基因opdA编码的(中国发明专利，申请号011110725.1)；所述的运载载体是BacPAK6；所述的重组是指将有机磷农药消解酶基因opdA移到家蚕杆状病毒亲本株Bm-BacPAK6的基因组上，替代病毒基因组上的LacZ基因，获得携带opdA的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(opd)；所述感染是将得到的重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹；在感染3-6天后收集含有机磷农药消解酶的家蚕幼虫或蛹的体液或组织匀浆。
9.一种被含有有机磷农药消解酶基因的重组杆状病毒载体感染并表达有机磷农药消解酶的昆虫。
10.按照权利要求9所述的昆虫，其特征在于，所述的昆虫是家蚕。
11.一种有机磷农药消解酶，用于环境保护、水果、蔬菜及其他农产品的农药残留物的酶法降解，无农药污染农产品的生产。其特征在于，它含有权利要求9和10所述的昆虫体。
全文摘要
本发明提供一种利用重组杆状病毒在家蚕体内表达、生产有机磷农药消解酶OPDA的方法，包括有机磷农药消解酶基因与杆状病毒载体进行重组；用重组病毒载体感染宿主家蚕；被感染的家蚕宿主进行有机磷农药消解酶的表达；收集含有机磷农药消解酶的家蚕幼虫或蛹的体液或匀浆进行加工制备酶制剂。通过这种方法可以大量、廉价地生产有机磷农药消解酶，用于水果、蔬菜及其他农产品的残留农药的酶法降解、无农药污染农产品的生产，也可用于土壤、水域等环境中的残留农药分解净化。
文档编号A01K67/04GK1456665SQ0211923
公开日2003年11月19日 申请日期2002年5月10日 优先权日2002年5月10日
发明者孙跃军, 张志芳, 姚斌, 孙齐军 申请人:安徽固源生物工程有限责任公司