一种甲拌磷农药半抗原的制备方法及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种增加甲拌磷农药抗原性的方法。所述甲拌磷为0，0-二乙基-S-[(乙硫基)甲基]二硫代磷酸酯，CAS号：298-02-2；所述半抗原为甲拌磷农药的羟化物与酰氯化1，8-萘啶类化合物结合后的产物。本发明针甲拌磷这一种小分子机磷农药提供了一系列半抗原，所述半抗原在甲拌磷氧原子上分别引入了不同的酰氯化1，8-萘啶类化合物，使它们更便于连接载体蛋白，增加甲拌磷农药的抗原性，使甲拌磷农药抗原制备成功率更高，本发明为抗甲拌磷农药抗体制备和快速检测产品开发提供了技术基础。
【专利说明】
一种甲拌磷农药半抗原的制备方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及免疫分析领域，具体涉及一种甲拌磷农药半抗原制备优化方法。
【背景技术】
[0002] 有机磷农药类是含有c-ρ键或C-0-P，C-S-P，C-N-P键的有机化合物，正式商品有 几十种，如对硫磷、氧乐果、敌敌畏、马拉硫磷、辛硫磷、甲拌磷、久效磷、甲胺磷、敌百虫、乐 果、甲基1605、谷硫磷等。大部分有机磷农药不溶于水，而溶于有机溶剂，在中性和酸性条件 下稳定，不易水解，在碱性条件下易水解而失效。有机磷农药（有机磷酸酯类农药）在体内 与胆碱酯酶形成磷酰化胆碱酯酶，胆碱酯酶活性受抑制，使酶不能起催化乙酰胆碱水解的 作用，导致组织中乙酰胆碱过量蓄积，使胆碱能神经过度兴奋，引起毒蕈碱样、烟碱样和中 枢神经系统症状。磷酰化胆碱酯酶一般约经48小时即"老化"，不易复能。
[0003] 当人们食用了农药残留超标的蔬菜以后，会直接危及人体的神经系统和肝、肾等 重要器官。有的人农药中毒后出现严重头晕、头痛、腹痛、食欲减退、视觉模糊、恶心、呕吐、 多汗等症状，重度中毒者还会出现胸有挤压感、肌肉颤抖等，严重的可出现脉搏、呼吸加快 及潜昏迷症状。而慢性中毒没有上述明显症状，反而更加深了人们对残留农药的麻痹大意。 因为残留农药会在人体内蓄积，超过一定的量度后将导致一些慢性疾病，如肌肉麻木、咳嗽 等，甚至会诱发癌症、心血管疾病和糖尿病等，对孕妇来说，则会影响胎儿的发育，甚至会导 致胎儿的畸形。而且最新研究表明，农药残留长期作用于人体，还有可能导致基因突变。农 药残留在人体内积蓄后容易引起慢性中毒，出现神经功能紊乱、精神错乱、皮肤刺激等症 状，从长期看，餐桌污染会对经济和民族发展带来危害。
[0004] 甲拌磷是一种高毒、高效、广谱的内吸性杀虫杀螨剂，有触杀、胃毒、熏蒸作用，对 刺吸式口器和咀嚼式口器害虫都有效，如蚜虫、飞虱、蓟马、红蜘蛛、潜叶蝇、拟步行甲、象 甲、跳甲、蝼蛄、金针虫等。对鳞翅目幼虫药效较差。甲拌磷进入植物体后，受植物代谢的影 响而转化成毒性更大的氧化物（亚砜、砜），昆虫取食后体内神经组织中的乙酰胆碱酯酶的 活性受到抑制，从而破坏了正常的神经冲动传导，而导致中毒，直至死亡。由于甲拌磷及其 代谢物形成的更毒的氧化物，在植物体内能保持较长的时间（约1-2个月，甚至更长），因此 药效期长，但也要特别注意残留毒性问题。
[0005] 因此，农业部在2002年发布第199号公告，明文规定，严禁在蔬菜、果树、烟草、茶 叶等农作物上使用。但是，由于受传统使用农药习惯以及甲拌磷杀灭害虫的超强能力，不少 地方仍在大量销售使用甲拌磷农药。迄今为止，甲拌磷农药的检测方法主要有高效液相色 谱法、气相色谱法及免疫法等。但这些方法有前处理过程繁琐、分析时间长、仪器及药品成 本高等不足。因此，建立简单、快速且灵敏度高的甲拌磷农药检测方法逐渐成为研究重点。 目前国内外主要检测方法有光谱法、色谱法、酶抑制法、免疫法、生物芯片技术等。其中免疫 检测因其灵敏度高，专一性强，检测时间短，适合基层应用等优点，倍受重视。
[0006] 免疫检测就是利用机体接触"抗原性异物"或"异己分子"所发生的特异性生理反 应产生抗体为基本原理进行设计的一种方法。抗体对相应的抗原具有识别和结合的双重功 能，可与抗原选择性地结合，选择性强，灵敏度高，所以免疫学方法是一种简便、快速、灵敏、 特异的生物检测方法。抗原是引起机体发生免疫应答的最基本物质，但是有机磷属小分子 化合物，只能作为半抗原。如果让机体产生抗有机磷作用的抗体，就必须将有机磷分子与大 分子蛋白质结合后制备成具有抗原性的物质，再免疫动物，让动物机体产生具有特异性的 抗体。但是在实际抗原制作过程中，主要有二大难题：一是甲拌磷是属于有机磷中的二乙氧 基硫代磷酸酯类中的一种，并且是分子量最小的一种，如果不能很好的设计一个抗原性强， 专一性高的半抗原，即使成功免疫动物，所得到的抗体也会缺乏针对性，不对特定种类定量 检测。2005年，刘金贤等公开了 "用于检测有机磷农药残留的免疫抗体及其应用"。该发 明以二乙基磷酸乙酸为半抗原，没有进行结构改造即可与蛋白质偶联用于免疫动物，从而 制备的抗体可以检测多种有机磷农药，但可以检测的农药没有针对性，检测限差异很大。可 见本领域作为半抗原设计这个关键课题还没有很好解决。二是半抗原与蛋白质的偶联，增 加与蛋白质偶联数量，可以增加动物对目标半抗原的免疫应答，使更多免疫细胞成为阳性 细胞，减少后期融合细胞筛选工作量，提高成功率。
[0007] 1，8_萘啶类化合物就以其优良的性质以及在材料科学、生命科学等领域的巨大 应用潜力引起了广大科学工作者的关注。在1，8_萘啶中，两个配位氮原子之间的距离为 2. 307A，能较好的满足高配位刚性的要求。正是由于其配位原子氮的位置的特殊性，使1， 8-萘啶类化合物成为具有良好的配位作用及鳌合效应的双齿配体，其配合物也呈现出丰富 的结构和多样的化学性质。随着对1，8-萘啶的深入研究，人们在1，8-萘啶的基础上又合 成了许多以其为基体的1，8_萘啶类衍生物。这极大的丰富了 1，8_萘啶类化合物的应用领 域，为其实现在多学科交叉领域的研究与应用提供了可能。
[0008] 我们实验室的多个团队中，其中一个团队有多年合成1，8_萘啶类化合物的经验， 合成了大量1，8_萘啶类衍生物，另一团队主要从事快速检测试剂盒的开发与利用，在制备 农药半抗原过程中，需要一些多元杂环化合物，自然想到了用1，8萘啶来制作半抗原，结果 制备的半抗原比文献报道的效果更好。
【发明内容】
[0009] -、发明简介
[0010] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一系列可用于甲拌磷农药检测的半 抗原，所述半抗原偶联载体蛋白后能使机体产生效价高，能专一识别甲拌磷农药的特异抗 体。
[0011] 本发明的另一个目的是提供所述半抗原的制备方法。
[0012] 本发明还有一个目的是提供所述半抗原的应用。
[0013] 二、技术方案
[0014] 提供一类半抗原，为羟化甲拌磷与酰氯化1，8_萘啶类化合物结合后的产物。
[0015] 羟化甲拌磷具有如下结构式
[0016]
[0017] 上述酰氯化1，8-萘啶类化合物优先具有式A(I)、A(II)、A(III)、A(IV)、A(V)、 A (VI)、A (VII)、A (VIII)所示结构式的物质：
[0018]
[0019] 采用上述结构式A(I)-A(VIII)所示结构式的物质与羟化甲拌磷得到的半抗原 (0P)的结构式分别对应为 B (I)、B (II)、B (III)、B (IV)、B (V)、B (VI)、B (VII)、B (VIII)，
[0020]
[0022] 本发明同时提供了所述半抗原的制备方法是将羟化甲拌磷和酰氯化1，8-萘啶类 化合物在室温条件下，加入三乙胺，于丙酮中进行反应，生成目标标半抗原。
[0023] 本发明提供的半抗原偶连载体蛋白后，能使机体产生效价高，特异性好的针对含 甲拌磷有机磷农药的抗体。
[0024] 与现有技术相比，本发明具有如下特点：
[0025] 本发明针对甲拌磷有机磷农药的特有结构所提供一系列半抗原，半抗原在分子结 构，立体化学和电子分布上与甲拌磷结构十分相似。半抗原结构中引入萘啶平面，使之与蛋 白质偶联后的全抗原更易于暴露在蛋白质载体外面，因而更易于产生理想的抗体。此半抗 原对偶连载体蛋白没有特别选择，普通血清蛋白质就可以偶连成功并能在后期抗体制备中 获得效价高、特异性好的针对抗体。
【具体实施方式】：
[0026] 实施方案1半抗原B(I)的制备方法
[0027] 在50mL反应瓶中放入P5S211. lg，然后逐滴滴入无水乙醇9. 66g，反应物由浆状变 成悬浮液，温度逐步上升，并放出H2S。当温度上升至80°C左右时，控制滴加速度，水浴恒温， 搅拌1小时，待粉末全部溶解，停止反应。蒸馏水萃取3次，弃有机相，得水相硫化物。在反 应瓶中放入硫化物，在室温下，滴加10g30 %甲醛水溶液，磁力搅拌20min后，加入7. 9g2-巯 基乙醇控制60°C，反应5小时。浓缩后过硅胶层析柱，收集样品，完成纯化得12g，得率31 %。 称取其中〇. 552g(2mmol)，溶解于10ml丙酮中，加入4ml三乙胺，加入0. 576g(4mmol)2_酰 氯1，8-萘啶，室温，搅拌5小时。反应结束，旋转蒸发浓缩，得到的粗产物，加入适量谊和碳 酸氢钠溶液，搅拌30min，用乙酸乙酯萃取，水层用6M盐酸调pH到3,析出沉淀，得半抗原 0· 338g。得率 35%。
[0028] 其它半抗原制备方法与半抗原B (I)制备方法相同。
[0029] 实施方案2免疫抗原制备（以半抗原B (I)为例）
[0030] 取50mg半抗原B(I)溶于lmL N，N-二甲基甲酰胺中，然后加入20mg二环已基 碳二亚胺，室温下磁力搅拌，反应过夜。将反应液加入到溶解20mg BSA的硼酸盐缓冲溶液 (8mL0. 2mol/L，pH = 9. 0)中，磁力搅拌下反应5h。待反应完成后，装入透析袋（分子量 5000)。用pH = 7. 4的磷酸缓冲溶液透析3d，每天换透析液4次。冷冻干燥后，即得免疫 抗原，4°C保存。包被抗原合成方法与免疫抗原的合成方法相同。采用紫外分光光度法在 200~500nm下分别测定其吸光值，根据反应前后的紫外吸收光谱的变化，判断偶联是否成 功。
[0031] 实施方案3多克隆抗体的制备方法及抗体效份测定
[0032] 将免疫原解冻，然后加入等倍量的佐剂（第1次免疫用弗氏完全住剂，以后如强免 疫均用弗氏不完全住剂）用搅拌器乳化。完全乳化后采用背部皮下、颈部皮下、腿部肌肉和 耳缘静脉多种注射方式免疫6只体重为2. 5左右的健康新西兰大白兔。第一次免疫一个月 后每两周如强免疫一次。第4次加强免疫后1周耳缘静脉采血，并利用间接ELISA测定血 清效价。当效价不再上升时，采用耳缘静脉加强免疫。1周后心脏采血，室温静置〇.5-lh， 于4°C冰箱过夜后吸取上层血清。采用10% PEG6000沉淀得到多克隆抗体，透析后冷冻干 燥成粉末，于-20 °C下保存备用。
[0033] 相对亲和力测定：将完全抗原以0· 05mol/L的碳酸氢盐缓冲液（ρΗ9· 6)稀释至 1 μ g/ml包被酶联板，50 μ 1/孔4°C过夜；次日弃包被液，加1 % BSA300 μ 1/孔，37°C封闭 lh ;弃封闭液，加待测抗体50 μ 1/孔，37°C孵育2h ;用TPBS洗3次后进行硫氰酸盐洗脱 处理：每孔加 NH4SCN 溶液 60μ 1，浓度依次为 0、0· 5、L 0、L 5、2· 0、2· 5、3· 0、3· 5、4· 0、4· 5、 5. 0、5. 5和6. Omol/L，室温静置15min ;用TPBS洗3次，加相应的酶标二抗（抗兔血清蛋 白）50 μ 1/孔，37°C孵育2h ;TPBS洗涤3次，0PD底物显色并读取A490值。经硫氰酸盐洗 脱后每种抗体与抗原结合的A490值下降至原来的50%时其NH 4SCN浓度即为该抗体的亲和 力指数，以mol/L表示，通过比较亲和力指数衡量亲和力的高低。用本专利所述8种半抗原 制备后的多抗相对亲和力结果见表1。
[0034] 表1不同甲拌磷半抗原制备抗体的相对亲和力（NH4SCN浓度，单位mol/L)
[0035]
【主权项】
1. 一类半抗原，其特征是羟化甲拌磷与酰氯化1，8-萘啶类化合物结合后的产物。2. 根据权利要求1所述的半抗原，其特征在于所述酰氯化1，8-萘啶类化合物具有式 A(I)所示结构，所述半抗原具有式B(I)所示结构：或者所述酰氯化1，8-萘啶类化合物具有式A (VI)所示结构，所述半抗原具有式B (VI) 所 TTC幺去始 A3. -种权利要求1所述半抗原的制备方法，其特征在于是将羟化甲拌磷和酰氯化1， 8-萘啶类化合物在室温条件下，加入三乙胺，于丙酮中进行反应，生成目标标半抗原。
【文档编号】C07F9/6561GK105884831SQ201410809170
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年12月19日
【发明人】陈才法, 吴翚, 孙东旭, 周生亮, 宛瑜
【申请人】江苏师范大学, 徐州灵新生物技术有限公司, 陈才法