专利名称：沙棘联合共生体的构建方法
技术领域：
本发明涉及非豆科固氮树木联合共生技术，具体地说是沙棘联合共生体的构建方法。
背景技术：
氮素是组成蛋白质的主要元素，是植物生长所必需的大量营养元素。空气中虽含有近80％的氮气，但并不能被高等植物直接吸收利用，人工合成氮素化肥的能源耗费巨大，不合理的过量施用带来的环境污染问题也日趋严重，人们逐渐认识到农林业生产完全依赖化肥终非良策，因此生物固氮的研究倍受关注。在贫瘠的土壤中生物固氮的最经常的限制因素是磷元素，这是因为磷元素在参与生物界的物质循环中，只有在无机磷和有机磷之间的转化，而不发生氧化还原反应，而且磷元素在无人为活动参与的情况下总是单向流动的，生物体中的有机磷经分解后形成不溶性无机磷酸盐在土壤中沉积，在被河流带入海洋，不参与陆地上的磷循环。而与植物共生的菌根真菌可以通过根外菌丝的形成，增加植物与土壤的接触点，扩大吸收面积，缩短磷的扩散距离(文献1Hattingh，M.J.，Gray，L.E.，Gerdemsnn，J.W.1973.Uptake andtranslocation of 32 P-labelled phosphate to onion roots byendomycorrhizal fungi，Soil Sci.5456～63；文献2Nye P.H.，Tinker，P.B.1977.Solute movement in the soil-root system，OxfordBlackwellScientific Publications.；文献3Rhode，L.H.and J.W.Gerdemann.1978.Translocation of calcium and phosphate by external hyphae ofVesicular-arbuscular mycorrhizae，Soil Sci.126125～126)，从而提高宿主对磷素的吸收，改善植物营养状况，促进植物生长(文献4Raju，P.S.，Clark，R.B.，Ellis，J.R..et al，1990.Effects of species of VAMfungi on growth and mineral uptake of sorghum at differenttemperatures，Plant Soil.121165～170；文献5Sieverding，E.T，1983.Influence of Soil moisture regime on VA-mycorrhiza.H.II.Effects ofsoil temperature and water regime on growth，nutrient uptake and waterutilization of Eupatorium odoratum L.Z.Acker and Pflanzenbau.15256～57)；菌根还可分泌生长素、抗生素及一些酶提高植物的抗逆性，使菌根植物在贫瘠土壤中生存。
植物与微生物的共生是自然界普遍存在的一种生物学现象，其中与人类关系密切的有高等植物与菌根真菌共生形成的菌根，豆科固氮植物与根瘤菌或非豆科固氮植物与弗兰克氏放线菌共生形成的根瘤。近二十年来对于菌根和根瘤这样两位一体的共生体系的研究已取得显著进展，特别是从遗传特性、形态解剖、生理生态等方面对共生关系的建立、优化和机理都进行了深入的研究，通过人工接种促进共生体形成及应用的技术也有较快发展，在农林业生产实践中已显示出菌根和根瘤的应用潜力；但这方面多注重于植物与菌根真菌共生形成的菌根、固氮植物与根瘤菌或放线菌共生形成根瘤，进而在贫脊的土地上应用时，便不能最佳地形成植物与微生物间的营养共生环境，发挥固氮树种优良性状，极大满足它们各自生长的需求。由于Frankia具有对宿主的侵染范围宽，固氮活性比较强和对氧气不敏感等特性，在生物固氮研究中对Frankia菌的研究将更为重要；Frankia-非豆科树木共生固氮体系是自然界中重要的固氮生物资源，具有与Rhizobium-豆科植物相似的固氮能力，在自然界能量循环和生态平衡中起重要作用，但同具有固氮能力的木本豆科植物相比，非豆科树木共生固氮体系具有两大特点，一抗逆性强，耐干旱、耐盐碱，抗高寒、瘠薄，能在一般豆科植物不能生长的恶劣环境下正常生长结瘤固氮，常用作三北干旱地区造林先锋植物；二树木分布广，具有广谱的自然寄主范围。而且非豆科固氮植物几乎全部为木本双子叶，这些树种有很强的抗逆性，分布广、适应性强，因而在营林生产中应用这类植物的生物潜力是相当大的，非豆科树木共生固氮体系抗逆性强，且分布广，资源丰富，因此开展Frankia-非豆科树木联合共生体系的理论与应用研究，不仅对丰富和发展联合共生理论具有重要意义，而且在加速树木生长，解决农村资源短缺，减少水土流失，改良土壤和改善生态环境等方面将产生重大的经济和生态环境效益。
非豆科固氮树种-沙棘是三北地区重要垦荒先锋树种，其果实富含维生素，具有重要的经济开发价值。很早以前许多学者就认识到高等植物、根瘤、菌根同时存在的联合共生现象，固氮植物菌根的存在就是这种联合共生现象的具体表现；已有研究表明联合共生体中菌根菌与共生固氮菌之间存在着相互促进作用，尤其是菌根菌对固氮菌的固氮作用具有明显的增效作用，菌根的存在促进了宿主植物的生长，改善了植物根际的微生态环境；但是这类研究基本上是限于VA菌之间或外生菌之间，并且多停留在现象的描述上，并未在纯培养条件下进行，就将其归功于双接种的增效作用，这种盲目性的结论必然导致不能更好地利用固氮植物资源和菌根技术，发挥固氮植物与微生物共生的优势作用和效果不够理想，及对脆弱地带的生态恢复效果必然受到影响；并且不同的固氮树种需要适宜的不同的菌根菌、不同的固氮菌，它们不同的组合其增效作用明显不同，那么选择出不同树木适宜的不同菌根菌与共生固氮菌显得尤为重要；因为共生是一种双向选择过程，它们需要彼此相互适应，如果彼此间不能相互协调，反而会抑制植物生长。
发明内容
本发明的目的在于提供一种相互协调的适宜的VA菌根真菌、共生固氮菌与沙棘联合共生体的构建方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为将菌根菌、固氮菌与非豆科共生固氮植物沙棘相结合，以共生固氮为核心，发挥多学科配套优势，特别是对逆境条件下的沙棘与微生物共生生态的过程、生态功能和对环境的适应及作用进行研究，将纯培养条件下的观察测试与放大规模的田间模拟相结合，从微观到宏观角度揭示共生体系的基本规律及其相互关系，同时与沙棘选取相应的菌种进行混合接种，进一步增强宿主植物沙棘与微生物间的亲合力；本发明所采用的技术方案为以沙棘为宿主植物的VA菌根真菌聚丛球囊霉(G.aggregatum)与沙棘为宿主植物的弗兰克氏放线菌共同接种于沙棘形成沙棘联合共生体。
其具体操作过程如下(1)共生菌种的选取在沙棘分布的干旱、半干旱地区，随机选取至少3处不同地块的树龄在5年以上的沙棘根系样品进行形态解剖学观察，确定其VA菌根菌的感染情况；依据菌根感染强度和固氮结瘤量，确定共生菌与沙棘的亲合力，选定沙棘根际中的发育状态较优的菌种类型和较优的菌株，并在每一不同地块多点取样，于其根际中分离出VA菌根菌、弗兰克氏放线固氮菌，分别出心裁进行菌种扩繁培养；在纯培养条件下，将分离培养好的菌种单接和组合搭配接种，以回接试验确定其共生体形成效应，进一步对上述发育状态较优的菌种类型进行验证，确定优势菌种和优势菌种组合；(2)共生体构建用上述所选优势菌种组合对沙棘树种进行混合接种，构建成联合共生体。
其中所述弗兰克氏放线固氮菌的优良菌株的选取及确认过程为(1)优良菌株的初筛选择不同宿主来源和同一宿主不同位点的菌株，在纯培养中，在较为适宜的沙棘幼苗生长发育的相同培养条件下进行自生固氮活性的诱导培养，过一阶段后(至少在一个月后)，进行乙炔还原活性测定，活性高者为自生固氮活性强的菌株；(2)优良菌株的确认将自生固氮活性强的菌株与宿主植物进行回接试验，验证菌株对宿主植物的感染结瘤量，同时测定其根瘤的固氮活性，以此确认上述初筛菌株的优劣。
本发明具有如下优点1.本发明接种VA菌根菌及分离于沙棘根际中的固氮菌形成的联合共生体效果优于双接种和单接种，以此为理论依据去应用于造林生产实践，会能发挥它们之间的促生优势；从而提高沙棘的抗逆性，而且在其感染VA菌后可极大地提高宿主的抗旱性、抗盐碱性、抗重金属毒害及抗极端PH值等能力。
2.本发明接种VA菌根菌及分离于沙棘根际中的固氮菌形成的联合共生体增强宿主植物沙棘的适应性，能够较好地应用于今后的造林引种、育苗及经济林等生产实践中，尤其是逆境条件下的造林与复垦；同时在促进沙棘生长，沙棘病虫害的防治等方面都有很好的应用前景；能更好地恢复和重建农林生态系统而发挥共生优势。
3.本发明联合共生体的构建丰富和发展了联合共生理论，在森林生态系统中有较大的应用潜力，在加速沙棘树木生长，解决农村资源短缺，减少水土流失，改良土壤和改善生态环境等方面将产生重大的经济和生态环境效益；在营林生产中应用这类植物有巨大的生物潜力。
4.本发明通过纯培养验证了固氮树种沙棘优良性状的发挥优劣与其同时受菌根侵染和结瘤有关，以联合共生生态效应为主干，创建出沙棘联合共生体优化组合的应用技术；为生物适应贫瘠环境提供有效途径，增加其对不良环境的适应能力；为沙棘联合共生体接种技术在造林生产实践尤其是在逆境条件下的应用提供了理论依据。
具体实施例方式
实施例本实施例围绕北方干旱和半干旱地区逆境条件下固氮树种沙棘，以下实验过程中部分方法参照《菌根研究及应用》(中国林业出版社，1997年第一版)一书。
1.共生菌种的选取(1)在选定固氮树种沙棘分布的干旱、半干旱地区，随机选取4处不同地块的树龄在5年以上的沙棘根系样品进行形态解剖学观察确定其VA菌根菌的感染情况；依据菌根感染强度和固氮结瘤量，确定共生菌与沙棘的亲合力，选定沙棘根际中的发育状态较优的菌种类型和较优的菌株，并在每一不同地块多点取样，于其根际中分离出VA菌根菌，弗兰克氏放线固氮菌，分别进行菌种扩繁培养；供试菌株内生菌根真菌VAR为摩西球囊霉(Glomus mosseae)分离于刺槐林下；VAH为聚丛球囊霉(G.aggregatum)分离于沙棘林下。内生菌根菌以孢子形式分离于林下根际土壤中(土深约10～30厘米)，以三叶草为宿主植物进行菌种扩繁备用。
弗兰克氏放线菌HR16，HR18，HR32，HR37分离于不同地块的不同点位沙棘林下(见表1)。
表1
在纯培养条件下，将分离培养好的菌种单接和组合搭配接种，以回接试验确定其共生体形成效应，进一步对上述发育状态较优的菌种类型进行验证，确定优势菌种和优势菌种组合；其中所述弗兰克氏放线固氮菌的优良菌株的选取及确认过程为
首先进行优良菌株的初筛选择不同宿主来源和同一宿主不同位点的菌株，在纯培养中，在较为适宜的相同培养条件下进行自生固氮活性的诱导培养，过一阶段后，进行乙炔还原活性测定，活性高者为自生固氮活性强的菌株；然后进行优良菌株的确认将自生固氮活性强的菌株与宿主植物进行回接试验，验证菌株对宿主植物的感染结瘤量，同时测定其根瘤的固氮活性，以此确认上述初筛菌株的优劣。
试验方法A.沙棘种子的处理用自来水浸泡一小时，在震荡器上用中性的消毒液吐温2～3滴加到500毫升水中，漂洗90分钟；用自来水冲洗90分钟；再用30％的双氧水灭菌30分钟，后用无菌水反复冲洗几次；在无菌室将上述处理过的种子2～3粒置放在盛有琼脂培养基的指形管中，置于恒温箱(25℃)内待无菌苗长出二片叶后进行移植。
B.基质配置及用量培养基质为珍珠岩、泥碳分别过2mm筛，珍珠岩取筛上大粒，泥碳取下面粒性均一的碎屑，珍珠岩泥碳按7∶1的质量比用M.M.N营养液拌料，所用M.M.N营养液为总质量1.2倍，将上述拌好的基质用塑料布蒙12小时，待水分充分渗透后，将基质按2/3高度装入500毫升三角瓶，轻轻压实，瓶壁擦干净，高压蒸气灭菌1.5小时。
C.菌种用量及接种过程弗兰克氏菌悬液在匀浆器中匀碎离心(1000r/m，5-10min)，离心后的菌体按每100株苗接种离心后菌体1毫升的量接种；VA菌根菌真菌每瓶50个孢子，首先在基质中接入VA菌孢子，然后在每瓶栽入5棵无菌苗，一周后在接入弗兰克氏放线菌，每种搭配重复三次，瓶口盖上口径5厘米的塑料小杯，自然光照为主，辅以人工光照(105000LUX)，室温条件下培养5个月，每2～3天浇20-30毫升无菌水每瓶，在小苗长至瓶口时打开杯盖。
接种处理单接HR37，单接HR32，单接HR18，单接HR16，单接VAR，单接VAH；双接VAR+VAH；不加接种物为CK；每种处理重复3次。
D.培养6个月后对沙棘小苗进行测试苗高、地径、生物量(植株干重)、菌根侵染率、结瘤干量、固氮活性。其中菌根侵染率采用压片染色法计数统计，用形态解剖学法对根部菌根特征进行观察。固氮活性的测定采用国际通用的乙炔还原法，于实验室在100型气相层析仪上检测乙炔含量。
(2)结论沙棘联合共生的确认(在纯培养条件下，较单纯的根际环境，这种确认是确凿可信的)A.VA菌根真菌侵染的确认通过压片染色法，根据根样鲜嫩的特点加热处理时间适当缩短来进行VA菌根真菌感染的观测在感染VA菌根菌的沙棘根系皮层组织细胞中发现泡囊及胞内菌丝，泡囊在皮层薄壁细胞内或在细胞间由菌丝体顶端膨大形成，其形态为椭圆形或长椭圆形，在根系表面也观察到了VA菌根菌根外菌丝的结构，同时在根际培养基质中筛出了VA菌根真菌孢子。通过镜检观察根系侵染结果，充分确认了沙棘能形成菌根。
同时接种弗兰克氏放线菌的沙棘能够结瘤，证明了沙棘能够与弗兰克氏放线菌形成共生体进行结瘤固氮作用。
B.菌根真菌对于沙棘生长的增效作用菌根作为一种高等植物和真菌之间互利共生的活体营养现象，是真菌和植物长期协同进化的结果，菌根为共生双方提供了更广阔的生存和发展的可能性，实验结果证实了接种菌根真菌对宿主植物的生长有明显的促进作用，同时接种不同的VA菌对宿主植物生长有改善作用是有差别的；如表2所示。
表2
菌根对宿主植物沙棘的生长有促进作用，不同来源的菌根真菌对沙刺的促进作用是不同的；其中接种VAH对宿主植物的植株表现较好的生长状况；而接种VAR促进作用虽有，但体现不十分明显；混合接种与对照比也有增长，但不如单接VAH好。可见对沙棘来说，VAH是相对较好的共生植株，从菌根的生长状况可以明显看出，这说明宿主植物良好的生长状况是由于菌根侵染所形成的。接种VAH好的原因也许是VAH分离于沙棘林下，经过长期限的协同进化，菌根菌与宿主植物之间彼此适应，相互获益，而VAR来自刺激槐林下，在人工构建成中虽能形成共生体，并有一定的促进作用，但共生体是长期进化的结果，人工建立共生体恐怕不符进化规律，因而增效不明显；当两种内生菌根混合时，由于两种菌之间存在着竞争，因而限制了其作用的发挥。这说明了菌根真菌侵染宿主植物存在着一定的专一性，土著共生菌种的选择对于联合共生体的建立具有重要的意义。
表3
C.弗兰克氏放线菌对沙棘生长的作用，如表3所示。
弗兰克氏放线菌对沙棘的生长具有促进作用，沙棘可与弗兰克氏菌形成共生体，具有很强的固氮能力，满足植物生长氮素的需求，促进植物的生长，实验结果证实了这点，同时也可以看出，不同来源的弗兰克氏菌对沙棘的生长的促进作用是不同的，这也说明了非豆科固氮树木沙棘与弗兰克氏放线菌联合共生体的建立很有必要进行优良菌株的筛选。接种HR16、HR37两株为较好的共生菌株，HR18、HR32也有一定的促生作用，但相对于上两株效果稍差一些；这充分证明了宿主植物沙棘良好的生长状况与弗兰克氏放线菌的作用是紧密相关的。
通过人工纯培养实验，对沙棘根部形态特性解剖学观察证实，非豆科固氮树木沙棘能够被VA菌根侵染形成VA菌根，同时也能被弗兰克氏放线菌侵染形成根瘤。
2.沙棘联合共生体的构建用上述所选优势菌种组合对沙棘树种进行混合接种，构建成联合共生体，优势菌种组合为VA菌根菌及分离于固氮树种根际中的固氮菌。
人工构建盆栽实验盆栽是半开放的，相对于纯培养条件来说，接近自然条件，因此它是纯培养的进一步扩展，能为大面积的应用联合共生技术进行植树造林提供基础，并形成一套可行的人工接种方法。
(1)材料与方法A.供试土壤来自树木园林内40厘米以下的生土，过筛，在阳光下晒二天，加干燥灭菌的河沙，沙土比为2∶1，混匀后装入直径为20厘米的泥盆中，每盆加过磷酸钙5克，每盆装2.5公斤；土壤理化性质如表4所示。
表4
B.实验处理(1)不加接种物(对照)；(2)接种弗兰克氏放线菌HR16；(3)接种菌根真菌一VAR，二VAH；(4)同时接种VAR和HR16；每种处理重复5次，每盆保证有5棵苗。
接种物来源和菌剂用量弗兰克氏放线菌HR16分离于沙棘根瘤；VA菌根接种物是通过白车轴草扩繁后获得含有孢子和细根碎片(侵染率为48％)的菌根菌剂，其中VAR为摩西球囊霉(Glomus mosseae)分离于刺槐林下、VAH为聚丛球囊霉(G.aggregatum)分离于沙棘林下每盆接种50克，均匀散布于盆中。放线菌在匀浆器中匀碎离心(1000转/每分钟，5-10分钟)，离心后的菌体按1毫升/100棵苗的量接种。
C.沙棘种子处理用氯化汞消毒灭菌，在28℃的恒温箱中催芽；挑选萌芽整齐生长良好的种子播种；先将内生菌根真菌接种于盆中，播入种子；小苗长出一星期，接种放线菌，盆栽前两个星期置于温室中，之后放于室外，6个月后进行各项指标测试。
D.生长指标和生理指标的测定6个月后进行各项指标测试，包括株高、地径、鲜重、主根长、侧根数、结瘤量、固氮活性、叶绿素含量、净光和效率；其中叶绿素含量采用ANON法进行测量；净光和效率采用CL-301P光合测定仪进行测定；菌根侵染率采用压片染色法进行计数统计；菌根及根瘤分别采用压片和切片法进行形态解剖观察；固氮活性采用乙炔还原法进行测试。
(2)结论A.联合共生的确认菌根侵染的沙棘根系表现出根毛的退化，小根的分叉、变粗，外形多成瘤状、块根状；缠绕于根外的菌丝体，疏松，不形成明显的菌丝套，菌丝可穿过根部表皮细胞内，有的还可以进入到内皮层细胞内，压片染色后在细胞内的菌丝体较肥大，有的断裂成小段，有的形成泡囊状和树丛状，或盘旋成扭结状，证实沙棘确能形成内生菌根；同时也可看到根瘤，证明沙棘能被侵染结瘤。
表5
B.菌根菌对沙棘生长的促进作用如表5所示。
从以上结果可以发现，接种VA菌根菌明显促进了沙棘的生长，接种VAR与VAH比对照组都好，并且菌根的发育状况更好，其中VAH表现效果最佳，这充分证明了宿主植物沙棘的良好生长状况是由于菌根侵染带来的，即VA菌根对于非豆科固氮树木沙棘的生物量的提高起了关键性的作用；从接种VAR和VAH植株生长状况不同说明不同的菌根真菌对宿主植物的促生作用是不同的，这也从一定程度上说明了菌根真菌对宿主植物具有选择性，从而可以肯定土著菌种的选择对联合共生体的建立起关键性的作用。从沙棘的叶绿素含量和净光和效率两项生理指标可以看出菌根的形成增强了沙棘对营养元素的吸收，激素水平的变化，从而使叶绿素合成加快，另一方面菌根的形成促使叶绿素降解减缓；在一定条件下，叶绿素的含量和二氧化碳的吸收之间表现出很强的相关性，即在一定范围内叶绿素含量高，光和效率就高，而光合作用的提高对于促进沙棘的生长，延缓叶片的脱落，提高其抗逆性举足轻重，这也是从植物生理的角度验证了菌根真菌的促生作用。
C.弗兰克氏菌对沙棘生长的促进作用如表5所示。
接种菌种的植株的各项指标都较好，说明其对宿主植物沙棘来说是一种较合适的共生菌种，能够改善植物的氮素营养从而促进植物的生长。这说明弗兰克氏放线菌可以提高树木的生理功能，增强其对逆境的适应性。
D.VA菌根对弗兰克氏菌结瘤固氮的影响如表5所示。
内生菌根真菌能帮助植物从土壤中获得矿物营养(尤其是那些难溶性营养成分)、增加水分的吸收和植物对土壤胁迫条件的耐受性以及植物激素的产生，并且改变植物体内C素的分布类型。随之而发生的是植物细胞尤其是根细胞膜透性、根系分泌物和渗出物数量和质量的改变，并且最终影响植物根际微生物的类型和种群数量，并且表现出很强的选择性，这就是菌根根际效应，本实验以沙棘为对象进行定量分析，证明菌根菌对于植株的结瘤固氮能力的促进作用，同时也显示出不同的菌根真菌对弗兰克氏放线菌的结瘤固氮能力的促进作用是不同的。
从实验结果可以看出，接种弗兰克氏放线菌和菌根菌的植株其结瘤量和固氮活性要好于只接弗兰克氏放线菌的植株，而它们都比对照组高，其中接种VAH和HR16的结瘤固氮能力最高；可以看出不同的接菌条件下固氮能力与菌根的发育状况存在正相关性，说明由于VA菌根菌的存在的作用才导致宿主植物沙棘的结瘤固氮能力提高，即菌根对于放线菌的结瘤固氮能力具有促进作用，但不同菌根其促进作用不同，VAH是相对较好的共生菌株，原因可能是其与沙棘长期共生协同进化，能体现出较好的共生效益，而VAR只是人为的设置与沙棘共生，虽能形成共生体，但若想达到完全的协调一致，还需进化，从而再次说明选育共生株最好选择伴生的土著菌种，这样才有可能发挥最佳的共生生态效益。
E.弗兰克氏对菌根的作用如表5所示。
VA菌根真菌从孢子的萌发到菌丝在皮层细胞内形成丛枝和泡囊的整个发育过程中，因其与弗兰克氏菌生活在同一根际微生态系统中，必然会受到弗兰克氏菌的影响；弗兰克氏菌除了能通过改善宿主植物的生长状况来间接的影响菌根外，还可通过分泌物来改变根际环境，进而促进根系的发育。
接种弗兰克氏放线菌对植株菌根的发育状况有一定的影响，同时接种放线菌和菌根真菌的植株发育状况要明显好于只接菌根真菌的植株，接种放线菌明显地促进了菌根菌的发育状况，在菌根菌的发育状况和结瘤固氮能力之间体现一定的正相关性，由此可知，放线菌对菌根菌的发育有着促进作用，并且因菌种的不同促进作用也不同，针对沙棘来说，对放线菌HR16的结瘤固氮能力促进效果较好的是VAH这种菌根真菌。
F.VA菌与弗兰克氏菌的协同作用如表5所示。
VA菌根和根瘤能够同时存在于沙棘上，说明它们形成的联合共生体是自然选择状态下的最优生存方式，那么它们间必然存在着协同作用。结果表明，接种VAH和HR16的植株明显的体现了较好的联合共生生态效益，它们间协同进化，彼此协调，功能互补，在促进沙棘生物量的提高，生理功能的增强以及抗逆性提高方面都好于其它菌种；因此，从上述分析可知，联合共生优势是建立在菌种合理搭配的基础上的，最佳的菌种选择应是宿主植物的土著菌种，这与最佳结瘤固氮，最佳菌根发育状况的菌种组合是一致的。
从上表可看出，双接种菌根菌和放线菌不但促进了菌根的发育状况，也提高了放线菌的结瘤固氮能力，这种彼此促进的良好效应，必然导致联合共生优势的产生。
从实验中我们可以明显的发现放线菌的结瘤固氮能力与菌根菌的发育状况之间的相互增效作用；对植物生长起重要作用的因素除水份以外，氮、磷营养的供应是最重要的，放线菌能够固定大气中的氮素，满足植物生长对氮素的需求，而菌根促进宿主植物吸磷素是一个普遍现象，菌根菌通过根外菌丝的形成直接吸收养份并运输给宿主植物，同时固氮菌和菌根菌都具有生防的功能是联合共生体促进宿主植物生长的另一个原因，菌根的侵染改变了根系的形态以及生理生化性状，限制了病菌的侵染，放线菌能够通过分泌一些抗生素来达到生防的目的；关于二者之间协同作用的一个问题是既然放线菌可以产生抗生素，而菌根真菌也能分泌抑制性物质，它们间必然会带来一定的副效应，因而促进作用和副效应之间的平衡问题是成为联合共生体共生效益能否发挥的关键，从实验结果也证实了此点，VAR与HR16的接菌组合不如VAH和HR16的接菌组合效果好，所以在于副效应在整体的协同作用中占了较大的比例。
本实施例所用各类菌株都为非特异性的菌株体，而各菌株体所在的菌种于自然界普遍存在，分布较广，各菌种在微生物学杂志、生态学报、土壤学报、林业科学研究、应用生态学报上1989～2000年间发表的论文中均有提及和利用，摩西球囊霉分离于刺槐林下，聚丛球囊霉分离于沙棘林下，都于1998年分离得到，依据N.C.SCHEWCK andYVONNE PEREZ 1988.1Mannual for the identification of VA mycorrizalfungi(second edition published)进行分类鉴定；沙棘林下的弗兰克氏放线菌分离于1982年，此后，先后在微生物学报、微生物学杂志、应用生态学报上1984～1994年间发表的论文中均有提及和利用。
权利要求
1.沙棘联合共生体的构建方法，其特征在于以沙棘为宿主植物的VA菌根真菌聚丛球囊霉与沙棘为宿主植物的弗兰克氏放线菌共同接种于沙棘形成沙棘联合共生体。
2.根据权利要求1所述沙棘联合共生体的构建方法，其特征在于其中所述弗兰克氏放线菌为HR16。
3.根据权利要求1所述沙棘联合共生体的构建方法，其特征在于具体操作过程如下(1)共生菌种的选取在沙棘分布的干旱、半干旱地区，随机选取至少3处不同地块的树龄在5年以上的沙棘根系样品进行形态解剖学观察，确定其VA菌根菌的感染情况；依据菌根感染强度和固氮结瘤量，确定共生菌与沙棘的亲合力，选定沙棘根际中的发育状态较优的菌种类型和较优的菌株，并在每一不同地块多点取样，于其根际中分离出VA菌根菌、弗兰克氏放线固氮菌，分别进行菌种扩繁培养；在纯培养条件下，将分离培养好的菌种单接和组合搭配接种，以回接试验确定其共生体形成效应，进一步对上述发育状态较优的菌种类型进行验证，确定优势菌种和优势菌种组合；(2)共生体构建用上述所选优势菌种组合对沙棘树种进行混合接种，构建成联合共生体。
4.根据权利要求2所述沙棘联合共生体的构建方法，其特征在于其中所述弗兰克氏放线固氮菌的优良菌株的选取及确认过程为(1)优良菌株的初筛选择不同宿主来源和同一宿主不同位点的菌株，在纯培养中，在较为适宜的沙棘幼苗生长发育的相同培养条件下进行自生固氮活性的诱导培养，过一阶段后，进行乙炔还原活性测定，活性高者为自生固氮活性强的菌株；(2)优良菌株的确认将自生固氮活性强的菌株与宿主植物进行回接试验，验证菌株对宿主植物的感染结瘤量，同时测定其根瘤的固氮活性，以此确认上述初筛菌株的优劣。
全文摘要
本发明涉及非豆科固氮树木联合共生技术，具体地说是沙棘联合共生体的构建方法，以沙棘为宿主植物的VA菌根真菌聚丛球囊霉(G.aggregatum)与沙棘为宿主植物的弗兰克氏放线菌共同接种于沙棘形成沙棘联合共生体。本发明接种VA菌根菌及分离于沙棘根际中的固氮菌形成的联合共生体提高沙棘的抗逆性，增强宿主植物沙棘的适应性，能够较好地应用于今后的造林引种、育苗及经济林等生产实践中，尤其是逆境条件下的造林与复垦；同时在促进沙棘生长，沙棘病虫害的防治等方面都有很好的应用前景；丰富和发展了联合共生理论。
文档编号A01H1/00GK1465226SQ0213242
公开日2004年1月7日 申请日期2002年6月21日 优先权日2002年6月21日
发明者何兴元, 张成刚, 田春杰, 韩桂云 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所