专利名称：花生耐渍涝的非共生血红蛋白基因AhGLB及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及农业生物技术领域，特别涉及一种花生耐涝基因AhGLB，本发明还涉及所述花生耐涝基因的用途以及不同基因型花生受到不同胁迫处理时该基因的特异表达情况，揭示该基因的功能。
背景技术：
花生是我国主要的油料作物和经济作物，是我国最具竞争力的出口创汇农产品。水分是影响植物的生长、发育、代谢和生态地理分布的重要的生态因子之一。由水分造成的胁迫一般分为两种，干旱胁迫和溃涝缺氧胁迫，两者对植物生理生态造成的危害非常大。其中湿涝对世界花生产量影响颇深，在亚洲(尤其是东南亚)、南美洲花生产区湿涝与干旱往往交替发生，雨季明显，是世界花生湿涝危害的重灾区。由于国内外对花生的研究普遍注重于抗旱一方面，对花生溃涝危害的认识不够充分，花生溃涝研究无体系、不深入，整体上仍处于初始阶段，而我国花生产区常分布于湿润、半湿润气候区，旱涝往往交替发生，特别是南方产区涝害尤其明显，其中长江中下游地区的春涝、春夏连涝；华南产区的夏秋涝；以及平原花生区和华南稻田花生区溃涝等，都是涝害十分严重的受灾区，据预测，随着全球气候变暖，我国南方花生的湿涝问题将更加突出，在花生的生长发育过程中，溃涝缺氧胁迫的影响不容忽视，它将影响花生对氧分和营养的吸收，同时也会改变花生的农艺性状等。我国作为当今世界花生生产、外贸第一大国，同时 作为溃涝严重受害国之一，对花生涝害防治研究亟待加强，但是，迄今为止除了对涝害或土壤过湿对花生产量的影响和化学调控研究以外，很少涉及内部机理的深入研究，因此花生湿涝机理研究亟待开展，当下应加强花生抗溃涝胁迫的研究和治理，以推进花生品种改良创新和指导生产，保证花生产业全面稳定的发展。分子育种是运用分子生物学技术的科学性与先进性，分离目的基因，构建重组分子，将目的性状基因导入欲改良的植物细胞中，达到培育高产、优质、高抗的新品种，且综合性状优良的后代，育出新品种的目的。分子育种是从基因这个微观水平予以改造和标记，再在植株上进行表达。非共生血红蛋白近年来陆续在植物当中被发现，研究表明非共生血红蛋白基因能在低氧胁迫时，结合NO作用生成N03_，提升N03_在植物体当中的浓度，满足植物在溃涝缺氧胁迫下对N03_的需求，同时降低NO对植物造成的伤害，从而减轻溃涝低氧胁迫对植物体的伤害。
发明内容
本发明针对现有技术的不足提供以下的技术方案:花生耐溃涝的非共生血红蛋白基因AhGLB，其全序列为序列表SEQ ID NO:5所示。花生耐溃涝的非共生血红蛋白基因AhGLB的应用，该基因的表达能够提高花生抗溃涝胁迫的能力。本发明还涉及利用荧光定量PCR技术检测花生在不同处理条件下所述基因的表达量，包括如下步骤:设计一对PCR引物:AhGLB-RT-S和AhGLB_RT_AS，提取花生幼叶总RNA，反转录为cDNA，以其为模板，进行PCR扩增，回收扩增产物，将PCR产物与pMD_18连接，然后转化大肠杆菌DH5 α，经菌落PCR鉴定后，阳性克隆大量扩增，提取质粒，将取得的质粒依次稀释得到浓度梯度；利用罗氏荧光定量PCR软件分析并计算出相关的线性方程，作图得标准曲线；在Roche荧光定量PCR仪进行待测样品的荧光定量PCR，根据程序自动给出的Ct值，对照标准曲线，即可得出所测样品的目的基因拷贝数。设计不同的处理方式:1)未处理花生不同组织中AhGLB基因的表达分析；2)不同基因型花生在氮诱导下AhGLB基因的表达分析；3)不同基因型花生在低氧胁迫下AhGLB基因的表达分析。本发明还涉及上述花生耐涝基因在构建载体、转基因以及检测花生耐溃涝状况中的应用，包括如下步骤:构建AhGLB正义基因植物表达载体PRI101-AN-AhGLB，转化农杆菌ΕΗΑ105，利用农
杆菌侵染法转化花生，经筛选鉴定，获得转基因植株；设计溃涝缺氧胁迫处理，利用荧光定量PCR技术检测转基因花生及对照根中AhGLB基因的表达量。本发明从分子生物学角 度，以花生为材料，从基因库中挑选许多植物中的非共生血红蛋白基因序列，设计简并引物，获得中间片段，再利用RACE技术扩增出全长cDNA片段，从花生中分离克隆得到AhGLB基因，通过BLAST分析得知该序列与其他植物中的非共生血红蛋白序列相似性极高，并从荧光定量的水平研究了 AhGLB基因在花生不同部位、不同时间氮诱导、不同时间低氧胁迫下的表达量变化情况，以及溃涝缺氧胁迫下AhGLB基因在转基因花生植株根中的表达情况，研究了花生非共生血红蛋白基因在植物应对溃涝缺氧胁迫下的作用。试验中证明分离克隆得到的AhGLB基因，与花生抗溃涝缺氧胁迫存在相关性，并且获得了溃涝低氧胁迫下各防御酶的生理特性变化情况，获得了转AhGLB基因花生抗溃涝植株，为最终完成花生抗溃涝缺氧胁迫的转基因研究和抗溃涝缺氧胁迫新品种的培育奠定基础。花生在受到溃涝缺氧胁迫时最主要的表现为氧分的供应不足，也就是低氧胁迫，因此，花生中非共生血红蛋白基因AhGLB与花生抗溃涝胁迫相关，推测其表达可以提高花生抗溃涝胁迫的能力。
图1:花生AhGLB基因的标准曲线；图2:花生AhGLB基因在不同组织中的相对表达量；图3:花生AhGLB基因在低氧胁迫下的相对表达量(ZH8:中花8号，YH15:豫花15，XH2008:湘花 2008 ；G:根，Y =Bf )；图4:花生AhGLB基因在氮诱导下根中的相对表达量，A图为中花8号及对照，B图为豫花15及对照，C图为湘花2008及对照；图5:花生AhGLB基因在氮诱导下叶中的相对表达量，A图为中花8号及对照，B图为豫花15及对照，C图为湘花2008及对照；图6:转基因植株及对照在溃涝缺氧胁迫下根中AhGLB基因的表达量(T:转基因花生植株；ck:非转基因植株)；
具体实施方式
:实施例1:花生耐溃涝基因AhGLB的获得1、花生组织总RNA的提取实验准备:所用器皿都需经过特殊处理。耐高温仪器用具150°C烘烤3小时，其他器皿用0.1 %的DEPC浸泡12小时，然后高压灭菌去除DEPC。溶液试剂用0.1 %的DEPC处理(37°C放置12小时后高压消毒)，不耐高温的试剂直接用DEPC-H2O配制。总RNA提取按TIANGEN的Trizol Reagent的操作要求，具体步骤如下:I)取花生幼嫩叶片在液氮中研磨成粉末后，每50mg组织加入I毫升Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。2) 12000g，4°C离心10分钟，将上清液转移入一干净离心管中，研磨液室温放置5分钟，上清液15-30°C静置5分钟。3)以用匀浆的Trizol试剂计，每ImL加入0.2mL的氯仿，盖紧离心管盖，剧烈摇晃15秒，15-30°C静置2-3分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离。4) 12000g，4°C离心15分钟，此时样品分为三层。上层水相约为用以匀浆的Trizol试剂体积的60%，将上层水相移入一干净离心管。按每毫升Trizol液加0.5mL异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g，4 °C离心10分钟。5)弃去上清液，以用勻衆Trizol试剂计,每ImL加入至少ImL的75%乙醇,洗漆沉淀。涡旋混合，不超过5000g，4°C离心3分钟。6)小心弃去上清液，然后室温或真空干燥2-3分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度，甚至RNA不溶。加入少量无RNase水(约40 μ L)充分溶解。7)电泳检测总RNA的纯度和亮度。整个操作过程始终戴口罩与手套操作,并频繁更换手套,尽量避免RNase污染。2.单链cDNA合成,具体参照Takara逆转录试剂盒MML-V方法First strand cDNA合成试验操作方法:Microtube 管中(表 I):表I
权利要求
1.花生耐溃涝的非共生血红蛋白基因AhGLB，其全序列为序列表SEQID NO :5所示。
2.花生耐溃涝的非共生血红蛋白基因AhGLB的应用，该基因的表达能够提高花生抗溃 劳胁迫的能力。
全文摘要
本发明公开了一种花生耐渍涝的非共生血红蛋白基因AhGLB及其应用，其全序列为序列表SEQ ID NO5所示。该基因在花生受到长期阴雨或洪涝引起的渍涝缺氧胁迫时，能与NO结合生成NO3-，减轻渍涝危害，从而在花生遭受渍涝危害时发挥重要作用。此外，本发明还公开了不同基因型花生受到不同胁迫处理时该基因特异表达情况，以及转基因花生受到渍涝缺氧胁迫处理时该基因的表达情况，用于揭示该基因的功能。
文档编号A01H5/00GK103255147SQ20131008892
公开日2013年8月21日 申请日期2013年3月20日 优先权日2013年3月20日
发明者单世华, 李林, 张廷婷, 李春娟, 徐娟, 闫彩霞, 周西 申请人:山东省花生研究所