专利名称：一种真空渗透辅助农杆菌介导甘蔗遗传转化的方法
技术领域：
本发明属于植物生物技术领域，尤其是甘蔗愈伤组织遗传转化方法。
背景技术：
甘蔗是我国最为重要的糖料作物，2011/2012榨季，我国蔗糖产量为1151万吨，蔗糖产量占到全国食糖总产的91%，可见甘蔗产业在保障全国食糖供应体系中具有至关重要的地位。但是，甘蔗种植过程中经常出现病虫害频繁发生、季节性干旱以及低温冷害等问题，造成生产损失严重，蔗农和制糖 企业收入受损，导致我国制糖产业国际竞争力下降。因此，生产上迫切需要提高品种的产量和抗逆境胁迫能力，培育高产、高糖、高抗和高经济收益的优良品种。甘蔗栽培种是由甘蔗属热带种、细茎野生种、印度种、中国种等多个物种间的种间杂交形成的复合体，染色体数量多，基因组结构复杂。甘蔗栽培种对光周期反应敏感，一般只能在低纬度地区才能开花，而且不同基因型的开花时间相差较大，一些重要种质材料经常由于花期不育等问题难以配置杂交组合。因此，甘蔗常规杂交育种难度大，周期长，选育一个品种往往需要10年左右的时间。而且，由于甘蔗基因组大且复杂，没有纯合体，无法针对某个单一性状进行定向回交，新选育的种质往往由于单一性状的缺陷无法推广应用。基因工程是定向、快速改良植物性状的方法，通过转基因技术在提高植物抗病虫以及干旱、寒害等逆境胁迫方面已经有了许多成功报道。由于甘蔗是营养繁殖，Ttl代转基因植株就可以稳定目标基因性状，与水稻、玉米等其他作物相比，甘蔗转基因减少了外源基因自交、纯合的选育过程，更容易获得既保持供体植株原有主要目标性状，又对某个单一性状进行改良的效果。因此应用转基因技术定向改良甘蔗周期短，效果好，是甘蔗遗传改良的重要途径。目前甘蔗的遗传转化技术主要是采用基因枪法和农杆菌介导法。基因枪法虽然操作简单，但是外源基因插入拷贝数多，易产生嵌合体，遗传稳定性差。与基因枪转化方法相t匕，农杆菌介导转化方法外源基因插入的拷贝数低，对受体伤害小，设备简单。自1998年报道农杆菌介导甘蔗遗传转化成功以来，农杆菌介导法在甘蔗上的应用已有多个报道。但是，目前农杆菌介导甘蔗遗传转化上的应用仍存在一些不足，转化效率一般都在3%以下，转化成本高、时间长。农杆菌介导甘蔗遗传效率低的主要原因之一是在农杆菌菌株和甘蔗愈伤细胞侵染过程中工程菌株和愈伤细胞不能充分接触，另外在侵染后为了将共培养后的愈伤组织上携带的农杆菌去除干净，对愈伤组织要进行水洗、干燥等处理，处理过程中一方面损失了一部分转化成功的愈伤细胞，另外对愈伤细胞的生长也有伤害，导致后期获得转基因植株量减少。
发明内容
本发明目的在于提供一种真空渗透辅助根癌农杆菌介导转化甘蔗的方法，其克服现有技术的不足，提高甘蔗农杆菌遗传转化效率。一种真空渗透辅助农杆菌介导甘蔗心叶愈伤组织遗传转化的方法，包括以下步骤:
(1)甘蔗心叶胚性愈伤组织的诱导及增殖；
(2)含有目标基因的根癌农杆菌的活化与培养；
(3)真空渗透辅助农杆菌侵染甘蔗胚性愈伤组织；
(4)抗性材料的筛选与出苗；
(5)抗性材料鉴定。步骤(I)所述甘蔗心叶胚性愈伤组织的诱导及增殖方法是:
(1.0)取甘蔗茎尖生长点以上不大于6cm的幼嫩心叶作为外植体，无菌条件下，将消毒好的外植体切成0.5 2.5mm的圆盘片；
(1.1)将步骤(1.0)的外植体接种于愈伤诱导培养基上，置于26 28°C的黑暗条件下培养，挑选生长状况良好的胚性愈伤组织继代一次；
(1.2)挑步骤(1.1)的生长状况良好的继代后胚性愈伤组织转接入新的愈伤诱导培养基上，进行活化培养；
愈伤诱导培养基是:MS + 2-4 D (I 4)mg/L +蔗糖30g/ L +琼脂(7 9)g/ L。步骤(2)所述含有目标基因的根癌农杆菌的活化与培养方法是:
(2.0)挑取含有fer 基因的根癌农杆菌菌株EHA105的单菌落；
(2.1)将步骤(2.0)的单菌落接入含Rif 50mg/L和Kan 50mg/L的Iml YEP液体培养基中，在温度为26 28°C、震荡速度为200 rpm的条件下，培养3 4小时；
(2.2)取步骤(2.1)的菌液150 300 μ L，涂布于YEP固体培养基(含Rif 50 mg/L和Kan 50mg/L)上，在温度26 28°C下暗培养24 48小时，收集YEP固体培养基上的菌体；
(2.3)将所收集的菌体转入100 200 ml含AS 150 μ mol/L的MS液体培养基，160 200 rpm振荡培养5 6小时，菌液的OD66tl值达到0.3 0.6为转化工程菌液；
将制备好的转化工程菌液分装到三角瓶中备用。步骤(3)所述真空渗透辅助农杆菌侵染甘蔗胚性愈伤组织方法是:
(3.1)将步骤(I)活化培养3 7天后的胚性愈伤组织，放置于超净工作台内无菌干燥滤纸上，使表面干燥，将处理好的胚性愈伤组织转入步骤(2.3)中装有制备好的转化工程菌液的三角瓶中，胚性愈伤组织和转化工程菌液在温度为22 28°C、震荡速度为80 100rpm条件下共培养5 15分钟,后放在0.02、.06 Mpa的真空压力条件下辅助农杆菌侵染2 4分钟，重复2 3次重复；
(3.2)步骤(3.1)菌侵染后的愈伤组织转入覆盖滤纸的共培养固体培养基(MS + AS150 μ mol/L)上，在温度为21°C 24°C下暗培养2 5天；
(3.3)将步骤(3.2)中的愈伤组织转接入恢复培养基(MS + 2,4-D (2^3) mg/L +Timentin (50^100) mg/L +蔗糖30g/L)上，在温度为26 28 1:下暗培养5 7天。步骤(4)所述抗性材料的筛选与出苗的方法是:
(4.1)将经步骤(3.3)恢复培养后的愈伤组织转接入筛选培养基(MS + 2，4-D(2 3)mg/L + Timentin (50 200) mg/L + PPT (1^3) mg/L + 鹿糖 30g/L), 2 周后，挑选抗性愈伤组织进行继续筛选培养；
(4.2)分化培养，将经步骤(4.1) 2代筛选培养后的抗性愈伤组织转接到分化培养基(MS + 6-BA (2 3)mg/L + NAA ( 0.Γθ.3)mg/L + Timentin (50 100) mg/L + PPT(Γ3) mg/L +蔗糖30g/L)上，在温度为26 28 1:下、光强为15001ux、每天光照时间16小时的条件进行光照培养，分化出苗，获得抗性植株；
(4.3)抗性植株培养，将步骤(4.2)的生长到2 4厘米的抗性植株转入筛选培养基(MS + NAA (2 3)mg/L + Timentin (50 100)mg/L + PPT (I 3) mg/L + 鹿糖 30g/L)上，15天后抗性苗生根；
(4.4)生根培养，将步骤(4.3)的抗性苗转到生根培养基进行生根培养，生根培养基为:MS + NAA (I 3)mg/L + Timentin (50 200)mg/L + PPT (I 3) mg/L + 蔗糖 50g/L,待根长3 5cm时，将瓶苗在温室中炼苗5 7天；
(4.5)将步骤(4.4)的瓶苗假植于苗圃基质中，获得抗性植株。步骤(5)所述抗性植株鉴定的方法是:
将获得的抗性植株采用CTAB法提取DNA，用目标基因的特异引物进行PCR扩增，以pCAMBIA 3301质粒作为阳性对照，对抗性植株进行PCR检测；
取PCR阳性转基因植株叶片，提取RNA，根据目标基因特异引物进行RT-PCR分析；
取PCR阳性转基因植株叶片，用SDS方法大量提取DNA，进行southern blot分析。本发明具有如下突出的实质性特点和显著进步:本发明采用的真空渗透辅助农杆菌介导甘蔗遗传转化方法，在真空的情况下可促使农杆菌通过愈伤组织细胞间的空隙进入到深层的细胞，而且会在细胞的表面引起小伤口，致使植物分泌一些酚类物质以激活Ti质粒中T-DNA的剪切和转移，本发明完善了农杆菌介导的甘蔗遗传转化体系，与普通农杆菌介导法相比，本发明显著提高 了甘蔗的遗传转化率。
图1是本发明的操作流程图。
具体实施例方式通过以下实施例对本发明作进一步详细说明；
参考图1，一种真空渗透辅助农杆菌介导甘蔗心叶愈伤组织遗传转化的方法，包括如下步骤:
(1)甘蔗心叶胚性愈伤组织的诱导及增殖；
(2)含有目标基因的根癌农杆菌的活化与培养；
(3)真空渗透辅助农杆菌侵染甘蔗胚性愈伤组织；
(4)抗性材料的筛选与出苗；
(5)抗性植株鉴定。实施例1:
步骤(I)的甘蔗心叶胚性愈伤组织的诱导及增殖:
(1.0)以甘蔗品种粤糖00— 236为转化受体材料，晴天，取健康甘蔗梢部剥去外层叶鞘后，经0.1%升汞溶液灭菌15 20min，用无菌水冲洗3 4次，取甘蔗茎尖顶部生长点3 5cm的幼嫩心叶作为脱毒组培用外植体。在无菌条件下，将外植体切成厚约I 2_的圆盘片，(1.1)将步骤(1.0)的外植体接种于愈伤诱导培养基(MS + 2,4-D (2^3) mg/L +蔗糖30g/ L +琼脂8 g/ L)上，再置于26 28°C的黑暗条件下培养15天后得到胚性愈伤组织，挑选淡黄色、分散性好的胚性愈伤组织继代培养一次，
(1.2)选取淡黄色，分散性好的继代后胚性愈伤组织转接入新的愈伤诱导培养基(同
1.1)上，进行活化培养。步骤(2)的含有目标基因的根癌农杆菌的活化与培养:
(2.0)挑取含有fer基因的根癌农杆菌菌株EHA105的单菌落；
(2.1)将步骤(2.0)的单菌落接入含Rif 50mg/L和Kan 50mg/L的Iml YEP液体培养基中，27 °C, 200 rpm培养条件下振荡培养3 4小时；
(2.2)取步骤(2.1)的菌液150 300 μ L，涂布于YEP固体培养基(含Rif 50mg/L和Kan 50mg/L)上，27 V下暗培养36小时，收集YEP固体培养基上的菌体；
(2.3)将所收集的菌体转入100 200 ml含AS 150 μ mol/L的MS液体培养基中，160 200 rpm振荡培养5 6小时，菌液的OD66tl值达到0.3 0.6为转化工程菌液，将制备好的转化工程菌液分装到三角瓶中备用。步骤(3)的真空渗透辅助农杆菌侵染甘蔗胚性愈伤组织:
(3.1)取步骤(1.2)活化培养3天的胚性愈伤组织，放置于超净工作台内无菌干燥滤纸上，吹风30分钟左右至表面干燥，将处理好的胚性愈伤组织转入步骤(2)中装有制备好的转化工程菌液的三角瓶中，80 rpm，22 28°C培养条件下共培养5 15分钟；后放置于已进行无菌处理的容器中，打开三角瓶的封口膜，给予0.05 Mpa的真空压力下辅助农杆菌侵染3分钟，重复2次；
(3.2)将步骤(3.1)辅助农杆菌侵染的愈伤组织转入覆盖滤纸的共培养固体培养基(MS + AS 150 μ mol/L)上，在温度为22°C下暗培养72小时；
(3.3)将步骤(3.2)中的愈伤组织转接入恢复培养基(MS+ 2,4-D 3.0 mg/L +Timentin 80mg/L + 鹿糖 30g/L)上，27 °C,暗培养 7 天。步骤(4)所述抗性材料的筛选与分化出苗:
(4.1)筛选培养，将经步骤(3.3)恢复培养后的愈伤组织转接入筛选培养基(MS +2，4-D 3.0 mg/L + Timentin 100 mg/L + PPT 2 mg/L + 鹿糖 30g/L ),2 周后，挑选抗性愈伤组织进行继续筛选培养；
(4.2)分化培养，将经2代筛选培养后的抗性愈伤组织转接到分化培养基(MS +6-BA 2.0 mg/L + NM 0.1 mg/L + Timentin 100 mg/L + PPT 2 mg/L + 鹿糖30g/L)上，在温度为27°C下、光强为15001UX、每天光照时间16小时的条件进行光照培养，分化出苗，获得抗性植株；
(4.3)抗性植株培养，将步骤(4.2)的生长到2 4厘米的抗性植株转入筛选培养基(MS + NAA 2.0 mg/L + Timentin 100mg/L + PPT 2 mg/L + 鹿糖 30g/L)上，15 天后抗性苗生根；
(4.4)生根培养，将步骤(4.3)的抗性苗转到生根培养基进行生根培养，生根培养基为:MS + NAA 2.0 mg/L + Timentin 100mg/L + PPT 2 mg/L + 蔗糖 50g/L，待根长 3 5cm时，将瓶苗在温室中炼苗5 7天；
(4.5)将步骤(4.4)的瓶苗假植于苗圃基质中，获得抗性植株，苗圃基质的中蛭石、珍珠岩和泥炭土的比例为1: 1:3。步骤(5 )抗性材料的PCR鉴定:
将获得的抗性植株采用CTAB法提取DNA，用Bar基因的特异引物进行PCR扩增，以pCAMBIA 3301质粒作为阳性对照，对抗性植株进行PCR检测；
取PCR阳性转基因植株叶片，提取RNA，根据目标基因特异引物进行RT-PCR分析；
取PCR阳性转基因植株叶片，用SDS方法大量提取DNA，进行southern blot分析。转基因植株的抗除草剂鉴定:以除草剂Basta 40mg/L溶液涂抹转基因植株和对照植株的顶部I 3叶片，3 5天后观察除草剂效果，结果表明，通过本本实施的步骤I 4获得的抗性植株具 有抗除草剂Basta 40mg/L性能。实施例2:
本实施例的各步骤与实施例1相同，本实施例与实施例1的区别在于:
步骤(3)的真空渗透辅助农杆菌侵染甘蔗胚性愈伤组织:
(3.1)取步骤(1.2)活化培养3天的胚性愈伤组织，放置于超净工作台内无菌干燥滤纸上，吹风30分钟左右至表面干燥，将处理好的胚性愈伤组织转入步骤(2)中装有制备好的转化工程菌液的三角瓶中，80 rpm，22 28°C培养条件下共培养5 15分钟；后放置于已进行无菌处理的容器中，打开三角瓶的封口膜，给予0.04 Mpa的真空压力下辅助农杆菌侵染2分钟，重复3次；
(3.2)将步骤(3.1)辅助农杆菌侵染的愈伤组织转入覆盖滤纸的共培养固体培养基(MS + AS 150 μ mol/L)上，在温度为22°C下暗培养72小时；
(3.3)将步骤(3.2)中的愈伤组织转接入恢复培养基(MS+ 2,4-D 3.0 mg/L +Timentin 100mg/L + 鹿糖 30g/L)上，27 °C,暗培养 7 天。转基因植株的抗除草剂鉴定:以除草剂Basta 40mg/L溶液涂抹转基因植株和对照植株的顶部I 3叶片，3 5天后观察除草剂效果，结果表明，通过本实施的步骤I 4获得的抗性植株具有抗除草剂Basta 40mg/L性能。
权利要求
1.一种真空渗透辅助农杆菌介导甘蔗心叶愈伤组织遗传转化的方法，包括如下步骤: (1)甘蔗心叶胚性愈伤组织的诱导及增殖； (2)含有目标基因的根癌农杆菌的活化与培养； (3)真空渗透辅助农杆菌侵染甘蔗胚性愈伤组织； (4)抗性材料的筛选与出苗； (5)抗性植株鉴定； 其特征在于: 步骤(1)所述甘蔗心叶胚性愈伤组织的诱导及增殖方法是: (1.0)取甘蔗茎尖生长点以上不大于6cm的幼嫩心叶作为外植体，无菌条件下，将消毒好的外植体切成0.5 2.5mm的圆盘片； (1.1)将步骤(1.0)的外植体接种于愈伤诱导培养基上，置于26 28°C的黑暗条件下培养，挑选生长状况良好的胚性愈伤组织继代一次； (1.2)挑步骤(1.1) 的生长状况良好的继代后胚性愈伤组织转接入新的愈伤诱导培养基上，进行活化培养； 愈伤诱导培养基是:MS + 2，4-D (I 4) mg/L +蔗糖30g/ L +琼脂(7 9) g/L ； 步骤(2)所述含有目标基因的根癌农杆菌的活化与培养方法是: (2.0)挑取含有fer基因的根癌农杆菌菌株EHA105的单菌落； (2.1)将步骤(2.0)的单菌落接入含Rif 50mg/L和Kan 50mg/L的Iml YEP液体培养基中，在温度为26 28 °C、震荡速度为200 rpm的条件下，培养3 4小时； (2.2)取步骤(2.1)的菌液 150 300 μ L，涂布于含 Rif 50mg/L 和 Kan 50mg/L的YEP固体培养基上，在温度26 28 1:下暗培养24 48小时，收集YEP固体培养基上的菌体； (2.3)将所收集的菌体转入100 200 ml含AS 150 μ mol/L的MS液体培养基，160 .200 rpm振荡培养5 6小时，菌液的OD66tl值达到0.3 0.6为转化工程菌液； 将制备好的转化工程菌液分装到三角瓶中备用； 步骤(3)所述真空渗透辅助农杆菌侵染甘蔗胚性愈伤组织方法是: (3.1)将步骤(1.2)活化培养3 7天后的胚性愈伤组织无菌干燥处理后转入步骤(2)中装有制备好的转化工程菌液的三角瓶中，胚性愈伤组织和转化工程菌液在温度为.22 28°C，震荡速度为80 100 rpm条件下共培养5 15分钟；后在0.02 0.06Mpa无菌真空压力条件下辅助农杆菌侵染2 4分钟，重复2 3次； (3.2)步骤(3.1)菌侵染后的愈伤组织转入覆盖滤纸的共培养固体培养基上，在温度为21 24°C下暗培养2 5天；共培养固体培养基是:MS + AS 150 μ mol/L ； (3.3)将步骤(3.2)中的愈伤组织转接入恢复培养基上，在温度为26 28 °C下暗培养 5 7 天，恢复培养基是:MS + 2, 4-D (2 3)mg/L + Timentin (50^100) mg/L + 蔗糖 30g/L ； 步骤(4)所述抗性材料的筛选与出苗的方法是: (4.1)筛选培养，将经步骤(3.3)恢复培养后的愈伤组织转接入筛选培养基，2周后，挑选抗性愈伤组织于筛选培养基上进行继续筛选培养；筛选培养基是:MS+ 2，4-D (2^3)mg/L + Timentin (50 200)mg/L + PPT (I 3)mg/L + 鹿糖 30g/L); (4.2)分化培养，将经步骤(4.1)2代筛选培养后的抗性愈伤组织转接到分化培养基上，在温度为26 28 1:下、光强为15001UX、每天光照时间16小时的条件进行分化培养，分化出苗，获得抗性植株，分化培养基是:MS + 6-BA (2^3)mg/L + NAA (0.Γθ.3) mg/L+ Timentin (50 ^200) mg/L + PPT (I 3)mg/L + 鹿糖 30g/L ; (4.3)抗性植株培养，将步骤(4.2)中生长到2 4厘米的抗性植株转入筛选培养基上，15天后抗性苗生根；筛选培养基是:MS + NAA (2 3) mg/L + Timentin (50 200)mg/L + PPT (I 3) mg/L + 鹿糖 30g/L ; (4.4)生根培养，将步骤(4.3)的抗性苗转到生根培养基进行生根培养；生根培养基，待根长3 5cm时，将瓶苗在温室中炼苗5 7天；生根培养基是:MS + NAA ( f 3) mg/L+ Timentin (50 200) mg/L + PPT (I 3) mg/L + 鹿糖 50g/L ; (4.5)将步骤(4.4)的瓶苗假植于苗圃基质中，获得抗性植株； 步骤(5)所述抗性植株鉴定的方法是: 将获得的抗性植株采用CTAB法提取DNA，用目标基因的特异引物进行PCR扩增，以pCAMBIA 3301质粒作为阳性对照，对抗性植株进行PCR检测； 取PCR阳性转基因植株叶片，提取RNA，根据目标基因特异引物进行RT-PCR分析； 取PCR阳性转基因植株叶片，用SDS方法大量提取DNA，进行southern blot分析。
全文摘要
本发明涉及植物基因工程技术领域，提出一种真空渗透辅助农杆菌介导甘蔗遗传转化的方法，其包括步骤(1)甘蔗心叶胚性愈伤组织的诱导及增殖；(2)含有目标基因的根癌农杆菌的活化与培养；(3)真空渗透辅助农杆菌侵染甘蔗胚性愈伤组织；(4)抗性材料的筛选与出苗；(5)抗性材料鉴定。本发明采用的真空渗透辅助农杆菌介导甘蔗遗传转化方法，在真空的情况下可促使农杆菌通过愈伤组织细胞间的空隙进入到深层的细胞，而且会在细胞的表面引起小伤口，致使植物分泌一些酚类物质以激活Ti质粒中T-DNA的剪切和转移，本发明完善了农杆菌介导的甘蔗遗传转化体系。与普通农杆菌介导法相比，本发明显著提高了甘蔗的遗传转化率。
文档编号A01H5/00GK103205459SQ20131008889
公开日2013年7月17日 申请日期2013年3月20日 优先权日2013年3月20日
发明者樊丽娜, 齐永文, 李奇伟, 邓海华, 劳方业, 李昱, 罗青文, 周文灵, 何慧怡, 陈月桂 申请人:广州甘蔗糖业研究所