专利名称：蛇床子素作为昆虫病毒增效剂在生物防治中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物防治技术领域，具体地说是涉及利用一种蛇床子植物的提取物作为昆虫病毒的增效剂在生物防治中的应用。
背景技术：
昆虫病毒作为一种生物杀虫剂，主要包括核型多角体病毒(NPV)和颗粒体病毒(GV)，因具有对宿主昆虫的致病性高、专一性强，对人畜和天敌安全，不污染环境，尤其是它能在害虫种群中形成流行病而长期控制虫口以及不易产生抗药性等明显优势，一直受到人们的关注。据统计，目前已经分离到的NPV超过300种，GV在70种以上，其中20多种被引入大田防治试验，10多种被制成商品杀虫剂。绝大多数NPV和GV病毒杀虫剂以鳞翅目(夜蛾类、菜蛾类等)重大害虫作为专一性防治对象。
然而，如同其它的微生物农药，昆虫病毒杀虫剂也存在杀虫速度较慢、杀虫谱窄和杀虫效率低等缺点，这在很大程度上束缚了其开发应用。为此，病毒增效剂就成了科研工作者的研究重点。已发现的病毒增效剂包括生物增效剂和化学增效剂。其中，生物增效剂以昆虫病毒增强素为主，主要来源于GV，也有来源于NPV、EPV(昆虫痘病毒)和CPV(质型多角体病毒)；而化学增效剂则以二苯乙烯类荧光增白剂为主，它们能提高NPV的杀虫速度和杀虫活性。虽然上述发现使病毒实用化的可能性提高，但两类病毒增效剂各自都存在一定的优缺点。其中，病毒增强素由于来源于昆虫病毒，作为一种生物增效剂，安全性高，但在生产过程中，病毒增强素和被增强病毒不能在同一宿主昆虫中增殖，需在两种不同的特异性宿主昆虫体内分别增殖后，再混合制剂、使用，这样就大大提高了生产成本，使病毒增强素作为增效剂难以推广应用。虽然通过基因工程构建了可表达增强素的重组病毒和转基因植物，但因表达稳定性以及转基因生物安全性等诸多因素，短期内也难以推广应用。二苯乙烯类荧光增白剂作为一种化学增效剂，增效谱广，增效活性较高，但由于其使用浓度也高(10000mg/L)，应用成本较大，尤其是环境安全性低，因而也不是理想的病毒增效剂。
蛇床子素(osthola，cnidiadin)是一种来源于伞形科植物蛇床Cnidium monnieri(L.)Cuss.果实的植物源提取物，化学名称为7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素，分子式为C15H16O3。蛇床子素作为一种广泛应用于医药上的植物源物质，有多种成熟的提取工艺，包括用95％乙醇、无水乙醇、丙酮、氯仿等溶剂或蒸馏水浸泡提取。我国青岛颐中星日有限公司、大兴安岭林格贝有机食品有限责任公司等生产供应10％-99％含量的蛇床子素产品。
蛇床子素已广泛应用于医学上，对心血管、生殖系统等疾病具有治疗作用；后发现蛇床子素在农业上可作为杀虫杀菌剂防治蚜虫等虫害及大蒜叶斑病等病害，亦可作为食品保鲜剂及防腐剂(发明专利申请号01127083.7蛇床子素在农业上的应用)。
发明内容
1、发明目的本发明的目的是开拓蛇床子素作为昆虫病毒防治夜蛾类害虫的增效剂用途，为生产上提供一种不仅提高昆虫病毒杀虫毒力、且环境安全性高、成本低的植物源增效剂。
2、技术方案一种蛇床子素作为昆虫病毒的增效剂在生物防治中的应用。
本发明人发现蛇床子素在试验浓度范围内(1-228mg/L)，单独使用对甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、甘蓝夜蛾、棉铃虫等夜蛾类害虫均无杀虫活性，但与NPV或GV联合应用时，可显著提高NPV或GV对上述害虫的杀虫活性。因此，本发明利用1-228mg/L蛇床子素作为昆虫病毒的新型增效剂，提高NPV和GV的杀虫毒力，其中较低浓度比高浓度的蛇床子素对昆虫病毒的增效作用更显著。以甜菜夜蛾为靶标害虫时，14-228mg/L蛇床子素对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)杀虫毒力的增效倍数为1.13-1.94倍，而1-7mg/L蛇床子素的增效倍数为2.17-5.33倍。以斜纹夜蛾为靶标害虫时，7mg/L蛇床子素对斜纹夜蛾核型多角体病毒(SlNPV)杀虫毒力的增效倍数达2.55-4.67倍，而1-228mg/L蛇床子素单用对甜菜夜蛾和斜纹夜蛾均无杀虫活性。单用7-228mg/L蛇床子素对甘蓝夜蛾无杀虫效果，而7mg/L蛇床子素和MbNPV混合使用时，对MbNPV的杀虫毒力有明显提高，增效倍数达5.71倍。蛇床子素亦提高GV的杀虫毒力。7mg/L蛇床子素可使八字地老虎颗粒体病毒(XcGV)对小地老虎的杀虫毒力提高2倍，而7-228mg/L蛇床子素单独使用时对小地老虎无杀虫活性。
3、有益效果本发明与病毒增强素和荧光增白剂相比，蛇床子素同时兼有它们的优点(1)由于蛇床子素来源于植物，系植物源天然物质，并已用于中医药，对人和高等动物安全，在生态环境中无化学残留问题；(2)增效活性高；(3)蛇床子素作为一种植物提取物，来源广泛，提取工艺简单成熟，作为病毒增效剂使用时实际用量低，应用成本显著低于现有的昆虫病毒增强素和荧光增白剂类增效剂；(4)用蛇床子素作为昆虫病毒的增效剂，可大大减少昆虫病毒的用量，在确保防治害虫效果的前提下，用蛇床子素增效的昆虫病毒杀虫剂比单独的昆虫病毒杀虫剂的应用成本大幅度降低、综合效益显著提高。该发明相对于传统的昆虫病毒杀虫剂和昆虫病毒增强技术及其相关产品，兼有高效、安全、经济等突出优势，将成为绿色农产品清洁生产的新型关键技术，推广应用后可产生显著的经济、生态和社会效益。
具体实施例方式
发明人例举的实施例的试验药剂、材料和增效测定方法如下。
(一)试验药剂和材料1、供试药剂AcNPV、SlNPV、MbNPV和XcGV等均为江苏省农业科学院植物保护研究所保存的昆虫病毒；20％(粗提液)和99％蛇床子素均为青岛颐中星日有限公司产品。
2、供试昆虫甜菜夜蛾为室内饲养多代的2龄和3龄幼虫，斜纹夜蛾为室内饲养多代的3龄幼虫，甘蓝夜蛾、地老虎等为田间采集幼虫经室内饲养1代的3龄幼虫。
(二)增效测定方法试验在29℃下进行，采用浸叶法测定。设系列浓度的AcNPV、SlNPV、MbNPV和XcGV单剂、蛇床子素单剂、以及不同浓度的昆虫病毒分别加不同终浓度的蛇床子素等处理。蛇床子素系列浓度分别以20％(粗提掖)和99％的蛇床子素配制。用打孔器将新鲜甘蓝叶片打成直径为1.5cm的圆形叶片，再将叶片浸入药液中2s后取出，分别置于24孔板内，待叶片晾干后接入供试昆虫，选择同一龄期大小较一致的幼虫，每孔1头。每处理2个板，共48头虫。同时设清水对照。处理后每天记录死亡虫数和活虫数，分别求得不同昆虫病毒单剂以及病毒单剂分别加不同浓度蛇床子素等处理的毒力回归方程和LC50，由LC50计算增效倍数。所有试验均重复4次。
实施例1、蛇床子素对AcNPV杀虫毒力的增效作用分别测定蛇床子素及AcNPV单剂对害虫的杀虫活性表明，无论是用20％蛇床子素粗提液还是用99％蛇床子纯品配制药液，单用蛇床子素1-228mg/L对甜菜夜蛾、斜纹夜蛾均无杀虫效果，而单用AcNPV 3.3×104-133×104PIB/ml对2龄甜菜夜蛾的杀虫效果为8.1％-84.2％，6.6×104-266×104PIB/ml对3龄甜菜夜蛾的杀虫效果为20.5％-95.2％(表1，2)。
表1 不同浓度蛇床子素对甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的杀虫活性龄期 浓度(mg/L) 粗提液的杀虫效果(％)纯品的杀虫效果(％)甜菜夜蛾 斜纹夜蛾 甜菜夜蛾 斜纹夜蛾2龄1 0 00 014 0 00 028 0 00 056 0 00 01140 00 02280 00 03龄1 0 00 014 0 00 028 0 00 056 0 00 01140 00 02280 00 0表2 不同浓度AcNPV对甜菜夜蛾的杀虫效果浓度(×104PIB/ml)杀虫效果(％)2龄3龄3.3 8.1-6.6 27.0 20.513.3 40.0 34.966.5 63.6 44.1133.084.2 50.0266.0- 95.2测定不同浓度的蛇床子素对AcNPV的增效作用表明，尽管单用1-228mg/L蛇床子素对甜菜夜蛾无杀虫活性(表1)，但它与AcNPV联合使用时，显著提高了AcNPV对甜菜夜蛾的毒力，其中较低浓度蛇床子素比高浓度蛇床子素对AcNPV的增效作用更明显，蛇床子素粗提液和纯品均表现出相近的增效作用。以3龄甜菜夜蛾幼虫为靶标害虫时，由20％粗提液配制的1mg/L和7mg/L蛇床子素对AcNPV的增效倍数分别为2.17倍和5.33倍，而14、56、114和228mg/L对AcNPV杀虫毒力的增效倍数均在2.0倍以下。由99％纯品配制的7mg/L、114mg/L蛇床子素对AcNPV杀虫毒力的增效倍数分别为3.39倍、1.33倍(表3)。
表3 不同浓度蛇床子素对AcNPV对甜菜夜蛾杀虫毒力的增效作用蛇床子纯度处理 斜率 LC50(95％CL)(×105PIB/ml) 增效比AcNPV2.65485.60(4.32-6.88) 1.00粗提液AcNPV+1mg/L 0.82372.58(1.50-3.92)* 2.17AcNPV+7mg/L 0.71191.05(0.82-2.41)**5.33AcNPV+14mg/L 1.73443.48(2.68-4.39)* 1.61AcNPV+56mg/L 2.06364.63(3.63-6.18) 1.21AcNPV+114mg/L2.01574.97(3.53-6.68) 1.13AcNPV+228mg/L1.92584.25(2.82-6.01)* 1.32纯品 AcNPV+7mg/L 0.93681.65(0.93-2.96)**3.39AcNPV+114mg/L1.25464.22(2.93-5.41)* 1.33注*和**分别表示与AcNPV单用相比达5％显著和1％极显著水平的差异，下同。
在作用于不同龄期的甜菜夜蛾幼虫时，蛇床子素粗提液对AcNPV均有显著的增效作用(表4)。作用于2龄和3龄甜菜夜蛾幼虫时，7mg/L蛇床子素单用无杀虫效果，但对AcNPV的增效倍数分别为2.32和2.57倍；而114mg/L蛇床子素的增效倍数分别为1.94和1.66倍，低于7mg/L低浓度蛇床子素对AcNPV的增效作用。
表4 蛇床子素对AcNPV作用于甜菜夜蛾的增效作用龄期处理 斜率 LC50(95％CL)(×105PIB/ml) 增效比2龄 AcNPV 1.3321 2.63(1.72-4.03) 1.00AcNPV+7mg/L 1.0069 1.14(0.96-1.34)*2.32AcNPV+114mg/L 1.4002 1.36(1.13-1.63)*1.943龄 AcNPV 1.2384 3.92(2.88-5.35) 1.00AcNPV+7mg/L 1.2878 1.53(1.23-1.89)*2.57AcNPV+114mg/L 1.4292 2.37(1.79-3.14)*1.66实施例2、蛇床子素对SlNPV杀虫的增效作用蛇床子素粗提液亦提高了SlNPV对斜纹夜蛾的杀虫毒力(表5)。单用7～114mg/L蛇床子素对斜纹夜蛾无效，但7mg/L蛇床子素可提高SlNPV对2龄和3龄斜纹夜蛾幼虫的毒力，增效倍数分别为4.67和2.55倍。
表5 蛇床子素对SlNPV作用于斜纹夜蛾的增效作用龄期处理 斜率 LC50(95％CL)(×106PIB/ml) 增效比2nd SlNPV 1.546917.39(13.43-22.25)1.00SlNPV+7mg/L1.20363.72(2.32-5.34)** 4.673rd SlNPV 1.357828.84(21.26-32.20)1.00SlNPV+7mg/L1.102311.30(2.45-3.79)* 2.55
实施例3、蛇床子素对MbNPV杀虫毒力的增效作用蛇床子素粗提液同样可以提高MbNPV对甘蓝夜蛾的杀虫毒力(表6)。单用7～228mg/L蛇床子素对甘蓝夜蛾无杀虫效果，而7mg/L蛇床子素与MbNPV混用时对MbNPV作用于甘蓝夜蛾的杀虫毒力有明显提高，增效倍数达5.71倍。
表6 蛇床子素对MbNPV作用于甘蓝夜蛾的增效作用处理 斜率 LC50(95％CL)(×106PIB/ml) 增效比MbNPV 1.485228.68(16.52-37.12)1.00MbNPV+7mg/L 1.15895.02(3.92-5.84)** 5.71实施例4、蛇床子素对XcGV杀虫的增效作用试验还发现，228mg/L以下蛇床子素粗提液对小地老虎无杀虫效果，但7mg/L蛇床子素对XcGV作用于小地老虎的杀虫毒力有1.97倍的增效作用。
表7 蛇床子素对XcGV作用于小地老虎的增效作用处理斜率 LC50(95％CL)(×107OB/ml) 增效比XcGV0.94858.45(6.58-9.86) 1.00XcGV+7mg/L 1.24154.29(3.12-5.84)*1.97综合以上实施例，可得出以下结论1、单用1-228mg/L浓度的20％蛇床子素粗提液或99％的蛇床子素纯品对甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、甘蓝夜蛾、小地老虎等夜蛾类害虫无杀虫效果。
2、1-228mg/L浓度的蛇床子素粗提液或纯品可显著提高NPV及GV对害虫的杀虫毒力，较低浓度的蛇床子素比高浓度蛇床子素的增效作用更显著，1-7mg/L蛇床子素的增效倍数为2-6倍，而14-228mg/L蛇床子素的增效倍数在1.1-2.0倍之间。
3、蛇床子素作为昆虫病毒的增效剂，可明显提高病毒杀虫剂的杀虫效果，从而大幅降低应用成本。
权利要求
1.蛇床子素作为昆虫病毒的增效剂在生物防治中的应用。
2.根据权利要求1所述的蛇床子素作为昆虫病毒的增效剂，其特征是蛇床子素的使用浓度是1-228mg/L。
全文摘要
本发明为一种植物源物质蛇床子素作为昆虫病毒的增效剂在生物防治中应用。蛇床子素来源于伞形花科植物蛇床果实的提取物，在1－228mg/L的蛇床子素单独使用时对斜纹夜蛾、甜菜夜蛾、甘蓝夜蛾等夜蛾类害虫无杀虫活性，但作为昆虫病毒的增效剂，分别与昆虫核型多角体病毒(AcNPV、SlNPV、MbNPV等)和颗粒体病毒(XcGV等)联合使用时，可显著提高昆虫病毒对害虫的侵染毒力。该增效剂来源广泛，提取工艺简单成熟，作为昆虫病毒的增效剂使用时用量低(1－228mg/L)，且低浓度的增效作用更强，并对生态环境安全。与现有的昆虫病毒增效剂相比，蛇床子素兼有安全、高效、经济等突出优点，在新型高效病毒杀虫剂的生产应用中，具有广阔的应用前景，可产生显著的经济、生态和社会效益。
文档编号A01N43/08GK1488252SQ0313233
公开日2004年4月14日 申请日期2003年8月15日 优先权日2003年8月15日
发明者方继朝, 郭慧芳, 王节萍, 刘宝生 申请人:江苏省农业科学院