专利名称：用胚状体进行紫花苜蓿快速无性繁殖的方法
技术领域：
本发明涉及植物繁殖方法，特别是一种用胚状体进行紫花苜蓿快速无性繁殖的方法。
背景技术：
紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是一种多年生异花授粉豆科植物，为世界重要的高蛋白绿色饲料作物，被誉为“牧草之王”，具有经济效益高，适应性广，生物固氮能力强，保持水土，改良土壤，生态功能齐全的特性，越来越受到人们的重视。由于紫花苜蓿的栽培品种为四倍体，传统育种工作困难较多。为此，利用现代生物技术育种成为品种改良的重要途径。因此，自20世纪70年代以来，苜蓿组织培养和遗传转化方面的研究工作从未间断。在目前常采用的较成功的苜蓿组织培养方法中，无论是液体培养还是固体培养大多为先诱导胚性愈伤、再诱导胚状体形成、最后形成完整植株的三步培养方法。此种培养过程不仅周期长(90天左右)而且多是几种基本培养基和激素配合使用，成本较高。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的用胚状体进行紫花苜蓿快速无性繁殖的方法，可以克服上述缺陷。它是采用4-5天苗龄的紫花苜蓿下胚轴作为外植体，在UM培养基上诱导和保持初生胚状体的形成，再以初生胚为外植体诱导形成次生胚，利用次生胚形成完整植株。由于次生胚畸形胚少、个体肥大，子叶饱满，因而其形成完整植株的比例较高。本发明只采用了两种激素，降低了实验成本，同时由于初生胚状体和次生胚状体通过调控都有形成完整植株的能力，从而不仅使得获得完整植株的时间缩短也使得完整植株的产率大大提高。
本发明是经过以下步骤1)无菌苗的培养将苜蓿种子在超净工作台内用75％酒精消毒10分钟，再用0.1％升汞消毒10分钟后，无菌蒸馏水清洗5遍，将种子放入无激素的1/2MS培养基中。光周期14小时/天，光强3000Lux，室温25-27℃条件下培养4-5天。
2)初生胚状体的诱导和继代取无菌苗的下胚轴放入含UM+2，4-D(2-3mg/L)+KT(0.25-0.50mg/L)+3％蔗糖+0.8％琼脂的培养基(初生胚诱导和继代培养基)(PH值5.7，下同)中，培养条件同上(下同)，2-3天开始有愈伤形成，16天后开始有胚状体形成，25天有大量初生胚状体产生。挑选初生胚状体转入次生胚状体诱导和继代培养基(MSO+3％蔗糖+0.8％琼脂)中进行次生胚状体的诱导和继代；将挑选初生胚状体后剩余的胚性愈伤转入新鲜的初生胚诱导培养基中可继续产生初生胚状体，从而可进行初生胚状体的继代。在第一次和第二次继代过程中初生胚状体大量产生，第三次继代后初生胚状体形成能力下降。此过程中如将初生胚状体直接转入成苗培养基(无激素的改良SH+2％蔗糖+0.7％琼脂)中诱导形成完整植株，诱导率低(34％)。
3)次生胚状体的诱导和继代将初生胚状体转入MSO+3％蔗糖+0.8％琼脂的次生胚诱导和继代培养基中，10％-15％的初生胚状体会形成完整植株，其余大部分初生胚状体上形成大量次生胚状体，平均为28个次生胚/初生胚，且次生胚畸形率少(小于8％)，个体肥大、子叶饱满，质量较初生胚状体有所提高。将次生胚转入新鲜的次生胚诱导培养基中后，有少部分会在20天左右直接发育成完整植株，大部分会在10天继续产生次生胚，因而上述次生胚诱导培养基也可作为次生胚的继代培养基。在此培养基中继代3次以后，次生胚的畸形率增加，可再由初生胚诱导形成次生胚从而使此过程得到循环。
4)完整植株的形成将次生胚转入无激素的改良SH+2％蔗糖+0.7％琼脂的成苗培养基中，次生胚不再形成，20天后统计成苗率为48％，35天后统计成苗率可达78％。
5)试管苗的移栽与成活松开培养瓶的封口膜进行练苗一星期左右，在超净工作台中将苗高在5厘米以上，根系健壮的完整植株挑出，流水洗去培养基后转入装有蛭石的营养钵中，保鲜膜封口后放入阴凉处10天，打开封口膜，30天后检查移栽成活率为90％，同时转入大田中种植。
本发明在苜蓿初生胚状体形成后可对其在形成完整植株和次生胚两个方向上进行调控，不仅可在短时间内获得完整植株，而且通过对次生胚诱导和分化的调控，可大大提高成苗效率。此方法简单、培养成本低、繁殖率高。仅通过下胚轴→初生胚状体→次生胚状体→完整植株单一一个循环，在70天时间天内的有效增值率为(初生胚状体数/外植体)×次生胚状体发生频率(85％)×(次生胚状体数/初生胚状体)×次生胚状体成苗率(78％)＝4×85％×28×78％＝74株，也就是一个下胚轴外植体在70天至少可形成74株完整植株，加之初生胚及次生胚继代后又使得胚状体数成倍增加，因此单个下胚轴外植体在一年中的增值率最低为338-450。
图1通过次生胚途径进行苜蓿组织培养的流程图。
图2苜蓿下胚轴在初生胚状体诱导和继代培养基中形成初生胚状体。
图3初生胚状体在次生胚状体诱导和继代培养基上形成次生胚。
图4次生胚在次生胚诱导和继代培养基上继代3代后畸形胚数提高。
图5初生胚状体在初生胚状体诱导继代培养基上继代后胚状体发生率提高。
图6次生胚状体发育形成完整植株。
图7植株的根系发育正常。
具体实施例方式
本发明突出的实质性特点和显著进步可以从下述实例中得以体现。但它们不会对本发明作任何限制。图1是通过次生胚途径进行苜蓿组织培养的流程图。
实施例1将产地为北京的保丰苜蓿种子在超净工作台内分别用75％酒精和0.1％升汞消毒10分钟后，无菌蒸馏水清洗5遍，将种子放入无激素的1/2MS培养基中。光周期14小时/天，光强3000Lux，室温25-27℃条件下培养4-5天后在超净工作台中切取无菌苗下胚轴放入已经过高压灭菌的盛有25ml UM+2，4-D(浓度为2-3mg/L)+KT(浓度为0.25-0.5mg/L)+3％蔗糖+0.8％琼脂培养基(PH值5.7下同)的锥形瓶中，每瓶5块，封口膜封口，橡皮筋系紧后放入恒温25-27℃的培养室中培养，每天光照14小时，光强为3000Lux，16-25天后有大量初生胚状体形成，平均每个外植体形成初生胚状体数为4个，最多可形成28个(附图2)；于超净工作台中挑选初生胚状体转入经灭菌处理的装有25ml MSO+3％蔗糖+0.8％琼脂培养基的锥形瓶中进行次生胚状体的诱导和继代(附图3、4)，每瓶5个胚状体，培养条件同上，7-15天内85％的初生胚状体上产生次生胚状体，平均每个初生胚上可形成28个次生胚状体，且形成的次生胚个体肥大、子叶饱满、质量较初生胚有所提高。其余初生胚可在25天内形成完整植株；将挑选初生胚状体后剩余的胚性愈伤转入新鲜的初生胚诱导培养基中可继续产生初生胚状体(附图5)；将次生胚分离后转入无激素的改良SH+2％蔗糖+0.7％琼脂的成苗培养基中，培养条件同上，可终止次生胚的形成，15-30天后产生大量完整植株(附图6)。若将次生胚转入新鲜的MSO+3％蔗糖+0.8％琼脂培养基中后，有少部分会在20天直接发育成完整植株(附图7)，大部分会在10天继续产生次生胚。单个下胚轴外植体在一年中的增值率最低为338-450。
实施例2将产地为北京的中苜一号苜蓿种子在超净工作台内分别用75％酒精和0.1％升汞消毒15分钟后，无菌蒸馏水清洗5遍，将种子放入无激素的1/2MS培养基中。光周期14小时/天，光强3000Lux，室温25-27℃条件下培养4-5天后在超净工作台中切取无菌苗下胚轴放入已经过高压灭菌的盛有25ml UM+2，4-D(2-3mg/L)+KT(0.25-0.5mg/L)+3％蔗糖+0.8％琼脂培养基(PH值5.7下同)的锥形瓶中，每瓶5块，封口膜封口，橡皮筋系紧后放入恒温25-27℃的培养室中培养，每天光照14小时，光强为3000Lux，28天有初生胚状体形成，初生胚状体诱导率(初生胚状体数/外植体数×100％)为300％，最多可形成40个；于超净工作台中挑选初生胚状体转入经灭菌处理的装有25ml MSO+3％蔗糖+0.8％琼脂培养基的锥形瓶中进行次生胚状体的诱导和继代，每瓶5个胚状体，培养条件同上，10天左右45％的初生胚状体上产生次生胚状体，平均每个初生胚上可形成24个次生胚状体，且形成的次生胚个体肥大、子叶饱满、质量较初生胚有所提高。其余初生胚大部分可在25天内形成完整植株；将挑选初生胚状体后剩余的胚性愈伤转入新鲜的初生胚诱导培养基中可继续产生初生胚状体；将次生胚分离后转入无激素的改良SH+2％蔗糖+0.7％琼脂的成苗培养基中，培养条件同上，可终止次生胚的形成，15-30天后84％的次生胚产生完整植株。若将次生胚转入新鲜的MSO+3％蔗糖+0.8％琼脂培养基中后，有少部分会在20天直接发育成完整植株，大部分会在10天继续产生次生胚，因此可进行次生胚的继代。单个下胚轴外植体仅通过下胚轴→初生胚状体→次生胚状体→完整植株单一一个循环，在70天时间天内的有效增值率为24株，加之初生胚及次生胚继代后又使得胚状体数成倍增加，因此单个下胚轴外植体在一年中的增值率最低为125。
实施例3将产地为天津的艾菲尼特苜蓿按保丰苜蓿和中苜一号苜蓿相同的实施方式进行初生胚状体及次生胚状体的诱导和继代。在初生胚诱导培养基中每个下胚轴外植体长出初生胚状体的比率为44％。将长出的初生胚状体转入次生胚诱导培养基中，80％的初生胚会形成次生胚，平均为18个次生胚/初生胚，最多可形成24个。将次生胚转入同上述实施例相同的成苗培养基中，30天后统计形成完整植株率为78％。因此艾菲尼特苜蓿单个下胚轴外植体仅通过下胚轴→初生胚状体→次生胚状体→完整植株单一一个循环，在70天时间天内的有效增值率为44％×80％×18×78％＝5株。加之初生胚及次生胚继代后又使得胚状体数成倍增加，因此单个下胚轴外植体在一年中的增值率最低为26株。应当指出的艾菲尼特苜蓿为一较难再生的品种，本发明人以液体的SH培养基、固体的MSH培养基、UM培养基、MS培养基为基本培养基，附加不同类型的激素采用传统的三步培养法对其进行胚状体的诱导，均未能使其胚状体发生率得到提高。由此可见，诱导次生胚，利用次生胚形成完整植株是艾菲尼特苜蓿进行快速无性繁殖的好方法。
上述3个实施例说明本发明中的新方法具有一定的可操作性和重复性，可在苜蓿的生产和科学研究中进行应用。
权利要求
1.一种用胚状体进行紫花苜蓿快速无性繁殖的方法，其特征在于包括以下步骤1)无菌苗的培养将苜蓿种子用75％酒精消毒10分钟，再用0.1％升汞消毒10分钟后，水洗5遍，放入无激素的1/2MS培养基中，光周期14小时/天，光强3000Lux，室温25-27℃条件下培养4-5天；2)初生胚状体的诱导和继代取无菌苗的下胚轴放入PH值5.7，UM+2，4-D(浓度为2-3mg/L)+KT(浓度为0.25-0.5mg/L)+3％蔗糖+0.8％琼脂培养基中培养，光周期14小时/天，光强3000Lux，室温25-27℃条件下培养25天左右，挑选初生胚状体转入MSO+3％蔗糖+0.8％琼脂的和继代进行次生胚状体的诱导和继代；3)次生胚状体的诱导和继代将初生胚状体转入PH值5.7，MSO+3％蔗糖+0.8％琼脂的次生胚诱导和继代培养基中培养，光周期14小时/天，光强3000Lux，室温25-27℃条件下培养10天左右；4)完整植株的形成将次生胚转入无激素改良SH+2％蔗糖+0.7％琼脂的成苗培养基中，PH值5.7，光周期14小时/天，光强3000Lux，室温25-27℃条件下培养20-35天；5)试管苗的移栽与成活松开培养瓶的封口膜进行练苗一星期，取完整植株苗用流水洗去培养基后转入装有蛭石的营养钵中，保鲜膜封口后放入阴凉处10天，打开封口膜，30天后转入大田中种植。
2.按照权利要求1所述的用胚状体进行紫花苜蓿快速无性繁殖的方法，其特征在于将初生胚状体转入新鲜的次生胚状体诱导培养基中10天可形成大量次生胚状体。
3.按照权利要求1所述的用胚状体进行紫花苜蓿快速无性繁殖的方法，其特征在于将次生胚转入新鲜的成苗培养基中培养20-30天直接发育成完整植株。
4.按照权利要求1所述的用胚状体进行紫花苜蓿快速无性繁殖的方法，其特征在于所述的初生胚状体在初生胚诱导和继代培养基中继代3次。
5.按照权利要求1所述的用胚状体进行紫花苜蓿快速无性繁殖的方法，其特征在于所述的次生胚状体在次生胚诱导和继代培养基中继代3次。
6.按照权利要求1所述的用胚状体进行紫花苜蓿快速无性繁殖的方法，其特征在于所述的完整植株苗是苗高在5厘米以上的根系健壮的完整植株。
全文摘要
本发明涉及植物繁殖方法，特别是一种用胚状体进行紫花苜蓿快速无性繁殖的方法。以下胚轴作为外植体，以UM+2，4－D(2－3mg/L)+KT(0.25－0.5mg/L)作为初生胚诱导和继代培养基，将初生胚转入MSO培养基中诱导和继续次生胚形成。次生胚个体肥大，子叶饱满，在改良的SH培养基中发育成完整植株的比例高(78％)。该方法周期短，成本低，可大大提高紫花苜蓿组织培养中的成苗效率，年有效增值率最低为1∶338－450。
文档编号A01H4/00GK1618279SQ20041001986
公开日2005年5月25日 申请日期2004年7月1日 优先权日2004年7月1日
发明者王勇, 孙艳香, 李德森, 渠荣达, 王淑芳, 夏时云 申请人:南开大学, 天津市农业生物技术研究中心