用于对植物胚芽进行收获和多级筛分的自动化系统和方法

专利名称：用于对植物胚芽进行收获和多级筛分的自动化系统和方法
技术领域：
本发明针对人造种子，尤其是用于自动收获和多级筛分大量生产的植物胚芽以确认适合用于人造种子的胚芽的一种方法和系统。
背景技术：
通过组织培养来对挑选的植物品种进行繁殖在商业上取得成功已经很多年了。该技术能够对挑选出的具有相同遗传基因的观赏植物、农业植物和森林物种进行大规模生产。森林物种中的木本植物也许造成了最大的挑战。在20世纪70年代，在松类上使用器官形成技术得到了成功，该技术的特征在于，将胚芽或者其它器官放在培养基上，胚芽或者其它器官最终将在培养基上复制多次。将新长成的胚芽放在能够诱导其生根的不同培养基上。培养基上生根的胚芽被栽种到土壤中。
虽然松类器官形成技术是一个突破，但是，由于需要管理的工作量大，所以成本较高。仍然存在着对可能产生的基因变性的担忧。十年后，体细胞胚胎形成技术取得了巨大的成功，成为了松类组织培养的重要方法。利用体细胞胚胎形成技术，将外植体放在一个初始培养基上，外植体通常是一粒种子或者种子胚芽，外植体在培养基上将繁殖出大量具有相同基因的未成熟胚芽。这些都可以在培养基上保持很长一段时间并繁殖成所需要的无性系。最后，将未成熟的胚芽放在生长培养基上，未成熟的胚芽在这里生长为成熟种子胚芽的体细胞模拟体。与本描述中使用的方法一样，体细胞胚芽是一种通过全能植物细胞的实验室培养或者通过诱导裂生多胚技术而长成的植物胚芽，这种植物胚芽与合子胚相反，合子胚是从相应植物种子中取出的植物胚芽。这些胚芽经过单独挑选然后放到萌芽培养基上继续生长。另外一个方法是，胚芽可以用于人工种子中，即通常所说的人造种子。
当前，有很多关于植物胚形成的一般技术文献和越来越多的专利文献。在授予Gupta等人的第5,036,007和5,236,841号、授予Robets的第5,183,757号、授予Attree等人的第5,464,769号以及授予Gupta等人的第5,563,061号美国专利文献中都可查到松类组织培养方法的例子。此外，在授予Carlson等人的第5,701,699号美国专利中可查到人造种子的一些例子。特此引用这些专利文献披露的内容。扼要地说，一粒典型的人造种子由一层种皮(被膜)构成，种皮由各种材料比如纤维质制造，里面装入人工合成配子体(一种发芽培养基)，然后，在里面放入一颗被管状限制器包围着的胚芽。当人造种子种入土壤中以后，种皮里面的胚芽长出根系，最终在发芽的过程中将限制器连同种皮一起脱掉。
在胚胎形成工序中，从适合于发芽的胚芽的生长培养基上选择性地收获就是劳动密集并受到主观支配的各步骤中的一个步骤(例如适合用于人造种子)。从成熟培养基中得到的胚芽可能处在成熟和生长的很多阶段。利用很多直观估计的筛分标准将那些最有可能成功发芽并生长成为正常植物的胚芽优先挑选出来。一个熟练的技术人员对每个嵌在生长培养基中的胚芽的形态学特点，如胚芽大小、形状(比如轴对称)、子叶的生长、表面纹理、颜色以及其它特征进行检查，并通过人工用镊子将合格的胚芽从生长培养基上摘下，摘下的合格胚芽按照二维阵列方式被小心地放在托盘中进行进一步的处理，这是一个高度熟练而且单调乏味的体力劳动，即费时又昂贵。此外，当最终需要的产量为数以百万的植物时，这个步骤就成为一个重要的生产瓶颈。
曾经有人提出使用某些类型的用于胚芽选择的仪表图像分析装置来补充或者替代上述的直观估计。比如，PCT申请PCT/US00/40720(WO 01/13702 A2)中披露了一种用于人造种子并且包括成像照相机的胚芽传输系统，该成像照相机能够获取并以数字方式存储胚芽图像，然后将图像发送到计算机，该计算机使用一种分级方法，根据预定的参数(轴对称、子叶生长、表面纹理、颜色等等)并按照它们的合意性(即发芽并生长成一般植物的可能性)来对胚芽进行分级，PCT申请PCT/US99/12128(WO 99/63057)中披露了这种分级方法。然后这些被划分为合格的胚芽被小型机器人抓取及放置系统拿来插入到人造种子中。特此引用两个PCT专利申请披露的内容。
虽然仪器成像分析系统以及随后的将合格胚芽自动插入人造种子的操作在增加胚形成工序的效率方面取得了成功，但是仍然没有一个完全自动化的工艺，能够进行胚芽收获(比如，将胚芽从生长培养基上摘下)，能够根据胚芽的尺寸/形状对胚芽进行分级并将它们挑选到独立单元中(比如，除去不合格的组织或者其它碎片)，并且能够根据人造种子的合意性进行分级，以用到人造种子中。换言之，还没有一个自动工艺，能够替代目前将生长培养基上将合格胚芽摘下并把它们放入适合于进行进一步成熟处理的阵列中的手工操作。本发明提供一个完全自动化的体细胞胚收获工艺，它能够替代目前的手工操作。

发明内容
本发明提供了一种用于自动收获植物胚芽的方法和系统。根据本发明的一个方面，本发明的自动收获法在多个筛分步骤中对植物胚芽进行筛分，以确定适合用于人造种子中的胚芽，即，不但在饱满程度上适合用于人造种子(尺寸不是太大也不是太小，没有太大的弯曲度)，而且从质量上也认为很可能发芽并生长成为正常植物。自动收获法通常包括三个步骤。第一，根据植物胚芽的尺寸/形状进行自动分类并将它们分别挑选到独立装置中。例如，使用水成液将胚芽从生长培养基上冲洗下来(比如，从生长垫上冲洗下来)并通过多孔材料对胚芽进行筛分。在筛分过程中，对胚芽进一步喷洒水成液，以便更容易地通过多孔材料的孔洞来去掉和冲走任何不需要的材料，比如尺寸过小的胚芽、组织、残余胚柄块(ESM)。在一个优选实施例中，多孔材料被做成一条移动多孔传送带，以便经过分类和挑选的胚芽同时被输送到后面的分类阶段。第二，使用第一分级方法对经过分类和挑选的胚芽进行分级。例如，用照相机对每个胚芽进行成像，然后利用图像来确定胚芽的尺寸/形状。那些在预定尺寸/形状范围以内的胚芽就被认为通过了第一分级法。第三，至少要对那些已经通过第一分级法筛分的胚芽利用第二分级法进一步挑选出可用于人造种子的胚芽。例如，可以使用根据胚芽的假定发芽势(即，成功发芽的可能性)来对胚芽进行分级的预开发分级算法来对第一尺寸/形状分级法中分析过的相同图像进行分析，以确定很可能发芽的那些胚芽。通过第一和第二分级法筛分的胚芽被确定为适合用于人造种子。
根据本发明的一个方面，当经过分类和挑选的胚芽在传送带上运输时，就沿着分级传送带实施第一和第二分级方法。在某些分级方法中，优选地，通常在分级传送带上将胚芽排成单行。还提出了实现胚芽单行布置的各种方法。例如，分级传送带可以垂直于多孔传送带布置，而胚芽就在多孔传送带上进行分类和挑选。根据这种布置，经过分类和挑选的胚芽运送到多孔传动带的末端就会因为重力从那里掉到分级传动带上，并在分级传送带上形成单行布置。为了在单行布置的胚芽间形成足够的间距，将胚芽从生长培养基上冲洗到多孔传送带上的初始速度，或者多孔传动带的速度可以根据胚芽从多孔传送带掉到分级传送带上的实际速度进行调节，这个实际速度通过合适的光学扫描系统进行观测。
根据本发明的另一方面，该方法还包括将那些没有通过第一或者第二分级法筛分的不合格胚芽从分级传送带上自动去掉的这个步骤。例如，一个计算机控制的空气或者液体喷嘴就可以用来将不需要的胚芽喷出去。喷嘴启动的准确时间可以通过计算机进行控制，因为，根据照相机对每个胚芽成像的激发时间以及分级传送带的速度，能够准确知道每个不合格胚芽的位置。
仍根据本发明的另一方面，该方法还包括将那些已经通过第一、第二分级法筛分的合格胚芽从传送带上自动移走的这个步骤。在一个实施例中，合格的胚芽被自动传递到一个接收面上，形成一个均匀间隔的阵列，适合于进一步进行各种成熟处理。例如，接收面可以通过一个安装到一个电动化平台上的托盘提供，平台做成能够调节托盘相对于分级传送带的位置。根据每个合格胚芽从分级传送带上落下时的已知位置来调节托盘的位置，就可以将合格胚芽接收到托盘中，形成一个均匀间隔的二维阵列。
仍根据本发明的又一方面，该方法包括该将那些已经通过一个或者多个初始分级法筛分的合格胚芽从传送带上自动移走的这个步骤。例如，可以使用小型机器人系统来拾起那些已经确认在可接受尺寸/形状范围内的胚芽，并准确地将它们放在接收托盘上均匀间隔的二维阵列中。此时，将胚芽统一定向，比如让它们的子叶末端对着同一方向。托盘中正确定向并且相互间间隔均匀的胚芽就可以送去进行进一步的处理，例如，烘干以及随后的进一步的分级法筛分。然后，这些在托盘中正确定向并且相互间间隔均匀的胚芽就可以送去并插入到人造种子中，更有利的是，将人造种子按照相对应的均匀间隔阵列进行布置。
在多个筛分阶段中对胚芽进行分级以实现高效的胚芽筛分。例如，首先使用相对简单而且耗时少的第一分级方法来对胚芽进行分级，就能够减少转送到第二分级法进行筛分的胚芽的数量，第二分级法更加复杂而且耗时。因此，通过仔细选择要包含的合适的分级方法，就能够以高效利用时间的方式实现胚芽更严格的选择和有区别的分级。同样，本发明提供了一个完全自动化的收获体细胞胚的工艺，该工艺包括对胚芽就分类和挑选(从把胚芽从生长培养基上取下开始)，根据胚芽的假定发芽势对经过分类和挑选的胚芽进行分级，并进一步把这些划分为合格的胚芽布置成适合于进行进一步成熟处理的方式，比如，在托盘上布置成均匀间隔的二维阵列。因此，本发明的自动收获方法和系统能够代替目前从生长培养基上摘下合格胚芽的手工操作。
附图简述结合附图并参考详细描述，对同样的内容作更好的了解，本发明的上述各方面以及随之而来的很多优点就更加容易理解了。其中


图1A显示了本发明中一个用于植物胚芽自动收获和多级筛分的系统；
图1B显示了本发明中一个用于植物胚芽自动收获和多级筛分的可选择系统；图2是一个流程图，该流程图显示了本发明中一种用于自动收获及在多级筛分系统中筛分胚芽的方法的总流程；和图3A和3B显示了本发明中用于对胚芽进行自动分类和挑选的可选方法。
优选实施例详述本发明涉及一种在日益完善的多级筛分系统中用于自动收获和筛分大规模生产的胚芽，比如体细胞胚，优选地用于复杂性递增的多级步骤，以确定那些适合用于人造种子的胚芽的方法和系统。如这里使用的那样，一个适合用于人造种子的胚芽意味着胚芽不但在生物化学上成熟(即，很可能发芽并生长成为正常的植物)，而且在形态上或者饱满程度上适合用于人造种子(即，具有适合于插入到人造种子中的尺寸/形状)。
参考
图1A，在生长室10，体细胞胚已经从胚柄块(ESM)中长出，并且已经支撑/悬挂在生长表面16上。生长表面可以通过一张生长垫提供，如图示的那样，或者通过任何其它适当的生长培养基来提供，包括凝胶形式的培养基，或者还可以通过放在生长培养基上的插入表面提供，比如不锈钢网。以下描述阐述了一个利用生长垫来提供生长表面的例子，应当理解的是，本发明中使用的生长表面是指任何一个能够支持或者悬挂从胚柄块ESM中生长出的胚芽的表面。
生长体细胞胚的方法已是公知，并且在各种出版物中进行了描述，如同上面在背景部分讨论的那样。合格的胚芽与未完全生长的胚芽、异常生长的胚芽、尺寸过大或者过小的胚芽以及其它非胚芽植物材料片段一起，以不同的程度附在并插入到生长垫16上的胚柄组织和剩余的发育不全的胚柄块ESM中(或者培养材料上)。悬挂在生长垫16上的胚芽被送到收获和分级室12，在这里，将(插入到培养材料上)的胚芽从生长垫上取下，然后进一步进行自动分类、挑选，并根据它们合意性进行分级。分级可以采用日益完善的多级筛分系统但是耗时的分级方法来完成，以实现日益增多的更高的选择准确性和操作效率。那些划分为合格的胚芽被送去接受进一步的成熟处理，例如，送到后生长处理室14(图示实施例中的干燥室)进行干燥用于储存和以后用到人造种子中。本发明专门针对在收获和分级室12中使用的胚芽自动收获和分级工艺。优选地，在潮湿清洁的空调房中进完成收获和分级操作，以保持处理的胚芽的发育能力。
参考图2，在一个实施例中本发明的方法包括四个步骤。第一，参考
图1A和图2中的步骤“A”，利用压力被控制的水成液喷雾(比如，等压营养液)将胚芽从生长表面16(比如，生长垫表面)上冲下来，水成液由一个恰当布置的喷嘴18中喷出。这个冲刷的过程把包括胚芽在内的培养材料与生长表面16分开，但是至少有些胚芽仍然插在或者附在胚柄组织、剩余发育不全的胚柄块ESM、以及这个位置的其它材料上。如图示，可以将生长表面16放在一个倾斜的表面20上，使得包括胚芽在内的培养材料更容易通过重力朝贮液器22(或者是一个水力旋流器型的分离器)方向冲刷下去。贮液器22的底部26有一个伸长的开口(裂缝)，这个开口沿着垂直于传送带24的方向延伸并贯穿传送带24的整个宽度，使得胚芽(插在或者附在胚柄组织或者剩余胚柄块ESM上的胚芽)能够以铺展方式或者局部均匀的方式放入到传送带24上。另外一个选择是，被水散开的胚芽从贮液器22流出的速度可以通过其它各种方法，如收缩、调节流程长度等方法进行调节，从而将胚芽按照规定的局部均匀方式放入到传送带24上面。
下面参考步骤“B”，传送带24由多孔传动皮带28做成，由一个合适的马达进行驱动(图中未显示)，传送带24通过筛分来对胚芽进行分类和挑选。如同这里使用的那样，“分类和挑选”是指根据它们的尺寸/形状对胚芽进行初步分类，并将胚芽分离到独立装置中，例如将胚芽分开，以及将任何不需要的材料与每个胚芽分开。举例来说，使任何小尺寸的材料比如小尺寸胚芽和碎片从孔中掉下去，多孔传送带28的筛分就可以完成分类和挑选。
特殊情况下，在多孔传送带28上，仍然插在胚柄组织和剩余胚柄块ESM上的胚芽就可以进一步用第二喷嘴30的水成液进行喷射，使胚芽(和其它附着材料)在水成液中进一步分散开。液体喷雾使附着的胚柄组织和剩余胚柄块ESM与胚芽分开，然后冲走并通过多孔带28落下。任何小尺寸的或者未完全生长的胚芽也将通过多孔带28落下。在一个实施例中，传送带24可以是振动型传送带，例如传送带技术领域已经公知的类型，使分类和挑选处理更加容易进行。任何通过多孔带28落下的材料都将被收集到设在多孔带28下方的废物接收器32中。可选地，可以将第二条粗糙多孔带(图中未显示)与设有第一多孔带28的第一传送带24相连，将第二粗糙多孔带设在第一多孔带28的前面以便将尺寸过大的胚芽和其它尺寸过大的材料片段带走。因此，只有这些挑选出的具有需要尺寸/形状的胚芽仍然留在第一多孔带28上，这些胚芽或多或少都去掉了胚柄组织和其它细小的植物材料。通过调节多孔带28(以及任何其它附加多孔带)的网孔尺寸/形状，只有这些在需要尺寸/形状范围内的胚芽才能被选中。应当指出的是，虽然优选地使用多孔传动带，因为它们同时对胚芽进行筛分和输送(到下一阶段)，但是作为对上述一条或多条多孔传送带的其它选择，也可以使用一个或者多个金属网或者其它筛孔，比如振动倾斜筛网。
如上所述，在步骤“A”“B”的过程中，不同的背景(包括合格的胚芽、不合格的胚芽、胚柄组织、剩余胚柄块ESM、以及其它植物材料)在水成液中被分散开，而且在物理作用力(比如，筛分作用力)的作用下，这个背景的各组成成分容易散开，物理作用力根据胚芽物理特性(质量、尺寸、形状、比重、阻力系数、可湿性等等)对组成成分的作用不同。其结果是，将细小的植物材料和附有胚芽的胚柄组织除掉，降低其它任何不需要成分的数量，生产出只包含经过挑选而且完全不带胚柄组织的胚芽的群体。
在有喷雾辅助的筛分过程之后，参考步骤“C”，在第一传送带24的末端，经过分类和挑选的胚芽在重力作用下落到另外一条传送带上，或者落到分级传送带34上。分级传送带34通常垂直于第一传送带34布置，以使落下的胚芽将沿着选择传送带34的长度方向成为一行，这样适合于后面对胚芽进行成像。如果胚芽容易粘在第一传送带24上不容易落下，可通过各种方法帮助胚芽与第一传送带24分开。例如，可以通过设在多孔带28下面靠近第一传送带24末端的空气/液体喷嘴(比如，营养液的柔和喷流，或者一阵空气——图中未显示)、或者通过一条垂直设在第一传送带24上方并且靠近末端35的细小振动金属丝来帮助移动胚芽，以消除表面张力并将胚芽敲落到第一传送带24上。另外一种选择方法，可以将一台干燥机靠近第一传送带24布置，当胚芽下降到第一传送带24上面时进行干燥。
为了后面成像的目的，胚芽在分类传送带34上相互间被充分地隔开。为了使单行36中的胚芽之间有足够的间隔距离，可以调整将胚芽从生长表面16冲下的初始速度。同样，和上面所讨论的一样，可以调节贮液器22(或者水力旋流器型分离器)的结构，以实现胚芽可控地分配到第一传送带24上，以及胚芽可控地从第一传送带24落到分级传送带34上。虽然图示中贮液器22设在
图1A中喷洒筛分工艺的上游，但是应当理解，贮液器22可以设在喷洒筛分工艺的下游，靠近第一传送带24末端35的地方，以便接收胚芽并可控地使胚芽从第一传送带24落到分级传送带34上。如同另一个例子，可以将一个通过计算机40控制的电子胚芽位置测绘仪(图中未显示)设在靠近喷洒筛分工艺的第一传送带24下游末端35的位置上。胚芽位置测绘仪由一个光学传感器和探测器组成，用来在胚芽被输送到第一传送带24上的时候确定每个胚芽的位置。计算机40根据从胚芽位置测绘仪接收到的信息，连续调节第一传送带24和/或者分类传送带34的皮带速度，以实现胚芽从第一传送带24落到分级传送带34的均匀落下速度。上述的任何方法都可以结合在一起使用。例如，设在第一传送带24末端35的胚芽位置测绘仪可以用来控制胚芽从生长表面16冲下的初始速度。同样，当胚芽被放入到第一传送带24上时，任何用于使胚芽隔开足够距离的，本领域一般技术人员对此显而易见的方法都可以使用。
在另外一个实施例中，利用被液体散开的胚芽沿着管道流动就可以获得成像时首选的单行布置方式。特别地，参考图3A，利用一个适当布置的喷嘴喷出的水成液，将胚芽从生长表面16上冲下，然后进入贮液器22中，如
图1A中所示实施例。贮液器与具有适当直径的管道21相连，优选地，被液体散开但仍然与其它组织、剩余胚柄块ESM、植物碎片缠绕在一起的胚芽以预先确定的可控速度流动，然后流出到多孔传送带25上。在一个实施例中，管道21非常清澈，所以沿着清澈管道21布置的光学扫描仪23可以观察到管道21中的流动情况，从而为胚芽从生长培养基上冲下的速度提供反馈，以保证通过管道21的材料(例如，胚芽)之间所需的间隔距离。与前面的一样，传送带25至少上游部分是多孔的，在喷嘴30喷出的水成液的进一步推动下，使得任何尺寸较小的胚芽以及其它细小材料(胚柄组织、剩余胚柄块ESM等)都通过皮带25落下。如图示，因为从管道21中分配的培养物物流一般在多孔传送带25上排成一行，所以经过喷洒筛分工艺后仍然留在传送带25上的胚芽就已经是单行布置方式34了。因此，胚芽可以直接在相同的传送带25上面继续进一步的分级，例如，由照相机38进行图像获取以及由喷射器42对不合格胚芽进行的选择性去除，这两个操作都由计算机40控制。胚芽最后从传送带25的末端落到一个接收盘54中，如同下面将更加充分描述的那样。
作为另外又一个获得单行布置的方法，参考图3B，可以使用一个流动血细胞计数器来对胚芽进行分类和挑选。在这个实施例中，使用适当布置喷嘴18喷出的水成液将胚芽从生长面16上冲下，然后流到贮液器22中，就象前面的实施例那样，然后，胚芽穿过清澈管道21。将一台本领域公知的流动血细胞计数器(或者细胞分离器)27沿清澈管道21布置，以便观察并将合格的胚芽从其它材料如太小/太大的胚芽、胚柄组织、剩余胚柄块ESM分开。
简短地说，流动血细胞计数器根据光学传感器27a观察到的细胞特性来区分在液体中输送的不同细胞，然后根据喷墨技术，使用转向器27b，进一步利用静电将细胞分类(分开)，即，偏转含有靶细胞并且经过选择性充电的液滴。在图示实施例中，用流动血细胞计数器27对满足预定尺寸/形状标准的胚芽进行分类并将它们分离到分级传送带34上，而其它材料比如太小或者太大的胚芽以及胚柄组织和剩余胚柄块ESM就落到废物接收器29中。因此，流动血细胞计数器27不但对胚芽进行分类和挑选，而且还将它们成单行地放到分级传送带34上。
回头查阅
图1A和2，在步骤“C”中，优选地，根据胚芽的合意性，对经过分类和挑选然后在分级传送带34上放成单行，而且相互之间间隔出足够距离的胚芽进行分级。例如，每个胚芽都可以通过设在分级传送带34旁的照相机进行成像。每个胚芽的图像被传输到计算机40进行分析，然后根据一个或者多个高速算法对胚芽进行分级。
在一个实施例中，胚芽的每个图像(单色或者彩色)都要分两个步骤进行分析。第一，参考图2，方框46，使用一个适当的算法来识别那些不能满足人造种子的基本尺寸和形状标准的胚芽。第二，参考方框48，一个预开发的分级模型，比如上面讨论过的PCT申请PCT/US99/12128(WO 99/63057)的专利中披露的那些模型，用来分析剩下的胚芽(即，满足第一尺寸/形状标准的胚芽)以识别那些发芽可能性小的胚芽(缺乏发芽势)。简要的说，根据已经获得了图像和实际发芽数据的胚芽抽样总体，就可以开发出合适的分级模型。在一个优选实施例中，利用一个根据胚芽的假定发芽势来对胚芽进行分级的预开发分级模型来对第一尺寸/形状分级步骤中使用过的相同图像进行分析，以使一张图像能够同时在第一和第二分级步骤中使用。参考
图1A，根据照相机38摄制的图像。进行胚芽实际分级和其他评价的程序(算法)，比如预开发分级模型都储存在计算机40中。
那些在第一分级步骤由于没有满足尺寸/形状标准(方框46)或者在第二次分级步骤中由于不大可能发芽(方框48)而被废弃的胚芽可以从分级传送带34上被喷射出去，比如，利用由计算机40控制、精确定时的空气/液体喷嘴42将废弃的胚芽喷射到废物回收器44中。喷嘴启动的精确时间可以通过计算机进行控制，是因为根据照相机对每个胚芽成像的激发时间以及分级传送带的速度，就能够准确知道每个不合格胚芽的位置。使用由图像驱动的精确喷嘴从传送带上移走不需要的材料在食品工业已经公知，例如，根据食品的视觉特性来对食品进行分类。当不合格的胚芽被全部拿走后，只有那些已经通过第一和第二分级步骤筛分的胚芽仍然留在分级传送带34上面。另外一个方法是，可以设喷射器来将合格的胚芽从分级传送带34上移到另外的一个位置，比如移到另外的传送带或者一个收获箱中，用于进行进一步的成熟处理，这些对于本领域一般技术人员是显而易见的。
胚芽分级步骤“C”还可以包括多个数据采集步骤或者阶段，以及分级/筛分操作。例如，当两步照相机成像分析(图2中的方框46和48)按照上述方法完成以后，在不合格的胚芽从选择传送带34上拿下以前，胚芽将进行进一步的成像分析(比如，方框50)或者使用红外线、NIR或者拉曼(Raman)光谱学(方框52)进行光谱分析，如同下面详细描述的那样。另外一个方法是，当如上所述的两步照相机成像分析完成并且不合格的胚芽都已被丢弃，剩下的合格胚芽可以放入到托盘中然后进行干燥，用于储存(步骤“D”)，然后(在以后的时间中)进行数据采集和分级的其它步骤，或者进行“第二”分级步骤“E”，如同下面详细描述的那样。换言之，根据本发明，胚芽将经过很多分级阶段，但是并不需要同时进行所有的分级步骤。
就象本领域一般技术人员显而易见的那样，照相机38可为任何合适的型号的照相机，优选地，使用带有电荷耦合器件(CCD)并且与数字存储装置相连接的数字照相机，以便能够为对活得的胚芽图像进行数字分析。此外，照相机38可以是单视图照相机(比如，只拍摄分级传送带34上传送的胚芽的俯视图)或者多视图照相机(比如，拍摄每个胚芽的俯视图、侧视图和端视图)。为了获得胚芽的多个视图，可以把一台照相机移动到多个位置，或者使用多个照相机。但是，优选地，应当使用通过一台照相机和适当布置的反射表面(比如，棱镜)来对胚芽同时多视图成像的方法和系统，以缩短获得多个视图所需的时间并简化操作。在一起申请的美国专利申请中披露了这样一种用于对植物胚芽多个视图同时进行成像的方法和系统，专利名称为“Method and System for Simultaneously Imaging Multiple Views of aPlant Embryo”(受理号WEYE-1-20651)，特此引用。
利用分级模型算法用于对胚芽多个图像中的每个图像进行分析，以便根据假定的发芽势来对胚芽进行分级。
另外的或者可选择的方法是，在胚芽分级步骤“C”过程中，可以对位于植物胚芽子叶末端的顶点凸起进行三维成像和分析，以确定胚芽的发芽势(即，发芽后上胚轴迅速生长的潜能)，(参见图2，方框50)，因为顶点凸起是长出植物体的植物细胞形成的地方，可以肯定的是顶点凸起的形态特征(尺寸、形状等)是胚芽发芽后迅速生长倾向的可靠指示器。换言之，胚芽顶点凸起的三维信息可以用做分级模型算法的输入，以便根据胚芽的合意性对胚芽进行进一步分级。在一起申请的美国专利申请中可以查阅到对植物胚芽的顶点凸起进行三维成像的一些方法，专利名称为“Method and System for Three-Dimensionally Imaging an Apical Dome of a Plant Embryo，”(受理号WEYE-1-20665)，特此引用.
其它另外的或者可选择的方法是，在胚芽分级步骤“C”过程中，可利用光谱分析方法如红外线光谱、NIR光谱或者拉曼(Raman)光谱法对胚芽进行分析。(参见图2，方框52)。上面讨论的在申请号为PCT/US99/12128(WO99/63057)的PCT专利中披露的分级模型可用于分析胚芽的反射谱、透射率和吸收作用，以便进一步根据胚芽的化学成分定性地对胚芽进行分级。简要地，光谱分析能够识别每个胚芽的化学成分，从而识别胚芽的目标化合物或者被分析物。生物化学成熟的且可能发芽的胚芽已知包含某种程度的化合物或被分析物，比如糖醇。因此，胚芽的光谱分析是从生物化学方面定量确定成熟胚芽的可靠方法。上面讨论的PCT申请PCT/US99/12128(WO99/63057)专利中披露了使用NIR光谱对胚芽进行光谱分析和分级的一些方法。此外，在一起申请的美国专利申请中披露了使用NIR光谱对胚芽质量进行评定的方法，专利名称为“Method for Classifying plant EmbryosUsing Raman Spectroscopy.”(受理号WEYE-1-20649)，特此引用.如同这里使用的那样，光谱分析包括了对一个或多个光谱带中拍摄图像的分析，通常被称作多光谱成像(或者化学成像，化学绘图)。
应当指出的是，也可以将其它确定胚芽生物化学成分或者形态结构的成像或光谱技术用到上述的任何一个分级方法中。当新的成像或者光谱技术出现或者成熟，这些技术就可以与现在的植物胚芽自动收获和多级筛分方法结合在一起。比如，可以用Teraherz射线(T射线)对植物胚芽进行光谱成像，以识别它的化学和物理成分。还有一个例子，荧光分类技术如加州Quantum Dot Corporation of Hayward公司开发的量子打点技术，就可以用来检测特定的化合物并追踪植物胚芽中的生物活动。此外，宇宙射线可以用来测量胚芽的密度。如同本领域一般技术人员显而易见的那样，在使用电磁辐射广谱的基础上，任何其它能够确定植物胚芽生物化学或者形态(结构)特性的技术都可以在本发明中使用。
应当指出的是，上述方法在多个筛分过程中对胚芽进行筛分或者分级，首先根据基本尺寸/形状标准(步骤“B”)进行筛分，然后在步骤“C”中根据越来越完善、但更耗时的方法比如以图像为基础的尺寸/形状分析(方框46)、以图像为基础的分级模型分析(方框48)、以图像为基础的顶点凸起分析(方框50)、以及以光谱为基础的化学分析(方框52)方法进行筛分或者分级。应当理解的是，当提出了更多的筛分标准时，就可以增加更多的分级方法。例如，使用某些传感器，就可以开发出确定胚芽抗病能力的方法。那么，就可以增加根据抗病标准来对胚芽进行分级的一个分级步骤，以改进整个分级方法。当有更多的筛分标准被提出并且将相应的分级方法与本方法结合在一起的时候，本方法就能够确定那些更有可能长成强壮、健康以及具有各种其它需要特性的植物的胚芽。
希望只将那些通过前面分级步骤筛分的胚芽送到后面的筛分步骤，使需要在后面越来越完善和复杂的筛分步骤中进行评定的胚芽数量更少，因为复杂的筛分步骤更耗时。但是，在某些情况下，可以同时并行地进行两个或者多个筛分步骤。例如，当拍摄了胚芽的多个视图(比如，俯视图、侧视图、和端视图)并根据分级模型进行(方框48)分析时，就可以同时对其中一个视图(比如，包含胚芽顶端凸起三维信息的子叶端视图)进行深入地分析，以确定胚芽顶端凸起(方框50)的形态特点。
仍然参考
图1A和2，在步骤“D”中，在分级传送带34末端，这些仍然流在传送带34上的合格胚芽在重力作用下(也许在空气/液体喷嘴的作用下——图中未显示)掉落到托盘54上(垫子或者合适的表面上)，托盘54设在一个由计算机40控制的二维驱动系统(或电动平台)56上。驱动系统56以二维(或者三维)方式调节托盘54相对于分级传送带34末端的位置，以便接收从那里落下的胚芽，形成均匀间隔的阵列(比如，一个二维阵列)。根据照相机38的激发时间以及传送带34的速度，在已知每个胚芽在传送带34上精确位置的基础上，就可以确定托盘54相对于分级传送带34末端的位置。因此，即使传送带34上合格胚芽排列为不规则间隔的线性阵列，也可以在托盘54中转化为均匀间隔的二维阵列。驱动系统56的结构和操作对于本领域一般技术人员应当是显而易见的，因此不需要在这里详细描述。因而可以将可能包括了100多个布置在均匀间隔阵列中的胚芽的托盘54送去进行进一步的成熟处理，。例如，托盘54可以送到后生长处理室14(图示实施例中的干燥室)对胚芽进行干燥用于储存，然后用于人造种子中。
另外，特别要参考图2，在阶段“E”中，在用于人造种子之前，放在托盘54中并经过干燥的胚芽就要进行进一步的二次分级步骤筛分。根据每个具体的应用方式，可以在进行二次分级步骤筛分之前，对胚芽进行再水化处理，或者在分级步骤的一个或多个二次系列处理过程中仍保持脱水状态。与前面分级步骤“C”的情况一样，二次分级步骤“E”也包括一个或者多个越来越完善和复杂的分级步骤，以实现日益增加的更高选择精度和操作效率。因为只有相对数量较少的通过了前面的分级阶段“C”筛分的胚芽此时仍然留在传送带上，所以就可以使用更加完善因此更加耗时的分级方法，比如使用一个分级模型(方框54)进行多视图颜色成像分析，或者顶点凸起分析(方框56)，或者光谱分析，都可能会利用多视图(方框58)。同样，当使用机器人抓取及放置系统自动地将胚芽挑出并插入到人造种子时，可能需要进行一些数字成像以确定每个胚芽的位置，以实现此目的，所以，这个数字成像可以更方便地同二次分级阶段“E”过程的一个或者多个分级步骤中必须的图像获取过程结合在一起。
例如，在一个实施例中，当胚芽在阶段“A”中从生长培养基上被冲下来，然后在阶段“B”中经过分类和挑选后，在胚芽分级阶段“C”中，胚芽将经过两个分级阶段。第一，进行单视图(比如，俯视图)单色图像分析以除去不满足基本尺寸/形状标准的胚芽(方框46)。第二，将分级模型用于相同的单视图单色图像以除去那些不大可能发芽的胚芽(方框48)。在阶段“D”中，这些通过两个分级步骤筛分而留下来胚芽被放入托盘中干燥。然后，在二次分级阶段“E”中，从阶段“D”中输送过来的胚芽将进行更多系列更加完善、也更耗时的分级筛分。例如，胚芽可能要进行多视图(比如，俯视图、侧视图和端视图)彩色图像分析以便根据分级模型(方框54)除去不合格的胚芽，和进一步进行顶点凸起分析(方框56)和/或者光谱分析(方框58)以再次根据合适的分级模型进一步除去不合格的胚芽。
图1B显示了用于对植物胚芽进行自动收获和多步骤筛分系统的一个可选实施例。利用
图1A中的实施例，在水成液冲刷作用下(与图2相对应，阶段“A”和“B”)，胚芽从生长表面上被冲刷下来，放入到多孔运输带24上进行筛分。留在传送带24上的胚芽就利用照相机38进行成像。每个胚芽的图像被传输到计算机40进行分析，根据它们的形态特点进行分级(与图2相对应，阶段“C”)。例如，使用一个合适的算法来确定那些满足基本尺寸和形状标准并且准备用于人造种子的胚芽。
然后，利用计算机40控制的全自动化小型机器人输送系统60将每个满足基本尺寸和形状标准的胚芽挑出并以均匀间隔阵列方式放入到接收托盘54中。简要地说，输送系统60包括一个外壳61，该外壳可以沿着轨道62横向移动；一个机器人臂63，机器人臂63从外壳61中伸出，包括一个真空末梢。机器人臂63可以纵向延伸及轴向旋转。在申请号为PCT/US00/40720(WO 01/13702 A2)的专利中披露了适用于本发明实施例的一个小型机器人输送系统60实例的详细内容，特此引用。在
图1B显示实施例中，当胚芽被机器人臂63从传送带24上挑选出后，机壳61沿着轨道62平移到一个新位置61’，机器人臂63在这个位置向下伸出将胚芽放入到托盘54中。在这个位置，可控制机器人臂61’轴向旋转，根据照相机38成像并储存在计算机40中的胚芽初始方位，胚芽被放入到托盘54中时就可以正确定向。例如，将胚芽子叶的末端面对同一方向。在一个优选实施例中，胚芽以相同的方向被准确地放入到托盘54中，使它们的子叶末端排成一行。在本描述中，胚芽以相同的方向排列成准确阵列的托盘被称作“索引托盘”(index tray)。
然后，索引托盘(index tray)54被送去进行成熟处理，例如送到后生长处理室14(图示实施例中的干燥室)对胚芽进行脱水(与图2中阶段“D”对应)。下一步，对胚芽进行再水化和二次分级处理(与图2中阶段“E”对应)。特别地，将索引托盘(index tray)54放入到二次分级传送带64上，每个索引托盘(index tray)上都装有定向正确并且均匀间隔的胚芽阵列，当胚芽被输送到传送带64上时，要对胚芽进行额外的分级筛分步骤。例如，一个与计算机70连接的合适扫描仪68被用来对胚芽进一步分级，以确定那些很有可能成功发芽并长成正常植物的胚芽。在二次分级过程中，使用索引托盘(indextray)54是非常有利的，因为这样可以对托盘上的每个胚芽进行局部的分析。例如，针对每个胚芽的局部区域(例如，胚芽子叶末端部分)进行某种成像或者光谱分析。因为已知索引托盘(index tray)54上胚芽的精确位置(例如，胚芽子叶末端)，这样的局部分析是可能的。
在二次分级传送带64的末端，另外设有一台机器人胚芽放置系统71来挑出那些经过进一步挑选为合格的胚芽，然后将它们插入到人造种子76中。在图示实施例中，胚芽放置系统71包括一个机壳72，机壳72沿轨道73直线运动；一个机器人臂74，机器人臂74从机壳72中伸出。当合格胚芽被机器人臂74挑出后，机壳72沿轨道73直线移动到新位置72’，机器人臂74’在这个位置下降并将胚芽放入到人造种子76中(或者人造种子的管状限制器)。在上面讨论过的专利申请为PCT/US00/40720(WO 01/13702 A2)的专利中披露了一个胚芽放置系统的详细内容。其它各种用来输送胚芽并将胚芽插入到人造种子76中的系统都可以使用，本领域一般技术人员对此显而易见。例如，机壳72和机器人臂74可以做二维或者三维运动。同样，装有多个人造种子76的托盘也可以做一维、二维和三维运动，以便精确地对每个种子76相对于胚芽放置系统71上携带的胚芽的位置进行定位。
特别地，因为索引托盘(index tray)54上的胚芽的正确位置为已知，当胚芽放置系统从托盘54上挑出胚芽时，胚芽放置系统71不需要具备确定或者修正每个胚芽位置和/或者方向的能力。例如，根据已知的每个胚芽的位置和方向，胚芽放置系统可以正确地将每个胚芽的子叶末端放在人造种子76中。
根据本发明，提供了一种用于自动收获体细胞胚的完整方法和系统，该方法和系统可以替代目前的人工劳动，包括胚芽的分类和挑选阶段，以及根据它们假定的发芽势进一步对大规模生产的胚芽进行分级。胚芽的分级在多个筛分步骤中完成，以便有效地确定那些适合于用做人工种子的胚芽。通过仔细选择要组合到一起的适当分级方法，能够实现日益提高的选择正确性，赶上或者超过目前只有熟练技术人员才能达到的选择水平。此外，目前这个多级筛分(分级)自动方法的产量大约为每年5百万个胚芽，能够充分满足人造种子大规模生产对胚芽进行分级和挑选所需要的1.5-2秒/个胚芽的速度。
虽然对发明的优选实施例进行了说明和描述，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，欢迎对本发明提出各种改进。
权利要求
1.一种在多个步骤中对植物胚芽进行自动收获和筛分的方法，包括对植物胚芽进行自动收获和挑选；使用第一分级方法对经过分类和挑选的植物胚芽进行自动分级；和使用第二分级方法对已经通过第一分级方法筛分的植物胚芽进行自动分级。
2.如权利要求1所述的方法，其中，自动分类和挑选步骤包括自动将植物胚芽从生长培养基上取下。
3.如权利要求2所述的方法，其中，将植物胚芽自动取下包括使用水成液将植物胚芽从生长培养基上冲下来。
4.如权利要求1所述的方法，其中，胚芽的分类和挑选步骤包括使用一个流动血细胞计数器。
5.如权利要求1所述的方法，其中，胚芽的分类和挑选包括将胚芽放入到多孔材料中进行筛分。
6.如权利要求5所述的方法，其中，对放入到多孔材料上的胚芽喷洒水成液，将胚柄组织或者残余胚柄块(ESM)与胚芽分开。
7.如权利要求5所述的方法，其中，多孔材料包括多孔传送带。
8.如权利要求7所述的方法，其中，胚芽被放入到一个贮液器中，贮液器将胚芽分配到多孔传送带上，贮液器做成能够以规定方式将胚芽分配到皮带上。
9.如权利要求8所述的方法，其中，贮液器包括一根管道。
10.如权利要求7所述的方法，其中，筛分以后经过分类和挑选的植物胚芽被放入到分级传送带上，然后沿着所述传送带来实施第一和第二自动分级方法。
11.如权利要求10所述的方法，其中，利用重力将经过分类和挑选的植物胚芽从多孔传送带转移到分级传送带上。
12.如权利要求10所述的方法，其中，分级传送带通常垂直伸向多孔传送带。
13.如权利要求10所述的方法，其中，经过分类和挑选的植物胚芽沿着分级传送带的长度方向以单行方式放入到分级传送带上。
14.如权利要求13所述的方法，其中，植物胚芽被相互隔开单行放入。
15.如权利要求10所述的方法，还包括将那些被第一或者第二自动分级方法确定为不合格的胚芽从分级传送带上自动移走的步骤。
16.如权利要求15所述的方法，其中，将不合格胚芽自动移走通过喷嘴来完成。
17.如权利要求10所述的方法，还包括将那些被第一或者第二自动分级方法确定为合格的胚芽从分级传送带上自动移走的步骤。
18.如权利要求17所述的方法，其中，将合格胚芽自动移走的步骤包括将那些合格胚芽以预定的布置阵列转移到一个接收表面上。
19.如权利要求18所述的方法，其中，接收表面包括一个安装到电动平台上的托盘，电动平台做成能够调节托盘相对于分级传送带的位置，以便接收由于重力作用而从分级传送带上落下的胚芽并排列成预定的阵列。
20.如权利要求19所述的方法，其中，胚芽从分级传送带上由于重力下落时利用喷嘴来协助其下落。
21.如权利要求7所述的方法，其中，根据第一分级方法在多孔传送带上对经过分类和挑选的植物胚芽进行分级，而已经通过第一分级方法筛分的植物胚芽从多孔传送带上以预定的阵列被转移到索引托盘中。
22.如权利要求22所述的方法，其中，第二分级方法对已经布置在索引托盘中的植物胚芽实施筛分。
23.如权利要求1所述的方法，其中，第一分级步骤根据胚芽的形状和尺寸进行分级，而第二分级步骤则依照一个预定的分级模型根据它们假定的发芽势进行分级。
24.如权利要求1所述的方法，其中，第二分级方法比第一分级方法挑选更严格而且耗时更多。
25.一个在多个步骤中自动收获和筛分植物胚芽的系统，包括用于自动对植物胚芽进行分类和挑选的装置；使用第一分级方法对经过分类和挑选的植物胚芽进行自动分级的装置；和使用第二分级方法对已经通过第一分级方法筛分的植物胚芽进行自动分级的装置。
26.一种在多个步骤对植物胚芽进行自动收获和筛分的方法，包括对植物胚芽进行自动分类和挑选；根据胚芽的假定发芽势对经过分类和挑选的植物胚芽进行自动分级；和将分级步骤中划分为很有可能发芽的那些胚芽以预定的布置阵列自动放入到一个接收表面上。
27.如权利要求26所述的方法，其中，自动分类和挑选步骤包括将植物胚芽自动从生长培养基上取下。
28.如权利要求26所述的方法，其中，自动分类和挑选步骤包括将胚芽放入到一个多孔材料上进行筛分。
29.如权利要求26所述的方法，其中，自动分级步骤包括对每个胚芽进行图像分析。
30.如权利要求26所述的方法，其中，当胚芽被输送到分级传送带上时进行自动分级，将已经划分为合格的胚芽自动放入到一个接收表面上包括将这些胚芽从分级传送带上转移到接收表面上。
31.如权利要求30所述的方法，其中，接收表面包括一个安装到电动平台上的托盘，电动平台做成能够调节托盘相对于分级传送带的位置，以便接收由于重力作用而从分级传送带上落下的胚芽并排列成预定的阵列。
32.如权利要求30所述的方法，其中，接收表面包括一个托盘，胚芽被小型机器人抓取及放置系统准确转移到托盘上。
全文摘要
提供了一个用于在多级筛分步骤中自动收获和筛分植物胚芽，以确定那些适合用于人造种子的胚芽的方法和系统。该方法通常包括三个步骤。第一，根据植物胚芽的大致尺寸/形状对植物胚芽进行分类，并挑选到单独的胚芽装置中，比如通过振动筛分。第二，使用一个第一分级方法对经过分类和筛分的植物胚芽进行分级。比如，每个胚芽可以通过照相机进行成像，然后利用照片来确定胚芽更为精确的尺寸/形状。第三，对于那些已经通过第一分级方法筛分的胚芽，利用第二分级方法进行筛分。比如，可以根据胚芽的发芽势用于胚芽进行分级的预开发分级算法，可以用于处理第一分级方法中使用的图像，以确定那些很有可能发芽的胚芽。
文档编号A01H4/00GK1618277SQ20041006320
公开日2005年5月25日 申请日期2004年6月30日 优先权日2003年6月30日
发明者罗杰·蒂米斯, 埃德温·平原, 哈里·G·弗尔斯特, 希瑟·苏雷鲁斯-洛佩斯 申请人:韦尔豪泽公司