专利名称：一种鲍氏层孔菌发酵培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及鲍氏层孔菌的人工培养，具体地说是一种鲍氏层孔菌发酵培养基。
背景技术：
鲍氏层孔菌是已知高等真菌中抗癌效果最好的菌类，其市场开发前景非常乐观。
鲍氏层孔菌的抗癌功能最早被日本学者Tetsuro Ikekawa等(Ikekawa T，Nakanishi M，Uehara N，Chihara，G and Fukuoka，F，1968，Antitumor action ofsome basidiomycetes，especially Phellinus linteus.Gann，59155～157)发现，研究表明鲍氏层孔菌野生子实体的提取物对小鼠肉瘤180的抑制率为96.7％；研究还表明具有抗癌作用的物质是鲍氏层孔菌子实体中的多糖。Naruse等(Naruse S，Takeda S，Ito H，Jujii K，Terada Y.Shimura K，Sugiura M andMiyazaki T，1974，Studies on antitumor activity of basidiomycetes2.Antitumoreffects of polysaccharides prepared from cultured basidiomycetes.Mie Med J，23207～230)和Chung等(Chung K S，Kim S S，Rhyu，C H and Man W H，1991，An investigation on the antitumor constituents of Phellinus linteus.Korean J Mycol，19361)用鲍氏层孔菌人工培养菌丝的提取物做抗癌试验，并证实菌丝提取物对小鼠肉瘤180同样具有明显的抑制作用。Kong等(1999)还发现鲍氏层孔菌的多糖对肿瘤的生长和转移均有抑制作用；进一步研究发现(Kong D H，Hong N D，Han S B，1996，Stimulation of humeraland cell mediated immunity by polysaccharide from mushroom Phellinus linteus.Intern J Immunopharmacol，18295)鲍氏层孔菌的多糖对体液细胞具有免疫调解功能。Chung等(1993)还证明鲍氏层孔菌的多糖片段能够使小鼠产生对肉瘤的体液免疫反应(Chug K S，Kim S S，Kim H S，1993.Effect of Kpan antitumor protein-polysaccharide from mycelial culture of Phellinus linteuson the humoral immune response of tumor-bearing ICR mice to sheep red bloodcells.Arch Pharm Res，16336～338)。Song等(Song C H，Ra K s，Yang B K.1998.Immuno-stimulating activity of Phellinus linteus.Korean J Mycol，2686～90)进一步研究鲍氏层孔菌的多糖也发现其免疫调解功能。Oho等(Oho G T，Han S B，1993，Immunostimulationg activity of Phellinus linteusextracts to B-lymphocyte.Arch Phar Res，15379～381)指出鲍氏层孔菌多糖的免疫调解功能与其对β淋巴细胞的功能调解有关。之后Song等(Song KS，Cho S M，Lee J H.1995.B-lymphocyte stimulating polysaccharide frommushroom Phellinus linteus.Chem Pharm Bull，432105～2108)对调解β淋巴细胞的多糖进行了纯化，并对其物理和化学特性进行了研究。Lee等(LeeJW，Baek S J，Bang K W.1999.Characteristics of polysaccharide isolated fromthe fruitbodies and cultured mycelia of Phellinus linteus IY001.Korean J Mycol，27424-429)从鲍氏层孔菌子实体和培养菌丝中分离出多糖，并对其特性进行了研究。Kim等(Kim Y S，Park K S，Park H K，Kim S W，1994，Compositional sugar analysis of antitumor polysaccharides by high performanceliquid chromatography and gas chromatograpby.Arch Phar Res，17337～342)在研究多种担子菌抗癌多糖时发现，芸芝和灵芝的多糖主要是β-1，3和1，6-D-葡萄糖，而鲍氏层孔菌多糖除葡萄糖外，还有半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖和墨角藻糖等，因此鲍氏层孔菌的抗癌多糖要比其他多糖担子菌的抗癌多糖复杂。不同的学者还从鲍氏层孔菌中发现了多种不同的抗癌多糖，其中为β-1，3-葡聚糖在C-6有葡萄糖分支的抗癌效果最好。
鲍氏层孔菌的人工培养目前还处在起步阶段，目前仅韩国报道已成功培养出该菌的子实体，Song et al.，(Song C H，Moon H H，Ryu C H，1997.Artificial cultivation of Phellinus linteus.Korean J Mycol130～132)，但没有明确的培养基配方。国内目前还没有成功的人工培养报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种应用效果好、成本低的鲍氏层孔菌发酵培养基。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种鲍氏层孔菌发酵培养基，其组成按重量比计包括1950～2050份的暴马子丁香木屑、板栗木屑或梨木木屑，240～260份的玉米粉、高粱米糠和/或高粱米粉，23～32份的石膏，5.5～6.5份的KH2PO4；其中还含有分别19～21份的硫酸铵与蔗糖或葡萄糖，或分别19～21份的甘露醇与牛肉膏。
具体可分为四类1)1950～2050份的暴马子丁香木屑，240～260份的高粱米糠，23～27份的石膏，5.5～6.5份的KH2PO4，19～21份的硫酸铵，19～21份的蔗糖或葡萄糖；2)1950～2050份的暴马子丁香木屑，240～260份的玉米粉，28～32份的石膏，5.5～6.5份的KH2PO4，19～21份的甘露醇，19～21份的牛肉膏；3)1950～2050份的板栗木屑，240～260份的玉米粉或高粱米粉，28～32份的石膏，5.5～6.5份的KH2PO4，19～21份的硫酸铵，19～21份的蔗糖或葡萄糖；4)1950～2050份的梨木木屑，240～260份的玉米粉或高粱米粉，28～32份的石膏，5.5～6.5份的KH2PO4，19～21份的硫酸铵，19～21份的蔗糖或葡萄糖。
上述培养基配方用于栽培生产，要求温度最好控制在22～28℃，培养室内湿度最好82～86％；发菌全过程需30～50天，60天后开始子实体原基分化，90天后逐渐出现孔状子实体。
本发明培养基配方具有如下优点1)木屑与米糠或玉米粉的按比例混合，可以使培养基孔隙大小分布均匀.透气性、持水性好，湿度上下一致，在正常温度下培养，菌丝生长迅速、粗壮浓密、洁白有光泽，而且由于粗细木屑的连结和大小孔隙内菌丝组织发达，使得菌块的结持力强而韧，菌种块结持性好，取接种块不会碎，接种成活率高。
2)培养基中添加石膏可以增加钙质使所发菌丝生长健壮。
3)在碳源氮源的选择方面，根据申请人对鲍氏层孔菌进行培养条件的研究，发现培养时添加的最佳碳源为甘露醇和葡萄糖；最佳氮源为蛋白胨和牛肉膏；硫酸铵在培养初期对菌丝氮源的供给、促进菌丝生长效果非常明显，考虑到蛋白胨的成本高，因此分别采用葡萄糖与硫酸铵、甘露醇与牛肉膏的配比方案。
4)培养基中而添加KH2PO4则延续了菌丝体从母种扩繁开始微量元素的需要。
具体实施例方式
实施例11)取生长于暴马丁香Syringa amurensis Rupr.的野生鲍氏层孔菌子实体进行菌种分离，并进一步进行纯化。
2)母种的扩繁按常规方法对鲍氏层孔菌母种原种进行培养，采用的培养基为常规的PDA培养基或PSA培养基，PDA培养基重量组成为，水∶马铃薯∶琼脂∶葡萄糖∶KH2PO4∶MgSO4∶VB1＝2000∶400∶40∶40∶6∶3∶0.02；pH值5.5；PSA培养基重量组成为，水∶马铃薯∶琼脂∶蔗糖∶KH2PO4∶MgSO4∶VB1＝2000∶400∶40∶40∶6∶3∶0.02；pH值6.5；上述两种配方可作菌种分离培养基，也可作母种扩繁培养基。
a.本实施例采用的PDA母种培养基配方马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，KH2PO43g，MgSO41.5g，VB110毫克，以稀盐酸将其PH值调至5.5；配制方法将马铃薯去皮，洗净，挖去芽眼，切成小薄片，称取200g，放入铝锅内加水1000ml煮沸，八分熟后过滤取其汁液，再加水补至1000ml，小火加热，放入琼脂。待琼脂全部溶化，再加入其它成份，充分溶解后分装入三角锥瓶中等待灭菌，高度不得超过三角锥瓶的三分之二；b.灭菌采用全自动高压灭菌锅灭菌，时间为30-40分钟，压力1.2kg/cm2，灭菌温度121℃；灭菌过程中一定要严格遵守操作规程，以防意外事故发生；c.分装将灭菌后的培养基装入已干热灭菌后的玻璃培养皿中，厚度为培养皿高度的1/4为宜；d.接种必须在无菌条件下操作；将待接种的培养基和工具放入接种箱或接种室的工作台上，用福尔马林和高锰酸钾熏蒸接种箱和接种室，同时开启紫外线灯，增强灭菌效果；观察2天，见培养皿内确无杂菌感染即可接种。接种时母种所经过的空间，必须是无菌区。各种工具与菌种接触前都应经火焰灭菌，冷却后再取菌种，以免灼伤菌种；培养皿边缘及培养皿盖也须经火焰灭菌；接种后，5盘为一组用封口膜(封口膜也要预先消毒)封好；移入培养室内培养；e.培养培养室内要保持清洁、干净，经常喷来苏水杀灭杂菌。培养室要封闭好，在黑暗条件下培养，避免直射光以及各种照明灯光。温度在22--28℃，湿度不宜过大，保持湿润即可，在这样的环境下，5天后即可见新生的菌丝体，15-20天菌丝即已满盘；满盘后的菌种即成为原种。
3)鲍氏层孔菌发酵培养(原种培养及栽培种培养)鲍氏层孔菌原种培养基及栽培种培养基(木屑类培养基，其可直接用于袋料栽培生产)配方暴马子丁香木屑(干重)1950～2050Kg，高粱米糠240～260Kg，石膏23～27Kg，KH2PO45.5～6.5Kg，蔗糖或葡萄糖19～21Kg，硫酸铵19～21Kg；本实施例采用的配料如下a.配料时遵循先干拌后湿拌的原则；先将干料暴马子丁香木屑4000g(指干木屑重量)、高梁米粉500g，石膏粉50g混拌均匀，再将蔗糖(或葡萄糖)40g，KH2PO412g，硫酸铵40g分别用纯净水溶解后混合在一起，倒入混拌好的干料中，再次搅拌均匀；培养料最后的湿度以用手握时，手指间有水溢出而不下滴为宜，这样的含水量在60％左右；b.装瓶采用罐头瓶培养，装入培养料的多少依培养瓶大小而定。一般来说，装入培养料的高原为整瓶高度的2/3；装瓶时要松紧适度，料面压平；培养基中间用打孔器从上至下直达瓶底打一孔洞，以增加氧气，利于菌丝向下蔓延生长；然后用耐高温的塑料封口膜将瓶口封好，封口不宜使用胶皮皮套扎口，因为经过高温后，皮套易断；最好用纯棉线绳扎口；c.灭菌高压蒸汽灭菌，压力1.5kg/cm2，时间1～1.5时间，温度在121℃；高压蒸汽灭菌锅使用时要尽量将锅内冷空气排除，锅内培养瓶的摆放不宜过挤，以利热蒸汽流通；灭菌结束，要等到锅内压力缓慢下降后再打开锅盖，防止因压力下降过快或温度过高等造成人身安全事故；d.接种将灭过菌的培养基置于25℃下培养3-7天，如培养基表面无任何变化，则表明灭菌效果良好，可接种使用；在原种及栽培种的接种过程中，操作者也应严格遵守无菌操作规程进行；e.培养将接种后的培养瓶移入培养室，整齐摆放于培养架上，培养室内要密闭遮光，温度控制在22～28℃之间，室内湿度不宜过大，湿度大易杂菌滋生；每隔2-3天于中午适当通风，时间30分钟；除此之外，随时观察培养瓶内目的菌种的发菌情况，发现有感染的菌种瓶及时清除；
接种后第9天即可见新生的菌丝体；菌丝体的颜色因培养基种类的不同而有所差异；木屑类培养基上所发菌丝颜色由浅至深，刚开始呈白色，慢慢变为淡黄色至深黄色；发菌全过程需30-50天，60天后可见子实体原基分化开始；f.子实体分化与形成阶段管理当培养瓶内的菌丝布满接种面时，可见突起的颜色稍深的瘤状子实体原基，此时在封口膜上扎眼，增加瓶内的氧气量，同时瓶上覆以干净的报纸，经常向纸面上喷水，满足子实体分化阶段对湿度的要求。此时室内最适温度为24-28℃，湿度控制在82-86％左右，同时也要注意通风换气。从接种到子实体原基分化需60天左右时间，成熟的子实体(孔状子实体)出现需90天以上时间；成熟的子实体颜色呈现深黄褐色，菌盖上长有孔口，成熟的孢子即可由孔口弹射出来。
g.采收接种后100天，鲍氏层孔菌的子实体基本形成，成熟过程还需10-15天。成熟后即可采收加工利用。
实施例2与实施例1不同之处在于母种扩繁中采用PSA培养基，其组成为，水∶马铃薯∶琼脂∶蔗糖∶KH2PO4∶MgSO4∶VB1＝2000∶400∶40∶40∶6∶3∶0.02；pH值6.5；培养基灭菌压力1.2kg/cm2，灭菌时间30分钟，灭菌温度121℃；鲍氏层孔菌发酵培养(原种培养及栽培种培养)的培养基配方为暴马子丁香木屑(干重)975～1025Kg，玉米粉120～125Kg，石膏14～16Kg，KH2PO42.75～3.25Kg，甘露醇9.5～10.5Kg，牛肉膏9.5～10.5Kg。
实施例3与实施例1不同之处在于鲍氏层孔菌发酵培养(原种培养及栽培种培养)的培养基配方为板栗木屑(干重)975～1025Kg，玉米粉或高粱米粉120～125Kg，石膏14～16Kg，KH2PO42.75～3.25Kg，蔗糖或葡萄糖9.5～10.5Kg，硫酸铵9.5～10.5Kg。
实施例4与实施例1不同之处在于鲍氏层孔菌发酵培养(原种培养及栽培种培养)的培养基配方为梨木木屑(干重)975～1025Kg，玉米粉或高粱米粉120～125Kg，石膏14～16Kg，KH2PO42.75～3.25Kg，蔗糖或葡萄糖9.5～10.5Kg，硫酸铵9.5～10.5Kg。
因为菌种从暴马子丁香树分离而来，所以采用具有类似营养成分的丁香木屑，其效果最佳，而梨木屑和板栗木屑是目前人工栽培灵芝等药用真菌比较成功的培养基物。
权利要求
1.一种鲍氏层孔菌发酵培养基，其特征在于其组成按重量比计包括，1950～2050份的暴马子丁香木屑、板栗木屑或梨木木屑，240～260份的玉米粉、高粱米糠和/或高粱米粉，23～32份的石膏，5.5～6.5份的KH2PO4；其中还含有分别19～21份的硫酸铵与蔗糖或葡萄糖，或分别19～21份的甘露醇与牛肉膏。
2.按照权利要求1所述的鲍氏层孔菌发酵培养基，其特征在于其组成按重量比计为，1950～2050份的暴马子丁香木屑，240～260份的高粱米糠，23～27份的石膏，5.5～6.5份的KH2PO4，19～21份的硫酸铵，19～21份的蔗糖或葡萄糖。
3.按照权利要求1所述的鲍氏层孔菌发酵培养基，其特征在于其组成按重量比计为，1950～2050份的暴马子丁香木屑，240～260份的玉米粉，28～32份的石膏，5.5～6.5份的KH2PO4，19～21份的甘露醇，19～21份的牛肉膏。
4.按照权利要求1所述的鲍氏层孔菌发酵培养基，其特征在于其组成按重量比计为，1950～2050份的板栗木屑，240～260份的玉米粉或高粱米粉，28～32份的石膏，5.5～6.5份的KH2PO4，19～21份的硫酸铵，19～21份的蔗糖或葡萄糖。
5.按照权利要求1所述的鲍氏层孔菌发酵培养基，其特征在于其组成按重量比计为，1950～2050份的梨木木屑，240～260份的玉米粉或高粱米粉，28～32份的石膏，5.5～6.5份的KH2PO4，19～21份的硫酸铵，19～21份的蔗糖或葡萄糖。
全文摘要
本发明涉及鲍氏层孔菌的人工培养，具体地说是一种鲍氏层孔菌发酵培养基，其组成按重量比计包括，1950～2050份的暴马子丁香木屑、板栗木屑或梨木木屑，240～260份的玉米粉、高粱米糠和/或高粱米粉，23～32份的石膏，5.5～6.5份的KH
文档编号A01G1/04GK1789407SQ200410082979
公开日2006年6月21日 申请日期2004年12月15日 优先权日2004年12月15日
发明者戴玉成, 刘春静, 杜佳艳, 魏玉莲 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所, 铁岭市林业科学研究院