增加被子植物中无融合生殖表达频率的方法

专利名称：增加被子植物中无融合生殖表达频率的方法
技术领域：
本发明涉及有花植物(被子植物)中杂种优势和其它性状通过无融合生殖(无性种子形成)方式从种子到种子的永续。更具体地，本发明提供用于从有性或兼性无融合生殖植物产生表达增加百分比的如下胚珠的后代植物的可预测的方法，所述胚珠中正常有性发育被无孢子生殖的或二倍性孢子生殖的(diplosporous)(无融合生殖的)胚囊形成、孤雌生殖(不经受精而从卵形成胚胎)、不定胚生殖(从非卵的细胞形成胚胎)、或自主类型(中央细胞未受精)或假受精类型(中央细胞受精)的胚乳形成所代替。本发明还描述了对负责无融合生殖的基因进行作图和克隆所必需的胚胎学表型。本发明使用植物细胞胚胎学方法鉴定和选择就大孢子发生(雌性减数分裂)、胚囊形成(包括卵和中央细胞成熟)、受精、胚形成(embryony)和胚乳形成的起始时间和持续时间而言具有适当遗传变异性的植物或一组植物；使用植物育种方法产生许多趋异的遗传重组后代；和使用植物细胞胚胎学或后代检测方法选择表达增加频率的无孢子生殖的或二倍性孢子生殖的胚囊形成、孤雌生殖或不定胚形成、和/或自主的或假受精的胚乳形成的分离植物。
背景技术：
无融合生殖是一种天然但罕见的异常现象，在不足1％的被子植物属中发生(Carman1997)。其在大多数世界上重要的食物和纤维作物，包括稻、小麦、玉米、大麦、黍、高梁、大豆、马铃薯，大多数蔬菜和油类作物、棉等等中均不存在(Asker和Jerling1992)。正是在这些作物中，无融合生殖具有提供商业和人道主义利益的最大潜力。赋予全球作物无融合生殖性能可以在至少三个方面利于作物生产。
首先，可以将近交/自交作物(inbred crops)，例如小麦、稻和大豆转化成产量出众的杂种作物，从而使得杂种优势可以从种子到种子持久遗传。目前，杂种小麦比近交/自交品种产生多高达15％的谷粒，但是国际上栽培的大多数小麦是品种(variental)——不是杂种。与产生品种种子的低成本相比，产生杂种种子的高成本目前限制了杂种小麦种子在世界最高小麦生产区域的应用(Guillen-Portal等，2002)。
正是大多数世界作物的解剖学、生理学和遗传学在目前阻碍了大量杂种种子的经济型生产。这些经济因素又妨碍次等品种向优良杂种的全球转化。无融合生殖可以消除这一经济学瓶颈。对于稻，杂种优势的全面开发可以使稻产量与目前全球大多数稻耕作面积上栽培的近交/自交品种的产量相比提高30％至50％(Yuan1993)。通过赋予稻和其它主要世界作物以无融合生殖性能，生产杂种种子将与生产品种种子一样便宜。这是因为无融合生殖杂种可以以无性方式从种子到种子，即从一个种子世代到下一种子世代，进行自身克隆。本质上，无融合生殖种子生产系统无需用于产生杂种种子的昂贵的异花传粉方法。
其次，无融合生殖可以通过减少与目前以杂种栽培的作物的杂种种子生产相关的费用，而增加作物生产力。例如，玉米的杂种种子通过鉴定在相互杂交或双杂交时产生产量优良的杂种后代的遗传趋异近交/自交亲本系来制备。在鉴定或培育了适当亲本系后，需要大量异花传粉以产生商业数量的杂种种子。无融合生殖可以消除大多数异花传粉费用，即，一旦产生了无融合生殖杂种，其可以通过自己的种子一代一代地克隆自身。美国的种子公司目前每年花费大约$600M生产杂种玉米种子。无融合生殖可以消除异花传粉步骤，为美国的玉米种子生产者每年节约超过$300M。
第三，可以使用无融合生殖将生物技术和生产力进步转移至发达国家的边远农场以及转移给发展中国家的资源贫瘠的农民(Toenniessen2001)。目前，与生产杂种种子或赋予作物以增值的农业生物技术(agbiotech)性状相关的高费用，阻碍了杂种或增值的性状在世界的资源贫瘠地区的应用。由于无融合生殖可以使此增值的性状(杂种性或农业生物技术改良)从种子到种子永续保持，故无融合生殖能够成为一种有成本效益的媒介用于将这些性状传递给贫困国家的资源贫瘠的农民。
在能够实现无融合生殖的主要益处前，必须开发并完善在主要作物中诱导无融合生殖和增强其表达的方法。本说明书提供用于此诱导和增强的新方法。
本发明的新颖性本说明书的方法增加无融合生殖在植物中的表达。这些方法与目前其他科学家从事的方法无关，也不是目前其他科学家从事的方法的延伸。提供现有方法的以下讨论以清楚地确定区分本说明书方法和目前从事的所有其它方法的关键因素。
目前由其它科学家研究的用于赋予有性作物以无融合生殖性能的方法是1.野生无融合生殖体与亲缘有性物种杂交，之后渐渗育种以将假定的“无融合生殖基因”从野生无融合生殖体转移至有性物种2.在有性物种中诱导突变以试图通过突变方式从头产生无融合生殖基因，之后选择表达无融合生殖的植物3.作图并克隆天然无融合生殖体中的无融合生殖基因，将此(这些)无融合生殖基因通过转化方法转移至作物4.从头构建无融合生殖基因，之后将此(这些)基因通过转化方法转移至作物。
尽管这些方法每一个都取得了进展，但仍无一成功地将有性物种转化为商业上可行的无融合生殖体(Spielman等2003，Estrada-Luna等2002，Richards2003)。这四种方法基于一个共同的信念，即，可以通过一个至极少数个经由突变或调节基因的外遗传(epigenetic)改变而演化出的无融合生殖基因赋予无融合生殖(Koltunow和Grossniklaus2003)。因此，据认为1.可以通过植物育种使无融合生殖基因或外遗传调节元件从无融合生殖物种渐渗入有性物种中2.可以通过突变正常基因在有性植物中产生无融合基因3.可以通过突变、杂交、多倍体化或其它染色体畸变，在有性植物中产生外遗传调节元件4.可以在无融合植物中对无融合生殖基因或外遗传调节元件作图，并将其克隆和通过转基因方式插入有性植物5.可以通过生物化学修饰已有基因，然后以转基因方式将该经修饰基因插入有性植物，从而产生无融合生殖基因或外遗传调节元件。
本发明的发明人采取的方法不是基于相信可以通过常规或分子育种方法操作或创造的、一个或极少数个突变来源的无融合生殖基因；也并非基于相信无融合生殖是由基因调节上的外遗传改变所致的结果。相反地，本发明所基于的是本发明的发明人的一系列新发现，即，可以将无融合生殖归入如下受到遗传调节的性状类型中，这些性状通过基因组水平上的结构杂合性得以稳定。
本发明的发明人发现，在相同物种、属或科的植物中，相对于胚珠的非配子体(孢子体)组织的成熟水平，大孢子母细胞(MMC)分化、大孢子发生、胚囊形成、受精、胚形成(embryony)和胚乳形成(下文称作种系发育序列(GDS)或胚珠发育序列(ODS)的组分)的起始时间和持续时间存在广泛的遗传变异性。这种变异目前在本发明的发明人的实验室中针对几种物种，包括蝶须属(Antennaria)(


图1-3)、摩擦禾属(Tripsacum)(图4)、高粱属(Sorghum)(图5)和拟南芥属(Arabidopsis)(图6)，已经进行了表征。本发明人还发现，这种变异性在自然界中是生态型分隔的，并且受到多种基因的控制，其中这些基因在相同种、属或科的相关生态型中散布着多个等位基因。于是，本发明人猜测这些生态型分隔的等位基因赋予了各生态型对其各自的生境的适应性，并且可以通过(a)将在大孢子发生和胚囊发育的起始时间和持续时间上趋异的生态型杂交、(b)获得后代和(c)筛选无融合生殖后代，由此从有性植物产生无融合生殖植物。在这些杂种中，非同步表达的发育信号在胚珠发育期间出现彼此竞争，并出现无融合生殖，即，胚囊形成占先于大孢子发生，胚形成(embryony)占先于受精(图7-9；J.G.Carman，1997，制备无融合生殖植物的方法，WO98/33374，并入此处作为参考，下文称为“WO 98/33374”)。本发明发明人然后提供可以用于遗传稳定无融合生殖的方法，即，可以用于防止在表达无融合生殖关键的各基因座出现遗传重组的方法(J.G.Carman，1999，稳定和控制无融合生殖的方法，WO 01/32001，并入此处作为参考，下文称为“WO 01/32001”)。WO 98/33374和WO 01/32001是本发明的发明人所得的结果1.教导了亲缘植物之间在GDS组分的起始时间和持续时间上存在广泛的遗传变异性，而且该变异使得可以天然地进化出无融合生殖植物(Carman1997，2000，2001)2.验证了在GDS组分的起始时间和持续时间上存在遗传变异性(
图1-6)3.使用GDS组分起始时间和持续时间上的遗传变异性，从有性植物产生无融合生殖F1杂种植物(图7-9；WO 98/33374)4.通过修饰基因组结构，遗传稳定了合成的无融合生殖体，使得基本上消除了有性生殖(WO 01/32001)。
本说明书描述本发明人的现有技术方法——可预测地从有性植物产生无融合生殖植物的方法——的一个重要进展。在详细地描述该进展之前，重要的是注意到本发明人的方法(WO 98/33374，WO 01/32001)是目前公开的唯一的可以预测地从有性植物产生无融合生殖植物并使这些无融合生殖植物遗传稳定的方法。在此方面，WO 98/33374和WO01/32001教导，可以通过制备如下F1杂种诱导无融合生殖，在所述F1杂种中非同步表达的发育程序之间存在发育破坏性竞争(
图10)。在适当地选择亲本系时，在F1杂种的胚珠中大孢子发生和胚囊形成信号的表达在时间上重叠。在这些杂种中胚囊形成常常倾向于取代大孢子发生或珠心细胞发育，这分别造成二倍性孢子生殖的或无孢子生殖的胚囊形成(图7-9)。
WO 01/32001还教导，以有性方式来源于“遗传不稳定无融合生殖体”的后代通常会由于负责无融合生殖的多个基因座处的遗传重组而大部分回复成有性的。在遗传不稳定的兼性无融合生殖体中，兼性有性生殖过程中的遗传分离倾向于产生其中的如下等位基因联合受到破坏的后代，所述等位基因联合造成负责无融合生殖的不同步竞争。因此，遗传不稳定的兼性无融合生殖体的有性来源后代倾向于表达较低的无融合生殖外显率。WO 01/32001。相反地，申请人惊奇地发现，某些遗传不稳定兼性无融合生殖体有低百分比的有性来源后代，由于特定的稀少的重组事件(该事件的频率可以由植物育种工作者预测)，实际上表达较高水平的无融合生殖。在此背景下，本发明人发现1.调节MMC分化的起始时间和持续时间的基因很大程度上独立于(除非存在连锁)调节大孢子形成、胚囊形成、受精、胚形成和胚乳形成的起始时间和持续时间的基因2.调节大孢子形成的起始时间和持续时间的基因很大程度上独立于(除非存在连锁)调节胚囊发生、受精、胚形成和胚乳形成的起始时间和持续时间的基因3.调节胚囊发生的起始时间和持续时间的基因很大程度上独立于(除非存在连锁)调节受精、胚形成和胚乳形成的起始时间和持续时间的基因4.调节受精的起始时间和持续时间的基因很大程度上独立于(除非存在连锁)调节胚形成和胚乳形成的起始时间和持续时间的基因5.调节胚形成的起始时间和持续时间的基因很大程度上独立于(除非存在连锁)调节胚乳形成的起始时间和持续时间的基因(
图1-6)。
此发现的意义在于，各种GDS组分，甚至是每个GDS组分中的过程，的起始时间和持续时间并非专门地由相同基因控制。基于这些发现，本发明人提出如下理论1.各GDS组分的起始时间和持续时间可以通过植物育种和选择而在遗传上彼此解偶联2.可以通过借助植物育种或分子方法有意地修饰某些GDS组分的起始时间和持续时间，制备表达更高水平的无融合生殖(每植物有更多胚珠表达无融合生殖)的品系3.如果GDS组分在时间上解偶联以致丧失早期大孢子发生的信号而保持早期胚囊形成的信号和/或丧失早期卵细胞形成和受精的信号而保持早期胚形成和胚乳形成的信号，则人工制备的或天然的遗传不稳定无融合生殖体的有性重组后代将表达更高水平的无融合生殖。本文给出的数据说明，GDS阶段，例如减数分裂和胚囊形成，的起始时间安排是数量遗传的性状，这使得可以如本文所报道的(
图11)，在分离中的后代中预期这些性状的越亲分离(Rieseberg等，2003)。
4.也可以使用在无融合生殖植物产生所需的胚胎学表型方面表现出等位基因变异性的成对植物，来作图和克隆负责无融合生殖的基因。
从遗传不稳定兼性无融合生殖体出发，表达增加水平的无融合生殖的有性来源(遗传重组的)后代的百分比一般是低的，但是在植物育种工业常用的筛选方法的范围内。在被子植物中增加无融合生殖表达频率的此新方法已经经过测试和实施(
图11-14)，由此要求专利保护。
本说明书公开了增加被子植物的无融合生殖表达频率的方法。这些新公开的方法由于本发明人在GDS组分的起始时间和持续时间的遗传控制方面的惊人发现而成为可能。本发明人发现，某些遗传不稳定兼性无融合生殖体的低百分比有性来源后代会由于特定的罕见重组事件而实际上表达较高水平的无融合生殖。基于此惊人发现的进一步研究和开发，导致了制备和/或增强无融合生殖植物的本公开方法。
发明概述本说明书的一个目的是提供从有性被子植物或与所制备的无融合生殖植物相比表达较低频率的无融合生殖的被子植物，制备无融合生殖植物的方法。本说明书的另一目的是提供制备无融合生殖得以增强的植物的方法，所述无融合生殖得以增强的植物，相对于用于产生所述无融合生殖得以增强的植物的植物材料，表达较高频率的无融合生殖各种组分(或元素)之一种或多种。无融合生殖元素包括未减数胚囊形成(无孢子生殖的或二倍性孢子生殖的(diplosporous))、孤雌生殖或不定胚生殖、和自主的或假受精的胚乳形成。本说明书的再一目的是提供增加植物个体在各种GDS组分的起始时间和持续时间方面的遗传变异性的新方法，其中所述各种GDS组分包括大孢子发生、胚囊形成(包括卵和中央细胞形成和成熟)、受精、胚胎形成和胚乳形成。
本发明的其它目的和优点将在详述部分阐述或者可以通过本发明的实施来彰显。
为了实现前述目的，以及根据本文描述的发明，本说明书提供用于如下用途的方法-从由如下植物组成的起始植物材料制备无融合生殖植物·有性植物；·与所述的无融合生殖植物相比具有较低无融合生殖的兼性无融合生殖植物；或·有性植物和与所述无融合生殖植物相比具有较低无融合生殖的兼性无融合生殖植物；-制备无融合生殖得以增强的植物，该植物相对于起始植物材料而言表达更高频率的各种无融合生殖元素之一种或多种，所述起始植物材料可以由有性或兼性无融合生殖植物组成；-选择用于产生所述无融合生殖的或无融合生殖得以增强的植物的起始植物材料；和-从推定的无融合生殖的或无融合生殖得以增强的植物中鉴定出所述无融合生殖植物或无融合生殖得以增强的植物。
特别地，起始植物材料可以由如下组成-有性植物；-与所述无融合生殖的或无融合生殖得以增强的植物相比，表达较低频率的无融合生殖或其元素的兼性无融合生殖植物；
-属于相同物种或亲缘物种(同一科内)的两种或两种以上有性植物；-属于相同物种或亲缘物种的两种或两种以上兼性无融合生殖植物，其中每种植物均比所述无融合生殖的或无融合生殖得以增强的植物表达更低频率的无融合生殖或其元素；或-属于相同物种或亲缘物种的两种或两种以上植物，其中所述植物中的一种或多种仅表达有性生殖，并且所述植物中的一种或多种与所述无融合生殖的或无融合生殖得以增强的植物相比表达较低频率的无融合生殖或其元素。
可以理解，可以利用本说明书的方法制备众多植物，而且相对于起始植物材料，所制备的这众多植物在无融合生殖表达上将表现出一个从较低表达至较高表达的范围。
一个实施方案中，本发明涉及制备无融合生殖植物的方法，所述植物与用于产生该无融合生殖植物的亲本植物相比具有更高频率的无融合生殖种子结实(seed set)。本发明还涉及制备如下植物的方法，所述植物表达增加频率的一种或多种无融合生殖元素。无融合生殖元素优选包括未减数胚囊形成(无孢子生殖的或二倍性孢子生殖的)、孤雌生殖或不定胚生殖、和自主的或假受精的胚乳形成。一般地，这些方法包括步骤(a)获得表达一种或多种无融合生殖元素而遗传上该无融合生殖元素不稳定的亲本植物；(b)使亲本植物自花受精或使该亲本植物与也表达无融合生殖元素但遗传上该无融合生殖元素不稳定的另一亲缘亲本植物进行同胞交配；(c)从亲本植物获得种子；(d)播种获得的种子；(e)由此培育出后代植物；(f)筛选与亲本植物相比具有增加频率的无融合生殖种子结实的后代植物；和(g)分离表达增加频率的无融合生殖种子结实的后代植物。
优选地，与亲本植物相比，在产生的该分离的后代植物中无融合生殖种子结实的频率高至少5％，更优选地比亲本植物高至少20％，最优选地比亲本植物高40％。
在此实施方案中，步骤(b)至(e)可以任选地重复至少一次以获得与前一代相比无融合生殖种子结实的频率增加的第二代或更高世代的后代。
优选地，同胞交配是全同胞交配或半同胞交配，但是也可以设想到其它宽泛的同胞交配，并且这些同胞交配旨在包括在本发明范围内。
在再一实施方案中，亲本植物通过如下方式获得从繁殖种群中鉴定表现出极端的GDS时间安排的生态型或繁殖品系(breeding lines)；从表现极端的GDS时间安排的生态型或繁殖品系选择第一和第二植物，其中相对于孢子体胚珠或子房组织的成熟水平，第一植物的胚囊形成平均起始时间出现于第二植物的大孢子发生平均起始时间之后或之前不久；将第一和第二亲本植物杂交；从第一或第二植物获得种子；播种获得的种子；由此培育出后代植物；和鉴定表达无融合生殖元素且该元素在遗传上不稳定的植物，以获得亲本植物。
本发明还涉及选择可以用作用于产生表达无融合生殖的植物的繁殖种群的一组植物的方法。该方法优选包括如下步骤(a)选择相同被子植物种、属或科的遗传趋异生态型或繁殖品系；(b)相对于非配子体胚珠或子房结构的成熟水平，表征所述生态型或繁殖品系的GDS；(c)在所述繁殖种群中包括表现极端和中点的GDS时间安排的生态型或繁殖品系，由此以包括如下植物，在该植物中-在某(些)植物中，相对于孢子体胚珠和子房结构的成熟水平而言，GDS阶段(大孢子发生、胚囊形成、受精、胚形成和胚乳形成)提早发生，-在某(些)植物中，相对于孢子体胚珠和子房结构的成熟水平而言，GDS阶段推迟发生，
-在某(些)植物中，相对于孢子体胚珠和子房结构的成熟水平而言，一些GDS阶段提早发生而其它的推迟发生。
本发明还涉及为了产生表达增加频率的无融合生殖胚囊形成的植物而从繁殖种群选择亲本植物的方法，和为了产生表达增加频率的孤雌生殖、不定胚生殖、假受精胚乳形成或自主胚乳形成的植物而从繁殖种群选择亲本植物的方法。这些方法优选地包括步骤从繁殖种群鉴定表现极端GDS时间安排的生态型或繁殖品系；和从所鉴定的生态型或繁殖品系中选出成对的植物用作亲本，使得相对于孢子体胚珠或子房组织的成熟水平而言一个亲本中的胚囊形成平均起始时间提早出现，而另一亲本中的雌性减少分裂(大孢子发生)平均起始时间推迟出现。
本发明还包括从有性或兼性无融合生殖亲本植物产生无融合生殖的或无融合生殖得以增强的后代植物的方法，包括步骤(a)从被子植物种、属或科中选择第一和第二有性或兼性无融合生殖亲本植物，其中，相对于孢子体胚珠或子房组织的成熟水平，第一亲本植物的胚囊形成平均起始时间与第二亲本植物的大孢子发生平均起始时间于大约相同时间发生，或第一亲本植物的胚囊形成平均起始时间早于第二亲本植物的大孢子发生平均起始时间；(b)将第一和第二亲本植物杂交；(c)从第一或第二植物获得种子；(d)播种获得的种子；(e)由此培育出后代植物；(f)鉴定表达无融合生殖元素且该无融合生殖元素在遗传上不稳定的后代植物；(g)使所鉴定的一个或多个后代植物自花受精或同胞交配；(h)从后代植物获得第二代种子；(i)播种获得的第二代种子；(j)由此培育出第二代植物；和(k)筛选和鉴定无融合生殖的第二代植物。
在本发明另一实施方案中，本发明涉及从有性或兼性无融合生殖亲本植物产生无融合生殖后代植物的方法，包括步骤(a)选择相同被子植物种、属或科的遗传趋异生态型或繁殖品系；(b)根据种系发生序列(GDS)，相对于孢子体胚珠或子房结构的成熟水平，表征该生态型或繁殖品系；(c)产生包括了表现极端的GDS时间安排的生态型或繁殖品系的繁殖种群，该种群包含-相对于孢子体胚珠和子房结构的成熟水平而言具有提早发生的GDS阶段的植物和相对于孢子体胚珠和子房结构的成熟水平而言具有推迟发生的GDS阶段的植物；或-相对于孢子体胚珠或子房结构的成熟水平而言具有提早发生的一些GDS阶段和推迟发生的其它GDS阶段的植物；(d)从该繁殖种群鉴定表现极端的GDS时间安排的生态型或繁殖品系；(e)从所鉴定的生态型或繁殖品系选择亲本植物，其中所选亲本植物具有以下特征-相对于孢子体胚珠或子房组织的成熟水平而言，在一个亲本植物中的胚囊形成平均起始时间于另一亲本植物的大孢子发生平均起始时间之后或之前不久发生；和-相对于孢子体胚珠或子房组织的成熟水平而言，一个亲本植物中的胚胎和胚乳形成的平均起始时间于另一亲本植物的胚囊成熟、卵成熟、中央细胞成熟和受精阶段的平均起始时间之后或之前不久发生；(f)使亲本植物杂交，由此获得种子，播种种子，培育出F1后代植物，将F1后代自花受精或互交(intercrossing)，从F1植物获得F2或双杂交种子，播种F2或双杂交种子，由此培育出F2或双杂交后代；和(g)筛选相对于亲本植物具有增加频率的无融合生殖种子结实的F2或双杂交后代。
在此实施方案中，步骤(f)可以任选地重复至少一次以获得更高的繁殖世代(breeding generations)，之后从此更高世代的植物中筛选相对于亲本植物具有增加频率的无融合生殖种子结实的植物。
本发明方法还可以包括步骤使后代的染色体数目加倍以稳定无融合生殖。本发明还涉及根据本文公开的方法产生的无融合生殖植物或无融合生殖得以增强的植物，及其后代。
优选地，本发明方法中使用的植物是稻、小麦、玉米、大麦、高粱、黍、大豆、马铃薯或棉花植物。在优选实施方案中，所述植物是高粱。
附图简述
图1从A.corymbosa、A.aromatica、A.umbrinella、A.marginata和A.microhpylla的特定种质份(acessions)得到的二分体和ES-2阶段的代表性DIC显微照片。显微照片中长的双箭头线指示胚珠长度，其由珠柄长度加上珠柄远端合点组织的长度构成。显微照片中珠被长度由较短的双箭头线指示，包括远端珠被结构的长度加上近侧合点组织的长度。后者产生珠被。c＝合点，d＝二分体，f＝珠柄，i＝珠被，n＝珠心。(Kowallis，Carman和Bayer，准备中)被子植物中，珠心和MMC在珠柄和合点发育的早期并在珠被分化之前开始分化。然后，由合点表皮中的平周分裂引起珠被的分化。合点、珠柄和珠被在大孢子发生和早期胚囊形成过程中大部分保持未分化的(Esau1977)。在蝶须属(Antennaria)，位于合点/珠柄和合点/珠被接合处附近的居间分生组织中的协调的平周细胞分裂的区造成胚珠弯曲，并呈现出倒生形状(见显微照片，左栏)。技术上，正如文献中常常陈述的，珠被并不围绕正在发育的配子体生长。相反地，珠被的末端保持紧靠珠柄基部，居间分生组织产生的细胞的伸长造成合点和附着合点的性母细胞或配子体向子房腔(子房室)内深处后退。
观察到倒生胚珠的形成是一个渠限化的过程，对于所评价的所有蝶须属物种，该过程基本上一致。在此方面，珠被末端至珠柄起点的距离在所研究的所有物种中是相似的，并且在胚囊形成过程中不发生可观的改变(图2)。纵观所研究的物种，珠柄、合点和珠被中的细胞分裂、细胞生长和细胞分化是高度协调的过程，其导致基本上一致形状的倒生胚珠。
在所研究的蝶须属物种中，倒生胚珠的形成在发育上看来是渠限化的。相反地，在各份种质中观察到，相对于倒生胚珠的变化的大小和形状，大孢子发生和胚囊发育的起始时间和持续时间存在大的遗传决定的异时性(heterochronicity)(图3)。在A.corymbosa、A.racemosa和A.aromatica中二分体阶段常常在倒生形状完全达成之前到达，而在A.microphylla、A.marginata和A.umbrinella中二分体阶段却在该形状达成之后很久才到达(比较
图1二分体显微照片和图2-3)。
图2针对31份蝶须属种质，于二分体、四分体、2核胚囊和成熟胚囊阶段，胚珠长度相对于珠被长度的线性回归。在所研究的种质份中，胚珠生长速度倾向于等于珠被生长速度(y＝1.00(x))，珠被末端至珠柄基部的距离(
图1)几乎未从58.7Φm发生变化。包括了来自A.aromatica(MT00005，MT98034，MT98043，WY98005)、A.racemosa(MT00003，MT00004，MT00006，MT99001)、A.corymbosa(C000001，C000004，MT00001，MT99006)、A.umbrinella(C098031，MT98026，MT98042，MT99003，WY98007，WY99004)、A.microphylla(C098001，C098006，C098009，C098037，C098029，MT98001，MT98007，MT98024，WY98003)、A.marginata(NM98015)、A.densifolia(YK98006，YK98007)和A.rosulata(AZ98008)的数据。本发明人收集了种质份并分配了份号。(Kowallis，Carman和Bayer，准备中)图3收集自New Mexico、Colorado、Wyoming和Montana的6份蝶须属物种种质在4个GDS阶段的平均胚珠和珠被长度。图中央一组6条叠加的平行线代表观察到的
图1所示6份种质的平均胚珠和珠被长度值(这些数据也用于回归分析，图2)。6条未叠加的线与图中的那些相同，但是每条线的珠被长度值进行了调整以利于讨论相对于孢子体倒生胚珠组织的成熟水平而言各线之间在各个GDS阶段的起始时间和持续时间上存在的异时性差异。每条线上的四个点，从最低点开始向上移动，分别代表二分体、四分体、2核胚囊(ES-2)和成熟胚囊(ES-M)阶段。与A.corymbosa的C000004份种质有关的标记“IL+100”意指为了达到所观察到的珠被长度值(如图中央所示)，应当在该线各点的珠被长度值上增加数值100。向剩余的线也作了相似的调整，以使这些线展开。
图3中未调整的线是平行和叠加的，这说明倒生胚珠的合点、珠柄和珠被的生长是发育上渠限化的事件，即，在各份种质之间发育在很大程度上是不变的(与
图1、2比较)。相反地，在各份种质之间观察到，相对于倒生胚珠的成熟水平而言，GDS阶段的起始时间和持续时间存在广泛的遗传变异。例如，在A.corymbosa、A.racemosa和A.aromatica的种质份中，二分体和四分体阶段平均在胚珠仍然小而不成熟时出现。相反地，在A.umbrinella、A.marginata和A.microphylla的种质份中，二分体和四分体阶段出现在胚珠较大并且更成熟时(与
图1比较)。注意到，A.marginata和A.umbrinella的ES-2阶段出现在珠被/珠柄结构成熟得多时。也注意到，二分体和四分体阶段的时间安排与ES-2和ES-M阶段的时间安排不相关。这有力地证实，每个GDS阶段的起始时间至少在某种程度上独立于其它GDS阶段的起始时间，即，各GDS阶段的起始时间和持续时间至少在某种程度上是遗传上相互独立的。(Kowallis，Carman和Bayer，准备中)图4源于Illinois、Florida、Venezuela和Mexico的5份摩擦禾属物种(Tripsacum sp.)种质在8个GDS阶段的平均内珠被长度。相对于内珠被成熟水平(长度)，观察到种质份之间在GDS阶段的起始时间和持续时间上存在广泛的遗传变异。T.zopilotense和T.floridanum的二分体和四分体阶段平均在内珠被仍小且不成熟时发生。相反地，T.dactyloides和T.dactyloides var meridionale的二分体和四分体阶段在内珠被大得多且更成熟时发生。注意到，T.floridanum的ES-1阶段平均发生在T.dactyloides种质份发生减数分裂之前。也注意到，减数分裂等的时间安排与其它GDS阶段的时间安排不相关。这有力地证明，每个GDS阶段的起始时间在某种程度上独立于其它GDS阶段的起始时间，即，各GDS阶段的起始时间和持续时间在某种程度上是遗传上彼此独立的。摩擦禾属(Tripsacum)品系的身份T.dactyloides，Illinois，WW-1276(USDA，Woodward，Oklahoma)；T.dactyloides，Florida，WW-2435；T.dactyloides varmeridionale，MIA 34575(USDA，Miami)，Santander，Clumbia；T.zopilotense，7129-4(CIMMYT，Mexico)，Canon del Zopilote，Esdtado de Guerero，Mexico；T.floridanum，Florida，MIA 34719。(Bradley和Carman，准备中)。
图5测量双色蜀黍(Sorghum bicolor)品系之间的GDS变异的不同方式。(A)17份种质在5个GDS阶段的平均内珠被长度(DY＝二分体阶段、TET＝四分体阶段、ES-1＝1核胚囊阶段、ES-8＝早期8核胚囊阶段、ES-S＝柱头外露(stigma exertion)阶段)。在种质份之间观察到相对于内珠被的成熟水平(长度)而言GDS阶段的起始时间和持续时间存在广泛的遗传变异。注意到，在1.2、1.1、7.3、5.2和7.1种质份中胚囊形成的起始(黄条底部)平均发生在3.1和9.2种质份达到减数分裂的二分体阶段(橙黄色条底部)之前。也注意到，二分体和四分体阶段的时间安排与ES-1、ES-8和ES-S(柱头外露时的胚囊)阶段的时间安排不相关。这有力地证明，每个GDS阶段的起始时间安排在很大程度上独立于其它GDS阶段的起始时间安排，即，GDS阶段的起始时间和持续时间在很大程度上是遗传上彼此独立的。高粱属品系的身份1.2，双色蜀黍，Aispuri(转变的)、PI 533817(USDA，GRIN)；1.1，双色蜀黍，Aispuri，PI 253638；7.3，双色蜀黍(杂种)，0-756，PI302166；5.2，双色蜀黍，Westland，NSL 4003(USDA)；7.1，石茅高粱(Sorghum halepense)，1111，PI 542649；6.1，双色蜀黍，Colby，PI 571105；2.1，双色蜀黍，Kafir(IS 2942)，NSL 51477；7.4，石茅高粱，Zhuronskiya，PI 539065；8.2，Sorghum arundinaceum，R-319，PI 329251；5.1，双色蜀黍，Early Kalo，NSL 3999；4.2，双色蜀黍，Karad Local，PI 248318；10.1，双色蜀黍，Lydenberg Red，IS 2386(ICRISAT)；8.1，Sorghum arundinaceum，IS 12693，PI225905；3.1，双色蜀黍，IS 3922，NSL 51483；9.1，双色蜀黍，Vir-5049，PI 562347；4.1，双色蜀黍，Karad Local，PI 533932；9.2，双色蜀黍，Agira，PI 217855。(B)两个GDS趋异的高粱属品系在DY、ES1和ES8阶段的胚珠面积和珠被角度(与垂直方向的度数，见图5C)。注意到，1.2品系的ES1阶段平均比9.2品系的DY阶段发生在更小的珠被角度时(较不成熟的胚珠)(见图5C)。(C)二分体、ES1和ES8阶段的显微照片，显示了9.2和1.2品系在胚珠大小(所有的显微照片均为相同放大倍数)和珠被角度(见图5B)上存在的差异。注意到，1.2品系比9.2品系在胚珠发育(大小和珠被角度)的早得多的时期实现大孢子发生和胚囊形成(见图5A，B)。
图6拟南芥(Arabidopsis thaliana)生态型间的GDS变异；ES2＝具液泡前的2核胚囊阶段，ES-8＝早期8核胚囊阶段。上部曲线图和图片两种生态型(Kashmir 0和Canary Islands)的平均胚珠面积和种系结构(二分体、ES2或ES8)深度。从矢状切面获取胚珠面积，其包括合点、珠被和珠心。通过从面积测量的合点周界向珠被顶绘制一条线，然后测定该种系结构的合点端相对于该线的深度(见插入的显微照片)，由此测定该种系结构的深度。注意，在Kashmire 0品系中比在Canary Islands品系中二分体阶段于早得多的发育时期(种系深度的百分数)发生(顶部插图是Kashmir 0的典型二分体阶段；底部插图是Canary Islands生态型的典型二分体阶段)。下部曲线图和图片两种生态型(Kashmir S和Columbia 0)的平均胚珠面积和种系结构(二分体、ES2或ES8)深度。注意，在Kashmire S品系中比在Columbia 0品系中ES2阶段于发育的较早时期(种系深度的百分数和胚珠面积)发生(顶部插图是Kashmir 0的典型ES2阶段；底部插图是Columbia 0的典型ES2阶段)。
图7在通过GDS趋异的二倍体有性蝶须属种质份(对于蝶须属种质份之间在GDS时间安排上的趋异，见
图1)的杂交产生的F1杂种中，无融合生殖胚囊(无孢子生殖的和二倍性孢子生殖的)和自主胚乳形成的代表性DIC显微照片。A-G，A.umbrinella(MT99003B)X A.racemosa(MT99001D)A，含有蒲公英属植物类型的二倍性孢子生殖二分体和具液泡的合点成员(chalazal member)的胚珠；B，含有扩大的具液泡的蝶须属植物类型二倍性孢子生殖MMC的胚珠；C，含有退化中的(非功能性的)四分体(由指向左下方的四个箭头标示)大孢子的胚珠，所述四分体正在被侧面珠心来源的两个1核具液泡的无孢子生殖的胚囊(由另两个箭头指示)消耗；D，含有线性四分体的胚珠，该四分体正在被合点珠心来源的合点2核无孢子生殖的胚囊消耗；E，含有合点珠心来源的3核无孢子生殖的胚囊的胚珠，该胚囊与2核有性胚囊竞争；F-G，同一胚珠的两个焦平面，显示早期自主胚乳形成和多核体中的6个胚乳核。H，A.marginata(NM98015B)X A.racemosa(MT00006D)含有侧面和末端来源的4个1核无孢子生殖的胚囊的胚珠，这些胚囊与2核有性胚囊竞争。I-J，A.corymbosa(C000002A)X A.microphylla(C098030E)含有扩大的2核具液泡的蝶须属植物类型二倍性孢子生殖胚囊的胚珠。
图8在通过GDS趋异的二倍体有性摩擦禾属种质份(对于摩擦禾属种质份之间在GDS时间安排上的趋异，见图4)的杂交产生的F1杂种中，无融合生殖胚囊(无孢子生殖的和二倍性孢子生殖的)和孤雌生殖胚胎发育的代表性DIC显微照片。A-B，T.floridanum(TB23.01C)XT.zopilotense(TB42.01B)含有退化中的四分体加上三个1核无孢子生殖胚囊和1个4核无孢子生殖胚囊的胚珠的两个焦面。C，T.floridanum(TB23.01A)X T.dactyloides(TB09.08B)含有退化中的四分体(黑色箭头)和3个1核无孢子生殖胚囊(白色箭头)的胚珠。D-F，T.laxum(75-911)X T.pilosum(39-1830)双倍体(Leblanc等1995)D，含有扩大的1核具液泡的蝶须属植物类型二倍性孢子生殖胚囊的胚珠，E，含有扩大的具液泡的蝶须属植物类型二倍性孢子生殖胚囊的胚珠，所述胚囊处于第一次核有丝分裂的中期，F，含有8-12核(球形期)孤雌生殖胚胎(大箭头)和未受精的中央细胞(小箭头)的胚珠。
图9在通过GDS趋异的二倍体有性高粱属种质份(对于高粱属种质份的身份以及种质份之间在GDS时间安排上的趋异，见图5)的杂交产生的F1杂种中，无融合生殖胚囊(无孢子生殖的和二倍性孢子生殖的)形成的代表性DIC显微照片。A-B，5.2X9.2A，成熟有性MMC；B，扩大并伸长的二倍性孢子生殖MMC。C，5.1X4.1扩大并伸长的二倍性孢子生殖MMC。D-E，9.1X1.2D，有性四分体的退化中成员(黑色箭头)被2核无孢子生殖胚囊(白色箭头指向核)取代。E，有性四分体的退化中成员(黑色箭头)被1核无孢子生殖胚囊(白色箭头指向核，白色双箭头指向液泡)取代。F，(5.2X9.2)X5.2有性四分体的退化中成员(黑色箭头)被1核无孢子生殖胚囊(白色箭头)取代。G-H，2.1X1.1有性四分体的退化中成员(黑色箭头)的两个焦面，所述成员被与1核有性胚囊(H白色箭头指向核，黑色箭头指向退化中的大孢子)竞争的2核无孢子生殖胚囊(G白色箭头指向核，白色双箭头指向液泡)取代。I，7.4X9.2多个无孢子生殖胚囊。(Carman和Naumova，准备中)
图10如WO 98/33374教导的从有性植物产生无融合生殖植物的方法。在第1阶段开始时，染色体组II产生过早的减数分裂信号，由于孢原母细胞(archespore mother cell)尚未形成，因此这些信号失效，即，染色体组II以中间表型指示的中间速度发育。在第2阶段开始时，来自染色体组II的减数分裂结束的关卡信号使减数分裂终止，并以类似于在不同步的酵母异核体中观察到的方式使染色体组I与染色体组II同步化。如果减数分裂被成功地终止，则出现几种二倍性孢子生殖形式中的一种，即，直接从大孢子母细胞(蝶须属植物类型二倍性孢子生殖)或从幼小的雌性性母细胞(蒲公英属植物或苦荬菜属植物类型二倍性孢子生殖)形成胚囊。如果未能成功终止减数分裂，则可出现无孢子生殖，即，可以从邻近的珠心细胞形成一个或多个胚囊。这主要出现在含有多个或不确切的颈卵器细胞的物种中。在无孢子生殖和二倍性孢子生殖中，均形成遗传上未减数的胚囊。根据此中间表型(推迟的)进度安排，胚珠和子房的孢子体组织继续发育。相反地，由于染色体组I的胚囊发育基因(仅在胚囊中)与基因组II的胚囊发育基因的同步化，配子体(胚囊)继续过早地发育。来自两个同步化染色体组的信号诱导卵形成和孤雌生殖，相对于胚珠和子房的孢子体组织的发育，两者在大多数无融合生殖体中均过早地发生。授粉根据此中间表型进度安排而发生，但是卵不再有接受力而且在大多数情况下卵已经分裂。如果不是自主的，中央细胞会受精并发育出胚乳和孤雌生殖胚胎(WO 98/33374)。
图11两个双色蜀黍亲本品系(5.1，7.1)、由其产生的F1杂种(1184A.04)和21个分离的F2后代(对于亲本品系的来源，见图5)，在减数分裂(M)和1核胚囊阶段的平均内珠被长度。注意到，在134 F2中ES1起始时间安排上出现越亲分离(Rieseberg等，2003)，即，在134中ES1的起始时间安排早于其任一祖父母。也注意到，在150 F2和12 F2中出现减数分裂起始时间安排的越亲分离，即，在这些植物中减数分裂的发生晚于其任一祖父母。
图12相对于21个F2后代的减数分裂(二分体和四分体阶段)期珠被长度和1核胚囊期珠被长度间的差异(见
图11)，表达无孢子生殖胚囊形成的胚珠的百分数的一阶倒数回归(first order inverseregression)。随着减数分裂和1核胚囊形成之间的时间间隔的缩短，由于遗传因素，无孢子生殖胚囊形成的趋势增加。(Carman和Naumova，准备中)
图13相对于21个F2后代的减数分裂(二分体和四分体阶段)期珠被长度和1核胚囊期珠被长度间的差异(见
图11)，胚囊发育失败的百分数的线性回归。胚囊发育夭折一般发生在四分体形成后不久，即，在减数分裂和1核胚囊正常形成时之间的时期。随着这两个事件之间的时间间隔的增加，由于遗传因素，胚囊发育出现早期夭折的趋势也增加。(Carman和Naumova，准备中)
图14在从1184A.04产生的F2s(见
图11)中，无孢子生殖胚囊形成、四分体或早期胚囊退化和四分体极性逆转的代表性DIC显微照片。A-F，无孢子生殖胚囊形成A，含有4个无孢子生殖原始细胞(扩大的珠心细胞)和1核有性胚囊的胚珠；B，含有早期退化的四分体和大的1核无孢子生殖胚囊(四分体的右边)的胚珠；C，含有晚期退化的四分体和大的1核无孢子生殖胚囊(四分体的右下面)的胚珠；D，含有晚期退化的四分体和3个1核无孢子生殖胚囊(四分体右面)的胚珠；E，含有晚期退化的四分体和大的1核无孢子生殖胚囊(四分体右面)的胚珠；F，含有极晚期退化的四分体和大的2核无孢子生殖胚囊(四分体右面)的胚珠。G-J，四分体或早期有性胚囊的退化G，四分体形成后发生的退化以及一些关于功能性大孢子已开始形成的迹象；H，四分体阶段发生的退化，无功能性大孢子发育的迹象；I，明显在有性胚囊开始形成之后，可能地在1或2核期发生的退化；J，可能迟至4核有性胚囊阶段的退化。K，四分体极性逆转(polarity reversal)，其中珠孔成员已经形成4核有性胚囊，而其它四分体成员形成1核有性胚囊。ai＝无孢子生殖原始细胞，es1＝1核有性胚囊，aes1或aes2＝1或2核无孢子生殖胚囊。(Carman和Naumova，准备中)
图15有关i)高粱属植物有性大孢子发生和胚囊形成、ii)通过本发明方法从有性高粱属植物产生的合成无融合生殖体(来自两个双色蜀黍品系NSL 3999和PI 542649的杂交的F2)的无融合生殖(无孢子生殖)胚囊形成、和iii)通过本发明方法从有性摩擦禾属二倍体植物产生的合成三倍体(3x)无融合生殖体的二倍性孢子生殖胚囊形成(T.laxum/T.pilosum 4x复倍体//T.laxum 2x)的图和DIC显微照片。产生无融合生殖胚囊的胚珠的百分数对于合成高粱属和摩擦禾属无融合生殖体分别大约为25％和90％。注意，体细胞染色体数目(2n)在有性过程中减至1n，而在无融合生殖方式产生的胚囊的核中保持在2n。在无孢子生殖中，产生胚囊的有性过程夭折(在图中被叉掉)，并被其中珠心，或罕见地珠被，的体细胞再分化并发育成遗传未减数的胚囊的过程所代替。在二倍性孢子生殖中，大孢子母细胞未能完成减数分裂或在一些情况下甚至未能开始减数分裂(取决于二倍性孢子生殖的类型，减数分裂步骤在图中被叉掉)，而是再分化并直接发育成遗传未减数的胚囊。
图16根据网状进化结构杂合性(RS)模型，蝶须属植物的无融合生殖起源实例。该示意图描述在无融合生殖Antennaria rosea的有性祖先中观察到的趋异GDS表型(见
图1-3)。GDS表型由通过生境物种形成过程进化的相互适应的基因复合体编码。二级接触杂交(secondarycontact hybridization)以及之后的网状进化造成影响GDS时间安排的趋异等位基因的洗牌。观察到3类分离子1)具有造成有性不育或半不育的未解决的GDS异步的分离子(远交抑制；见
图11、14)；2)具有解决的GDS异步的有性能育分离子(见
图11、15)；和3)具有造成无融合生殖的独特ESDS异步的分离子(无性能育性，见
图11、14)。在后者(无融合生殖)中，胚囊形成占先于减数分裂，胚形成占先于受精。然后，无融合生殖需要结构杂合性或有性不育来获得遗传稳定(
图17；WO 01/32001)。正是结构杂合性造成了无融合生殖模拟简单遗传。
图17使造成无融合生殖的连锁不平衡得以稳定的核型机制。为了使遗传稳定性得以存在，必须使大量连锁基因座处的连锁不平衡(见
图11-13)不仅通过以无性方式(经无融合生殖)产生的后代世代而且通过经正常有性过程以兼性方式产生的后代世代来维持。图示机制通过有效地将成百至成千个基因连接在一起成为复合基因座(超基因簇)——在这种基因座中重组受到抑制——而有效地实现该稳定化。
优选实施方式的详述术语在公开和描述增加被子植物无融合生殖表达频率的本发明方法前，应当理解本发明并不限于特定的配置、方法步骤以及材料，因为这些配置、方法步骤和材料可以进行相当程度的变化。也应理解，本文所用术语仅仅旨在用于描述特定实施方案，并不旨在进行限制，因为本发明的范围仅仅受到后附权利要求及其等同方案的限制。
本文中提及的出版物和其它参考资料被并入以描述本发明的背景和提供有关本发明实施的附加细节。提供本文讨论的参考文献仅因为其在本申请提交日之前已公开。在此不应理解为承认本发明人无权依据在先发明而优先于这些公开。
必须注意，在本说明书和所附权利要求中使用的单数形式“a”、“an”、和“the”，除非上下文中有清楚的申明，否则包括复数的所指事物。
在描述和要求保护本发明前，根据以下阐述的定义来使用如下术语。
本文中，“包含”、“包括”、“含有”、“特征在于”和它们的语法上的等价物均是包括性或开放式术语，其不排除其它的、未述及的成员或方法步骤。“包含”应解释为包括了更具限制性的术语“由......组成”和“基本上由......组成”。
本文中，“由......组成”及其语法等价物排除了未在权利要求中规定的任何成员、步骤或成分。
本文中，“基本上由......组成”及其语法等价物将权利要求的范围限制在规定的材料或步骤以及那些不实质上地影响所要求保护的发明的基本新特征(1个或多个)的材料和步骤。
本文中，“无融合生殖”及其语法等价物指植物通过种子的无性繁殖。主要是在比较老的文献中，该术语无融合生殖包括了通过种子以外的营养结构进行的繁殖。然而，在过去50年期间，术语“无融合生殖”在文献中越来越被限制为无性种子形成，包括导致无性种子形成的配子体无融合生殖(无孢子生殖和二倍性孢子生殖)和不定胚形成形式(Asker和Jerling 1992)。在本说明书中，使用术语“无融合生殖”的此受限制的定义。因此，无融合生殖植物的以无融合生殖方式产生的种子含有一般是母本植物之遗传克隆的胚胎。
本文中，“兼性无融合生殖”及其语法等价物指单体植物可以以有性方式和无融合生殖方式繁殖，即，该植物的一个或多个胚珠可以以有性方式产生种子而且该植物的一个或多个胚珠可以以无融合生殖方式产生种子。几乎没有例外地，所有被子植物无融合生殖体都被认为是兼性无融合生殖体(Asker和Jerling 1992)。
本文中，“专性无融合生殖”及其语法等价物指单体植物仅通过无融合生殖方式繁殖。据认为，自然界中即使有的话也只有很少的专性植物无融合生殖体存在(Asker和Jerling 1992)。
本文中，“无融合生殖水平”及其语法等价物指植物中以无融合生殖方式产生种子的胚珠的百分数。高度无融合生殖的或强无融合生殖的植物的大多数胚珠以无融合生殖方式产生种子。一般地，近专性无融合生殖植物的胚珠中有98％以上以无融合生殖方式产生种子。弱无融合生殖植物的胚珠中只有很少以无融合生殖方式产生种子。
本文中，“遗传不稳定无融合生殖植物”及其语法等价物指这样的无融合生殖植物，其中，在该遗传不稳定无融合生殖植物的有性来源后代中无融合生殖水平平均低于该遗传不稳定无融合生殖植物的无融合生殖水平。自遗传不稳定兼性无融合生殖体开始，经过数个有性来源世代后，兼性无融合繁殖倾向于被有性繁殖或不育代替(WO01/32001)。
本文中，“MMC”及其语法等价物指被子植物胚珠中的大孢子母细胞(megasporocyte)。
本文中，“GDS组分”及其语法等价物指种系发育序列(germlinedevelopment sequence)的组分。这些组分是由MMC分化、大孢子发生、胚囊形成、受精、胚形成和胚乳形成组成。
本文中，“无融合生殖元素”及其语法等价物包括未减数的胚囊形成(无孢子生殖的和/或二倍性孢子生殖的)、孤雌生殖和/或不定胚生殖和自主的或假受精的胚乳形成。
历史背景无融合生殖天然地在仅少数作物和仅少数其它作物的近亲中发生。其存在于甘蔗、柑橘、苹果、桃、芒果、黑莓、覆盆子、胡桃、草莓、向日葵、甜菜、黄瓜和洋葱的栽培种或近缘野生物种中。在饲料和草皮作物中，其存在于早熟禾属(Poa)(草地早熟禾)、臂形草属(Brachiaria)、垂穗草属(Bouteloua)、披碱草属(Elymus)、蒺藜草属(Cenchrus)、画眉草属(Eragrostis)、黍属(Panicum)、狼尾草属(Pennisetum)和雀稗属(Paspalum)的野生或栽培种中(Carman1997)。本发明涉及在这些作物以及所有其它可能不具有无融合生殖近亲的被子植物作物中诱导或增强无融合生殖表达。应当理解，本发明存在其它的商业用途，例如，在诸如园艺、花卉栽培和林业(尤其是阔叶树)等领域的应用。
被子植物中无融合生殖胚珠发育常始于大孢子发生被自MMC自身(二倍性孢子生殖)或自附近珠心(围绕MMC的组织)细胞或罕见地自珠被(围绕珠心的叶状结构，无孢子生殖，
图15)开始的过早胚囊形成所占先。二倍性孢子生殖的和无孢子生殖的胚囊含有遗传未减数的卵和核(图7-9，14)。在无融合生殖体中，遗传未减数的卵的受精一般被自该卵(孤雌生殖)或罕见地自该胚囊的另一未减数细胞开始的过早胚胎形成所占先。这些事件常常发生在柱头能够接受花粉之前。无融合生殖发育也可以自不定胚形成开始，其中珠心或珠被的体细胞发育成胚胎，该胚胎有效地取代有性方式产生的卵或胚胎。无融合生殖发育结束于(1)在遗传未减数的无孢子生殖或二倍性孢子生殖胚囊中自主的(中央细胞不受精)或假受精的(中央细胞被一个或两个精核受精)胚乳形成；或(2)在遗传减数的胚囊中正常的胚乳形成(中央细胞被单个精核受精)，其中有性胚囊被不定胚取代(Asker和Jerling1992)。
造成无融合生殖的信号的强度的摆动使得无融合生殖体中可以兼性表达有性生殖。如果不是所有的也是大多数的无融合生殖体是兼性的，这意味着无融合生殖体产生的种子中有一定百分数将通过有性方式而非无融合生殖方式形成，而且该百分数受到遗传和环境因素的影响(Asker和Jerling 1992)。在近专性无融合生殖体中，每株植物的种子中以有性方式形成的种子的百分数可能低于1％。相反地，弱兼性无融合生殖体可能以无融合生殖方式产生不足1％的种子。
几种类型的无融合生殖已有描述。大多数发现于上世纪早期。在蝶须属植物类型的二倍性孢子生殖中，极早出现了用于过早胚囊形成的信号，这些信号导致正常会经历大孢子发生的MMC形成遗传未减数的胚囊，而没有开始大孢子发生的痕迹。在蒲公英属植物类型的二倍性孢子生殖中，用于胚囊形成的信号不太过早出现，在第一次减数分裂后使大孢子发生中断。无融合生殖Elymus rectisetus中胚囊形成开始时间的摆动使得可以出现有性发育、蒲公英属植物类型二倍性孢子生殖、蝶须属植物类型二倍性孢子生殖以及介于蒲公英属植物类型和蝶须属植物类型之间的各种形式(Crane和Carman 1987)。在山柳菊属(Hieracium)植物类型的无孢子生殖中，被过早的和异位的胚囊诱导信号影响的细胞位于珠心或罕见地珠被中。这些受影响的珠心或珠被细胞经历三轮核内有丝分裂，产生成熟的遗传未减数的8核胚囊。在黍属(Panicum)植物类型的无孢子生殖中，仅发生两轮核内有丝分裂，导致成熟的遗传未减数的4核胚囊。其它无融合生殖类型也已有描述，并由Asker和Jerling(1992)作了综述。
在过去的100年间已经提出了5种无融合生殖遗传模型假说1.染色体异源(远源杂交)模型，其中无融合生殖几乎不或完全不需要基因作用；2.数量遗传模型，其中无融合生殖需要许多突变来源的无融合生殖基因；3.简单遗传模型，其中无融合生殖需要一个至极少数个突变来源的无融合生殖基因；4.外遗传模型，其中无融合生殖不需要无融合生殖基因；5.网状来源的结构杂合性(RS)模型，其中野生型等位基因的独特组合造成无融合生殖，并且该组合通过结构杂合性得以稳定(本发明人的模型)。
染色体异源模型在20世纪早期得到Ernst的支持。其提出，无融合生殖是染色体异源的一个功能，即，它是远缘杂交造成的几种细胞遗传异常中的一种。因此，无融合生殖不受基因控制，而是染色体结构趋异的结果。该假说在其出现后不久就被抛弃，因为无融合生殖被证实可以发生在染色体很大程度上同源的植物中。20世纪后期，遗传研究提示，无融合生殖是简单遗传的，即，它涉及到基因(Carman1997)。
数量遗传模型在20世纪早期至中期盛行。其拥护者是Muntzing和Powers，Muntzing相信无融合生殖是由少数至许多隐性基因的精致平衡所导致的，而Powers相信隐性基因造成了无融合生殖的三个主要元素大孢子发生的失败、无融合生殖胚囊形成和孤雌生殖。在20世纪后半叶，从众多的无融合生殖遗传分析(包括许多天然无融合生殖体)得到的结果强烈暗示无融合生殖是简单遗传的。因此，数量遗传假说被大部分放弃(Asker和Jerling 1992)。
从20世纪60年代至今，大多数无融合生殖科学家支持简单遗传模型，即，一个或两个显性基因赋予了无融合生殖。直到最近，该结论一直表现出存在充分的根据，因为孟德尔分析重复地产生简单遗传分离比率，例如在有性植物和无融合生殖植物的杂交中常常产生1∶1的无融合生殖后代与有性后代的比率(Asker和Jerling 1992；Savidan 2000，2001；Sherwood 2001)。基于这些发现，在20世纪80年代和90年代启动了几个得到充分资助的R & D计划，这些计划集中于将“无融合生殖基因”从野生型天然无融合生殖物种通过渐渗植物育种方案(杂交和回交)转移至有性亲缘作物物种。然而，尽管存在表面上的简单遗传，然而数年的努力仍未导致假定的“无融合生殖基因”的鉴定和分离，也未导致该基因向有性作物转移以产生商业有价值的作物。尽管已经容易地产生无融合生殖野生型亲缘植物与作物物种间的无融合生殖杂种，然而该杂种与其后代仍是杂草样的或者很大程度上不育(Spielman等2003)。而且，作图研究目前指示，如果无融合生殖由一个或少数无融合生殖基因控制，则这些基因位于重组受到抑制的大染色体区域中(Spielman等2003；Koltunow和Grossniklaus2003)。因此，今天的许多科学家正在考虑无融合生殖可能被许多基因和调节物控制的可能性(Carman 1997；WO 98/33374；WO 01/32001；Grimanelli等2001；Grossniklaus等2001；Richards 2003；Spielman等2003；Koltunow和Grossniklaus 2003)。
外遗传模型提出，无融合生殖由基因调节上的可遗传的外遗传改变所致。这些外遗传改变由DNA甲基化的改变而引起，其中DNA甲基化的改变可能由于杂交、染色体重排和多倍性而伴随着染色质的结构改变。该模型组合了突变和杂交模型的元素。外等位基因(epiallele)是可遗传的，如突变一样，并且它们可以通过杂交和多倍体化来诱导(Koltunow和Grossniklaus 2003)。然而，外遗传模型未对如下事实作出解释杂交和多倍体化在460多个被子植物科的进化和物种形成中扮演着主要角色(Ramsey和Schemske 1998)，然而含有无融合生殖物种的属有75％以上属于仅仅3个科(Carman 1997)。
本发明的发明人研发了RS模型，该模型提出无融合生殖是多个通过结构杂合性获得遗传稳定的数量遗传性状的产物(
图16-17)。RS模型的许多元素在以前已经得以证实。例如，通过使表达趋异的GDS时间安排的生态型杂交，可以产生无融合生殖植物(WO 98/33374)，并且通过防止构成原因的这些基因座的重组，可以在遗传上稳定无融合生殖植物(WO 01/32001)。在WO 98/33374和WO 01/32001提交后发现了RS模型的其它元素，这些元素在本文中第一次进行了阐述。这些元素使得可以产生与用于制备它们的植物相比具有更高的无融合生殖表达频率的植物(
图11-12)。在这点上，在此提出专利申请，以保护以可预测的方式从有性或兼性无融合生殖植物产生表达增加百分数的无融合生殖的后代植物，即，其中更大百分数的胚珠通过无融合生殖方式发育的植物的方法。
使发明能够实现的发现两件早先的专利申请，WO 98/33374和WO 01/32001，和本说明书中描述的新技术是制备无融合生殖植物的领域的主要进展。这些专利申请与制备无融合生殖植物的其它已公开方法相比是独特的，因为本发明人的方法涉及操作大孢子发生、胚囊形成、柱头外露(stigmaexertion)、受精、胚形成和胚乳形成(所有这些均是正常有性过程)在起始时间和持续时间上的天然存在的遗传变异性(
图1-6，11-13)。相反地，其它已公布的方法涉及的是，操作突变来源的假定的无融合生殖基因或操作基因调节的外遗传改变(Spielman等2003；Koltunow和Grossniklaus 2003)。
本说明书和WO 98/33374彼此相似，因为两者均涉及制备与起始植物相比表达更高无融合生殖频率的植物的方法。它们在如何使大孢子发生、胚囊形成、受精、胚形成和胚乳形成解偶联以允许无融合生殖发生上是根本不同的。WO 98/33374中的方法主要依赖于整个GDS序列的非同步性(
图10)。本发明依赖于如下方法，该方法(a)使大孢子发生与胚囊形成在时间上解偶联从而致使无孢子生殖或二倍性孢子生殖的胚囊形成可以发生(与大孢子发生的同时或之前编码的胚囊形成)和(b)使卵成熟、中央细胞形成和成熟及受精与胚形成和胚乳形成在时间上解偶联从而致使孤雌生殖和自主的或假受精的胚乳形成可以发生(
图11-16)。
在阐明本发明的具体方法前，对目前有关调节无融合生殖各种元素的基因的假说进行综述是有利的。通过比较这些假说与本发明人的发现，可清楚地看出本发明人的方法在开发可预测地产生无融合生殖植物的方法上使现有技术获得了实质性的进展。
无融合生殖的元素在20世纪前半叶已进行了清楚描述，其包括大孢子发生的中断或夭折、无孢子生殖或二倍性孢子生殖的胚囊形成、孤雌生殖或不定胚生殖和自主的或假受精的胚乳形成(Gustafsson1946，1947a，1947b)。很清楚，在过去的40年关于无融合生殖的遗传调节的最流行观点派别是，造成无孢子生殖或二倍性孢子生殖胚囊形成的单突变可能多效性地也造成孤雌生殖(Savidan 2000，2001)。然而，自20世纪前半叶的几个科学家开始，许多科学家已经在遗传上使无融合生殖胚囊形成与孤雌生殖解偶联，这提示无融合生殖的这些元素是受不同基因调节的(Gustafsson 1947a；Spielman等2003)。对于分立的发育步骤的解偶联的这种理解最先在20世纪前半叶形成(Gustafsson 1947a)，之后Nogler对此理解进行了记载，并且其通过将无融合生殖胚囊形成描述为连接大孢子发生和有性胚囊形成之间的发育联结的断开(或解偶联)而对该观点作了延伸(Nogler 1984)。
今天研究无融合生殖的大多数科学家相信，造成无融合生殖的这些解偶联的和重新洗牌的事件在大多数情况下由至少两个在遗传上紧密连锁的无融合生殖基因(正常基因的突变)控制，或由野生型基因调节上的外遗传修饰来控制(Spielman等2003；Koltunow和Grossniklaus 2003)。相反地，本发明的发明人证实，无融合生殖是天然地或通过杂交有意地组合在一起的各非同步表达的发育程序间相互竞争的结果。正如WO 98/33374中教导的，无融合生殖胚囊形成可以发生在起始有性胚囊形成的基因(遗传自其中大孢子发生、胚囊形成、受精、胚形成和胚乳形成在胚珠发育中较早发生的植物)与起始大孢子发生的基因(遗传自其中的大孢子发生等等在胚珠发育中相对晚地发生的不同植物)于大约相同时间表达时或者前者在后者表达之前表达时(
图10)。因此，无融合生殖不是由无融合生殖基因本身或外遗传修饰引起的，而是一种遗传性状，在该性状中相对于孢子体胚珠组织的发育成熟度，负责早胚囊形成的野生型等位基因与负责晚大孢子发生的野生型等位基因竞争并占先，而负责早胚形成和胚乳形成的野生型等位基因与编码卵和中央细胞成熟及受精的所需条件的野生型等位基因竞争并占先。
WO 01/32001教导，兼性无融合生殖植物的有性来源分离子将表达与亲本植物相同的(相同百分数的胚珠通过无融合生殖方式发育)无融合生殖水平或比亲本植物低的无融合生殖水平。例如，涉及负责无融合生殖的杂合基因座(非同步表达的雌性发育序列)的重组，如果获得遗传，可能导致在这些关键基因座纯合的后代，这可能破坏负责无融合生殖的发育竞争。在这点上，大孢子发生和受精的解偶联仅被视为这些过程被竞争信号抢先除去(
图10)。WO 98/33374中从未考虑或提示过大孢子发生、胚囊形成、受精等等的起始时间和持续时间是彼此独立地调节的。相反地，它教导了非同步性涉及整个序列(
图10)而不是该序列的个体组分(
图11-14，16)。
本发明人最近发现，控制大孢子发生的起始时间和持续时间的基因与控制胚囊形成等的起始时间和持续时间的基因不同(
图11-14)。基于此发现，本发明提出如下理论(1)MMC形成、大孢子发生、胚囊形成、受精、胚形成和胚乳形成可以通过育种和单独地对每个步骤的起始时间和持续时间进行选择而在遗传上彼此解偶联，和(2)来自遗传不稳定无融合生殖体的有性重组后代，在遗传分离造成等位基因重新洗牌以致早大孢子发生等位基因丧失而早胚囊形成的等位基因得以保持时，可以表达更高水平的无融合生殖(
图11-13)。在检验此理论时，证实在来自合成产生的和遗传不稳定的兼性无融合生殖植物的有性分离子中有低百分数的有性分离子比母本植物表达高得多频率的无融合生殖胚珠发育(
图11-12)。此现象是可预测的并且是本发明的发明人的新发现。
本说明书与WO 98/33374和WO 01/32001结合在一起，提供了从有性或兼性无融合生殖植物产生遗传稳定的无融合生殖植物的方法，其中前者比产生的该无融合生殖植物具有较低的无融合生殖。高频率的无融合生殖(近专性表达)对于无融合生殖的许多农业应用是重要的。近专性表达可以保证作物的均一性(花期、植物高度、产量变量、营养变量等)，这是现代化农业实践所必需的。因此，有利的是提供产生具有增加频率的无融合生殖表达的植物的方法，其中所述频率的增加是相对于该改良品系的来源植物而言的。应当理解，本申请的这些和其它优点(以下讨论)是当前技术水平中的主要进展。
本发明的方法为了方便起见，将本发明的方法分成五类(a)汇编含有足够遗传变异性的植物品系群，以通过植物育种或遗传工程产生植物内的无融合生殖(或其一个或多个元素)表达频率增加的植物，(b)将所述的品系群自交、杂交或进行其它遗传修饰以致产生可以从中获得具有更高无融合生殖的植物的植物，(c)产生后续世代的重组植物，(d)筛选无融合生殖植物，和(e)重复某些步骤以增加产生无融合生殖得以增强的植物的频率。
汇编从中可以产生无融合生殖水平增加的植物的植物品系群本发明方法的一个步骤涉及选择或产生有性或兼性无融合生殖的植物，其中从这些植物可以产生无融合生殖生殖表达增加的植物。获得所述有性或兼性无融合生殖植物的一个方法是沿袭WO 98/33374的方法。因此，每一所述有性或兼性无融合生殖植物的亲本植物将已有详细表征，以致相对于孢子体胚珠或子房组织的发育成熟度，一个亲本的胚囊形成的起始在另一亲本的大孢子发生的大约同时或之前发生(
图1-6，10)。
另一步骤涉及选择所述亲缘植物(related plants)以便它们给下一代杂种贡献在大孢子发生、胚囊形成、受精、胚胎形成或胚乳形成相对于孢子体胚珠或子房组织而言的起始时间和持续时间上的遗传变异性(不同等位基因)(
图1-6，11-13，16)。例如，如果相对于孢子体胚珠和子房组织的发育成熟度，所述有性或兼性无融合生殖杂种植物的一个亲本的胚囊形成在另一亲本的大孢子发生的大约同一时间或之前发生，但是相对于孢子体胚珠和子房组织的发育成熟度而言两个亲本植物的受精于大约相同时间发生，那么，可以选择受精发生时间比这两个亲本早得多或晚得多的植物作为所述的亲缘植物。
应当理解，胚珠中各雌性发育阶段的起始时间和持续时间的遗传变异性是本发明人的新发现(
图1-6，11-13)，而且无融合生殖看来在自然界中由于网状进化(
图16)(涉及控制胚珠发育阶段的起始时间和持续时间的基因的分离重组)及之后的如WO 01/32001所述的遗传稳定化(
图17)的结果而进化。因此，如上所述，本发明的一个目的是提供增加植物个体或植物群体中在大孢子发生、胚囊形成、受精、胚胎形成和胚乳形成的起始时间和持续时间方面的遗传变异性的方法，其中从所述的植物个体和植物群体可以产生无融合生殖表达增强的植物。
遗传修饰植物品系群以增加产生无融合生殖水平增高的植物的频率本发明方法的另一步骤涉及使所述有性或兼性无融合生殖杂种植物杂交或自交或使它们中的一个或多个与相同种、属或科的亲缘植物远交。预期将很快克隆出控制GDS阶段的时间安排的基因，并且可以将这些基因用于如下替代方法中，在该替代方法中涉及转化以便按适当方式修饰GDS时间安排从而诱导无融合生殖。对于植物育种，可以使用标准植物育种程序例如Poehlman(1987)教导的程序完成自交、杂交或远交，对于作图、克隆和转化，可以使用该产业中充分实践的标准方法，例如Weigel和Glazebrook(2002)中教导的方法。
产生从中可以选出无融合生殖水平增加的植物的后续世代重组植物本发明方法的其它步骤包括播种从自交、回交、交叉杂交(例如，全同胞或半同胞杂交，见Poehlman 1987)、远交或遗传工程得到的种子，和培育所得的第二代或后续世代植物。
选择无融合生殖水平增加的植物本发明方法的其它步骤包括通过(a)使用细胞胚胎学方法(图7-9，11-14)或(b)产生第一代、第二代或后续世代植物的后代并对这些植物进行后代测定以鉴定比其亲本表达更高无融合生殖频率的无融合生殖植物，来筛选第一代、第二代或后续世代植物以获得无融合生殖。
重复某些步骤以增加产生无融合生殖得以增强的植物的频率本发明方法的其它步骤包括重复一次或多次前面的步骤以产生额外的分离世代，从这些分离世代通过实施额外的筛选和后代测定步骤可以获得和鉴定无融合生殖增强的植物。
实施例本发明参考如下实施例进行描述。这些实施例仅为举例说明目的而提供。它们不旨在以任何方式限制本发明。使用了本领域熟知的标准技术或以下具体描述的技术。可以理解，本发明可以在不偏离其精神或本质特征的情况下以多种具体形式实施。
实施例1选择可以产生无融合生殖增强的植物的蝶须属植物品系无融合生殖最先在Antennaria alpina中作了胚胎学水平的描述(Juel 1900)。蝶须属植物(x＝14)是雌雄异株的草本多年生植物，并通常具匍匐茎。32个有性二倍体物种的基于形态学的分支分析结合对核内核糖体DNA的已测序内部转录的间隔区的分析(ITS-1 & ITS-2)指示，蝶须属植物由6个进化枝组成(Bayer 1990；Bayer等1996)。无融合生殖仅出现在Catepes进化枝，其包含32个有性蝶须属植物物种中的17个以及4x至12x的有性和无融合生殖多倍体(Bayer和Stebbins 1987；Bayer和Minish 1993)。该组的所有成员均具有匍匐茎并且是两性异形的。有性和无融合生殖蝶须属物种的品种间杂交得到的5个地理趋异综种(无融合生殖综种(agamic complexes))，A.alpine(L.)Gaetn.，A.howellii E.L.Greene，A.parliniiFern.，A.parvifolia Nutt.，和A.rosea，从Catipes的有性成员中进化产生(Bayer 1987；Bayer等1996)。
表1蝶须属物种，收集的栖所的数目和纬度范围

A.rosea无融合生殖综种的多样性中心是北美的落基山脉，其范围从New Mexico和southern California，北至Alaska和NorthwestTerritories，以及东至Alberta、Saskatchewan、北部的Great Lakes，在Atlantic Canada有间断分布群体(Bayer 1989a)。其一般是四倍体，但是也已经发现三倍体和五倍体植物(Bayer和Stebbins 1987)。其似乎是通过涉及A.aromatica Evert，A.corymbosa E.Nelson，A.pulchella E.Greene，A.marginata E.Greene，A.microphyllaRydb.，A.racemosa Hook.，A.rosulata Rydb.和A.umbrinella Rydb.的复交(multiple hybridizations)和渐渗来产生的。这些物种是主要栖息在西部山系未覆冰部分的有性物种。表型性分析说明，A.aromatica、A.corymbosa、A.microphylla、A.pulchella/media和A.umbrinella是A.rosea综种的主要有性祖先。仅仅少数A.rosea克隆表现出可以归因于A.marginata或A.rosulata的形态学特征(Bayer 1990)。33个A.rosea群体的所有成对酶谱比较分析显示仅仅有微小的趋异。遗传同一性(I)平均为0.944(范围＝0.802-0.997)。大多数A.rosea群体与A.corymbosa、A.microphylla、A.pulchella/media和A.umbrinella最相似。较少数与A.aromatica、A.marginata和A.rosulata相似(Bayer 1989b)。
在对生物和非生物因子的广泛调查中，有性A.aromatica、A.corymbosa、A.marginata、A.media/pulchella、A.microphylla、A.racemosa、A.rosulata和A.umbrinella出现在不同的生境，而无融合生殖A.rosea占据了整个排列(ordination)的中央并与除了A.aromatica和A.racemosa之外的所有其它有性物种的排列(ordination)空间的至少部分发生重叠(Bayer等1991)。此研究也支持了A.rosea的复交杂种起源的假说。A.rosea的许多栖所与其二倍体有性祖先占据了相似的生境，而其它栖所占据了居于其有性祖先的生境之间的杂种生境(hybrid habitats)(Bayer等1991)。因此，存在来自各种来源(形态学的、同工酶的、生态学的)的良好证据来支持A.rosea无融合生殖综种的复交杂种起源假说。
遍及Rocky Mountain Cordillera从有性蝶须属植物的天然生境收集有性蝶须属植物，对其进行栽培、胚胎学分析GDS变异(
图1-3)，并进行育种以产生表达无融合生殖的植物(图7)。
实施例2选择可以从中产生无融合生殖得以增强的植物的高粱属品系有证据证明在至少一些高粱属品系中存在低水平的兼性无融合生殖种子形成(不超过25％)(Hanna等1970；Tang等1980；Schertz1992；Bala Ravi 1993)。为了评价这些品系中的无融合生殖是否产生自杂交而非偶发突变，我们检验了如下虚假设(null hypothesis)无融合生殖不能出现在通过将已知兼性无融合生殖高粱属品系的祖先杂交产生的杂种中。就我们所知，这种简单的检验以前从未进行过，即，传统知识认为无融合生殖通过突变产生。获得了两个兼性无融合生殖高粱属品系‘R473’和‘302’的祖先。R437的祖先是‘IS 2942’(日中性Kafir系)和‘Aispuri’(短日照Indian品种)(Tang等1980)。302的祖先是‘IS 3922’和‘Karad Local’(Rana等1981)。基于生境的多样性或被进行无融合生殖研究前的历史，选择了合计20种双色蜀黍(S.bicolor)、14种四倍体Sorghum X Almum、4种四倍体石茅高粱(S.halapense)、3种S.arundinacium、3种三倍体S.australiense(2n＝4x＝20，即，n＝5)、以及2种未知家系的远源杂种的其它品系。表2列出了参与产生随后用于无融合生殖胚胎学筛选的杂种的GDS已表征品系。
表2用于产生从中筛选无融合生殖的杂种的GDS已表征品系

species物种；Race品种；name名称；origin起源；Sensitivity灵敏性；status状况；Landrace地方品种；breeding material育种材料；wild野生；S.bicolor双色蜀黍实施例3表征高粱属品系中的GDS变异和产生表达无融合生殖的植物如Peel等(1997a，b)中所述，将用于细胞学分析的雌蕊处死、固定、作透明处理，并利用DIC显微镜观察。获得MMC、二分体、三分体/四分体、功能性大孢子、1核胚囊、2核胚囊、4核胚囊、早期8核胚囊、成熟胚囊、柱头外露以及成熟种子阶段的细胞学数据。针对所分析的每一个胚珠，获得如下数据减数分裂或胚囊发育阶段、雌蕊长度和宽度、珠被长度和宽度和性母细胞或胚囊的长度和宽度。表3-4示例了用于对高粱属品系进行GDS表征的从MMC至成熟胚囊阶段的数据一览表(显示了来自品系SB1001.1的数据)。其它数据一览表用于获得柱头外露和成熟种子阶段的细胞学数据。栽培表2的植物，胚胎学分析其GDS变异(图5)，并使用该植物通过WO 98/33374的方法(图9)以及通过本发明的方法(
图11-15)产生表达无融合生殖的植物。
相对于内珠被的成熟水平(长度)而言，两个双色蜀黍亲本品系(5.1，7.1)的21个F2在减数分离和胚囊形成的起始时间和持续时间上存在广泛的遗传分离(
图11)。几个F2朝一个或另一个亲本分离，例如，在245和150达到M和ES-1时内珠被长度与母本的相似，而108在这些阶段的珠被长度类似父本。这些数据提供了额外的证据证实影响减数分裂起始时间的基因可能与影响胚囊形成起始时间的基因不同。
图11中的F2后代按M至ES1的持续时间(黄条长度)递减的方式排列。本发明的一个目的是强调递减的M至ES1持续时间(黄条长度)与无孢子生殖胚囊形成百分数(
图11中顶部数字；见
图12)负相关(具有高度的显著性)，并与胚珠退化(
图11中底部数字；见
图13)正相关(显著的)。胚珠退化的频率和无孢子生殖胚囊形成的频率在亲本中是低的。在5.1中135个处于适当阶段的胚珠仅有4％形成了无孢子生殖原始细胞；无一形成无孢子生殖胚囊。相反地，由其产生所有F2的F1杂种(1184A.04)中，许多(9％)胚珠显示了无孢子生殖胚囊形成(百分数以处于功能性大孢子阶段至2核胚囊阶段，即易于观察到无孢子生殖胚囊形成的阶段的胚珠中是否存在无孢子生殖活性作为基础)。在这点上，大多数F2，相对于其F1亲本，以远离无孢子生殖胚囊形成的方式分离。然而，一些F2保持了相似水平的无孢子生殖胚囊活性(
图11，植物70、218、12)，而两个F2超过F1水平2至3倍(
图11，植物182 & 134；
图14，15)。来自各种F2的胚珠表现出非无孢子生殖和二倍性孢子生殖胚囊形成的异常，包括四分体退化、线性四分体的极性逆转和多个四分体成员经历胚囊形成(
图14)。这些异常可能由负责GDS时间安排的等位基因间的不和谐引起(Carman和Naumova，准备中)。
表3包括双色蜀黍SB1001.1原始数据(总结在表3中)的数据一览表

固定目录注释双色蜀黍Tag # PI253638 植物#1-1 品种Aispuri(高)子房＝解剖显微镜12X 250um＝3.25 lines胚珠和珠被＝01ympus显微镜20X 1um＝0.835cm




表4双色蜀黍品系在9个胚珠发育阶段的子房、外和内珠被及生殖结构(性母细胞或ES)的平均长度和标准差(总共3450个胚珠)

前面实施例中描述的步骤和材料在任何方面都仅仅被视为举例说明性质不非限制性的，本发明的范围由后附权利要求而非前面的描述来指示。处于权利要求的等同意义和范围内的所有改变均包括在其范围内。
参考文献Asker SE，L Jerling.1992.植物无融合生殖(Apomixis inplants).CRC Press，Boca RatonBala Ravi S.1993.高梁属植物品系R473中无融合生殖——真或假？已发表工作的评论性分析.Cur Sci 64306-315Bayer RJ.1989a.Antennaria rosea(菊科Inuleae)多倍体无融合生殖综种中的同工酶变异模式.Sys Bot 14389-397Bayer RJ.1989b.Antennaria rosea(AsteraceaeInuleaeGnaphaliinae)多倍体综种的分类学修订.Brittonia 4153-60Bayer RJ.1990.Antennaria Gaertner(AsteraceaeInuleae)的系统发育重建.Canad J Bot 681389-1397Bayer RJ，BG Purdy，DG Lebedyk.1991.8个AntennariaGaertner(AsteraceaeInuleae)有性物种及其异源多倍体衍生物A.rosea之间的生态位差异.Evol Trends Plants 5109-123Bayer RJ，DE Soltis，PS Soltis.1996.基于来自细胞核核糖体DNA内部转录间隔区(ITS)的序列的蝶须属植物(AsteraceaeGnaphalieae)系统发育推论.Amer J Bot 83516-527Bayer RJ，GL Stebbins.1987.蝶须属植物(AsteraceaeInuleae)的染色体数目、分布模式和无融合生殖.Sys Bot 12305-319Bayer RJ，TM Minish.1993.Antennaria soliceps(AsteraceaeInuleae)，一种来自Spring Mountain的地理局限性高山无融合生殖体，的同工酶变异、生态学和植物地理学.Nevada.Madrono 4075-89Carman JG.1997.被子植物中重复基因的非同步表达可以造成无融合生殖、仅双孢担子形成、四分孢子状态、和多胚现象.Biol J LinnSoc 6151-94Carman JG.2000.配子体无融合生殖的进化.T Batygina编有花植物胚胎学(Embryology of Flowering Plants)，Vol.3繁殖系统.Russian Academy of Sciences，St.PetersburgCarman JG.2001.基因效应基因组碰撞和无融合生殖.YSavidan，JG Carman，T Dresselhaus编无融合生殖的繁盛从机制到遗传工程(The Flowering of ApomixisFrom Mechanisms toGenetic Engineering).Mexico，D.F.C1MMYT，IRD，EuropeanCommission DG VI(FAIR)Crane CF，JG Carman.1987.东亚和新西兰的Elymus rectisetus的无融合生殖机制.Amer J Bot 74477-496Esau K.1977.种子植物解剖学(Anatomy of Seed Plants).JohnWiley & Sons，New YorkEstrada-Luna AA，W Huanca-Mamani，G Acosta-Garcia，GLeon-Martinez，A Becerra-Flora，RI Perez-Ruiz，J-PHVielle-Calzada.2002.超越混杂有花植物中从有性至无融合生殖.In Vitro Cell Devel Biol Plant 38146-151Grimanelli D，O Leblanc，E Perotti，U Grossniklaus.2001.配体子无融合生殖的发育遗传学.Trends Genet 17597-604Grossniklaus U，GA Nogler，PJ Van Dijk.2001.如何避免性配子体无融合生殖的遗传控制.Plant Cell 131491-1498Guillen-Portal F.R，D.D.Baltensperger，L.A.Nelson，G.Frickel，2002，针对Nebraska Panhandle评价硬质红色冬小麦F2和F3杂种，Community Soil Science and Plant Analysis，Monticello，N.Y.，Marcel Dekker Inc.，33(5/6)p.963-972Gustafsson A.1946.高等植物的无融合生殖.I.无融合生殖的机制.Lunds Universitets Arsskrift 421-67Gustafsson A.1947a.高等植物的无融合生殖.II无融合生殖的原因.Lunds Universitets Arsskrift 4369-179Gustafsson A.1947b.高等植物的无融合生殖，III.生物型和物种形成.Lunds Universitets Arsskrift 43181-370Hanna WW，KF Schertz，EC Bashaw.1970.Sorghum bicolor(L.)Moench中的无孢子生殖.Science 170338-339Juel O.1900.Vergleichende untersuchungen über typischeund parthenogenetische forpf lanzung bei der gattung AntennariaKgl.Sven Vetenskapsakad，Ak.Handl.33 No.51-59Koltunow AM，U Grossniklaus.2003.无融合生殖发展前景.Annual Review of Plant Biology 54547-574Leblanc O，M Duenas，M Hern ández，S Bello，V Garcia，JBerthaud，Y Savidan.1995.Tripsacum的染色体加倍人为有性四倍体植物的产生.Plant Breeding 114226-230Nogler GA 1984.配子体无融合生殖.BM Johri编，被子植物胚胎学(Embryology of Angiosperms)，Berlin，Germany，SpringerVerlagPeel MD，JG Carman，O Leblanc.1997a.无融合生殖绿毛蒺藜草、草地草熟禾、Pennisetum squamulatum Fresen、Tripsacum L.、和弯叶画眉草的大孢子母细胞胼胝质.Crop Sci 37724-732Peel MD，JG Carman，ZW Liu，RR-C Wang.1997b.小麦和无融合生殖Elymus rectisetus(Nees in Lehm.)的杂种中的减数分裂异常A.Love & Connor.Crop Sci 37717-723Poehlman JM.1987.大田作物育种(Breeding Field Crops).VanNostrand Reinhold，New YorkRamsey J，DW Schemske.1998.有花植物中多倍体形成的途径、机制和比率.Ann Rev Ecol Syst 29467-501Rana BS，CS Reddy，VJM Rao，NGP Rao.1981.谷物高粱的无融合生殖种子结实的分析和选择结果.Indian J Genet Plant Breed41118-123Richards AJ.2003.有花植物的无融合生殖综述(Apomixis inflowering plantsan overview).Philosophical Transactions ofthe Royal Society of London B 3581085-1093Rieseberg LH，Widmer A，Arntz AM，Burke JM.2003.越亲分离所必需的遗传体系结构在天然和驯化种群中是共同的.Philosophical Transactions of the Royal Society of London B 3581141-1147.
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1.产生无融合生殖种子结实的频率增加的无融合生殖后代植物的方法，包括步骤(a)获得表达一种或多种无融合生殖元素且该无融合生殖元素在遗传上不稳定的亲本植物；(b)使该亲本植物自花受精或使该亲本植物与另一也表达无融合生殖元素但该无融合生殖元素在遗传上不稳定的亲缘亲本植物进行同胞交配；(c)从这些亲本植物获得种子；(d)播种获得的种子；(e)由此培育出后代植物；(f)从这些后代植物中筛选与亲本植物相比无融合生殖种子结实的频率增加的植物；(g)分离表达增加频率的无融合生殖种子结实的后代植物。
2.权利要求1的方法，其中所分离的后代植物中无融合生殖种子结实的频率比亲本植物高至少5％。
3.权利要求1的方法，其中所分离的后代植物中无融合生殖种子结实的频率比亲本植物高至少20％。
4.权利要求1的方法，其中由亲本植物表达的所述一种或多种无融合生殖元素选自不减数胚囊形成、孤雌生殖、不定胚生殖、假受精的胚乳形成和自主的胚乳形成。
5.权利要求4的方法，其中所述一种或多种无融合生殖元素是不减数胚囊形成和孤雌生殖。
6.权利要求1的方法，还包括重复步骤(b)至(e)至少一次以获得与前面世代相比无融合生殖种子结实的频率增加的第二代或更高世代的后代。
7.权利要求1的方法，其中同胞交配是全同胞交配或半同胞交配。
8.权利要求1的方法，其中产生的无融合生殖植物是稻、小麦、玉米、大麦、大豆、马铃薯或棉花植物。
9.权利要求1的方法，其中产生的无融合生殖植物是高粱。
10.权利要求1的方法，其中亲本植物通过如下方式获得从繁殖种群中鉴定表现极端GDS时间安排的生态型或繁殖品系；从表现极端的GDS时间安排的生态型或繁殖品系中选择第一和第二植物，其中相对于孢子体胚珠或子房组织的成熟水平，第一植物的胚囊形成平均起始时间出现于第二植物的大孢子发生平均起始时间之后不久或之前不久；将第一和第二亲本植物杂交；从第一或第二植物获得种子；播种获得的种子；由此培育出后代植物；和鉴定表达无融合生殖元素且该无融合生殖元素在遗传上不稳定的植物，以获得亲本植物。
11.根据权利要求1的方法产生的无融合生殖植物及其无融合生殖后代。
12.权利要求11的无融合生殖植物或其后代，其中该植物是稻、小麦、玉米、大麦、大豆、马铃薯或棉花植物。
13.权利要求11的无融合生殖植物或其后代，其中该植物是高粱。
14.产生表达更高频率的一种或多种无融合生殖元素的后代植物的方法，包括步骤(a)获得兼性表达无融合生殖元素的亲本植物；(b)使该亲本植物自花受精或使该亲本植物与另一也兼性表达无融合生殖元素的亲缘亲本植物进行同胞交配；(c)从亲本植物获得种子；(d)播种所得种子；(e)由此培育出后代植物；(f)从这些后代植物中筛选与亲本植物相比一种或多种无融合生殖元素的表达频率增加的植物；和(g)分离表达增加频率的一种或多种无融合生殖元素的后代植物。
15.权利要求14的方法，其中所述一种或多种无融合生殖元素选自不减数胚囊形成、孤雌生殖、不定胚生殖、假受精的胚乳形成和自主的胚乳形成。
16.权利要求15的方法，其中所述一种或多种无融合生殖元素是不减数胚囊形成和孤雌生殖。
17.权利要求14的方法，还包括重复步骤(b)至(e)至少一次以获得与前面世代相比一种或多种无融合生殖元素的频率增加的第二代或更高世代的后代。
18.权利要求14的方法，其中同胞交配是全同胞交配或半同胞交配。
19.权利要求14的方法，其中产生的植物是稻、小麦、玉米、大麦、大豆、马铃薯或棉花植物。
20.权利要求14的方法，其中产生的植物是高粱。
21.权利要求14的方法，其中亲本植物通过如下方式获得从繁殖种群中鉴定表现极端GDS时间安排的生态型或繁殖品系；从表现极端的GDS时间安排的生态型或繁殖品系中选择第一和第二植物，其中相对于孢子体胚珠或子房组织的成熟水平，第一植物的胚囊形成平均起始时间出现于第二植物的大孢子发生平均起始时间之后不久或之前不久；将第一和第二亲本植物杂交；从第一或第二植物获得种子；播种获得的种子；由此培育出后代植物；和鉴定表达无融合生殖元素且该无融合生殖元素在遗传上不稳定的植物，以获得亲本植物。
22.根据权利要求14的方法产生的具有增加频率的一种或多种无融合生殖元素的植物，及其后代。
23.权利要求22的植物或其后代，其中该植物是稻、小麦、玉米、大麦、大豆、马铃薯或棉花植物。
24.权利要求22的植物或其后代，其中该植物是高粱。
25.从有性或兼性无融合生殖亲本植物产生无融合生殖后代植物或无融合生殖得以增强的后代植物的方法，包括步骤(a)从被子植物种、属或科中选择第一和第二有性或兼性无融合生殖亲本植物，其中相对于孢子体胚珠或子房组织的成熟水平，第一亲本植物的胚囊形成平均起始时间出现于第二亲本植物的大孢子发生平均起始时间的大约同时或之前；(b)将第一和第二亲本植物杂交；(c)从第一或第二植物获得种子；(d)播种所得种子；(e)由此培育出后代植物；(f)鉴定表达无融合生殖元素且该无融合生殖元素在遗传上不稳定的后代植物；(g)使鉴定的一个或多个后代植物自花受精或同胞交配；(h)从该后代植物获得第二代种子；(i)播种获得的该第二代种子；(j)由此培育出第二代植物；和(k)筛选并鉴定无融合生殖的第二代植物。
26.权利要求25的方法，其中重复步骤(f)至(j)至少一次以产生第三代或更高世代的植物用于从中筛选无融合生殖种子结实增加的植物。
27.权利要求25的方法，还包括步骤使第二代或更高世代的植物的染色体数目加倍。
28.根据权利要求25的方法产生的无融合生殖植物或无融合生殖得以增强的植物，及其后代。
29.从有性或兼性无融合生殖亲本植物产生无融合生殖后代植物的方法，包括步骤(a)选择相同被子植物种、属或科的遗传趋异生态型或繁殖品系；(b)相对于非配子体胚珠或子房结构的成熟水平，根据种系发育序列(GDS)表征生态型或繁殖品系；(c)产生包括了表现极端GDS时间安排的生态型或繁殖品系的繁殖种群，该种群包含-相对于孢子体胚珠和子房结构的成熟水平而言具有提早发生的GDS阶段的植物和相对于孢子体胚珠和子房结构的成熟水平而言具有推迟发生的GDS阶段的植物；或-相对于孢子体胚珠或子房结构的成熟水平而言具有提早发生的GDS阶段和推迟发生的其它GDS阶段的植物；(d)从该繁殖种群鉴定表现极端的GDS时间安排的生态型或繁殖品系；(e)从所鉴定的生态型或繁殖品系选择亲本植物，其中所选亲本植物具有如下特征-相对于孢子体胚珠或子房组织的成熟水平而言，在一个亲本植物中的胚囊形成平均起始时间于另一亲本植物的大孢子发生平均起始时间之后或之前不久出现；和-相对于孢子体胚珠或子房组织的成熟水平而言，一个亲本植物中的胚胎和胚乳形成的平均起始时间于另一亲本植物的成熟胚囊、卵成熟、中央细胞成熟和受精阶段的平均起始时间之后或之前不久出现；(f)使亲本植物杂交，由此获得种子，播种该种子，培育出F1后代植物，使F1后代自花受精或互交，从F1植物获得F2或双杂交种子，播种该F2或双杂交种子，由此培育出F2或双杂交后代；和(g)筛选相对于亲本植物具有增加频率的无融合生殖种子结实的F2或双杂交后代。
30权利要求29的方法，还包括重复步骤(f)至少一次以获得更高的繁殖世代，并从该更高世代的植物中筛选相对于亲本植物而言具有增加频率的无融合生殖种子结实的植物。
全文摘要
本发明涉及有花植物(被子植物)中杂种优势和其它性状通过无融合生殖(无性种子形成)方式从种子到种子的保持。更具体地，涉及用于从有性或兼性无融合生殖植物产生如下后代植物的可预测方法，所述后代植物表达增加百分比的无融合生殖种子结实或一种或多种无融合生殖元素。本发明使用植物细胞胚胎学方法鉴定和选择就大孢子发生(雌性减数分裂)、胚囊形成、卵和中央细胞形成和成熟、受精、胚形成和胚乳形成的起始时间和持续时间而言具有适当遗传变异性的植物或一组植物；植物育种方法产生许多不同的、早至晚世代的、遗传重组后代，从而使得胚囊形成优先于大孢子发生、胚胎形成优先于受精；和植物细胞胚胎学或后代检验法选择表达增加频率的一种或多种无融合生殖元素的分离后代。
文档编号A01H5/00GK1984557SQ200480031102
公开日2007年6月20日 申请日期2004年10月22日 优先权日2003年10月22日
发明者J·G·卡曼 申请人:犹他州大学