专利名称：将基因导入到植物材料中的方法
技术领域：
本申请要求基于2003年8月13日提出的日本专利申请2003-293125的优先权。
本发明是关于通过土壤杆菌属细菌来进行将基因导入到植物材料中的方法。
背景技术：
根据土壤杆菌法的基因导入，是利用土壤杆菌机能的植物转化方法。根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具有下列机能感染植物时，使作为与土壤杆菌病原性相关的Ti(tumor-inducing)质粒的一部分的T-DNA重组到植物基因组中。根据土壤杆菌法的植物转化方法是下述方法制备将Ti质粒的T-DNA结构域置换为希望向植物染色体组中导入的基因的转化用质粒，使用制备成具有该转化用质粒代替了Ti质粒的土壤杆菌，通过利用土壤杆菌的上述机能，将希望向该植物染色体组中导入的基因导入到植物染色体组中的方法。
由于认为土壤杆菌仅以双子叶植物为宿主，并不寄生在单子叶植物中，当初，根据土壤杆菌法的植物转化法主要是作为双子叶植物转化法来发展的。进行了关于根据土壤杆菌法向单子叶植物进行基因导入的各种各样的尝试，开发了具有强病原性土壤杆菌一部分病原性基因的超级双元载体(super binary vector)，据报告，在使用该载体的方法中，在水稻、玉米等单子叶植物中也稳定，可以效率比较高的进行转化(Hiei等，1994，；Ishida等，1996；特许第2,649,287号；特许第3,329,819号)。而且，报道了根据土壤杆菌法也在小麦、大麦以及高梁这样的单子叶植物中转化的成功例子，达到了在单子叶植物中也可广泛进行根据土壤杆菌法的转化。
根据土壤杆菌的转化法，一般的具有效率高，被导入的基因拷贝数少，不用将叫做T-DNA的特定结构域片段化就可导入，因为通过短期培养就可获得转化体所以培养变异少等很多优异的特征。因此，现在它作为在不论双子叶还是单子叶的很多种类的植物中最有用的转化手段而广泛应用。
根据土壤杆菌的转化方法，根据植物种类，受试材料、培养基的组成不同，但共同点是不管是哪种植物，都是使组织材料与土壤杆菌悬浮液接触，在共培养后，进行转化细胞的筛选，制备出转化植物。一般地，构成材料的植物组织，视需要进行灭菌处理，但除此之外没有特别的处理，进行土壤杆菌的感染(Rogers等，1988；Visser，1991；McCormick 1991；Lindsey等，1991)。
根据土壤杆菌的转化在很多种类的植物中都有报道，但也存在其转化效率随植物的种类、基因型以及构成材料的组织而有很大不同(Potrykus等，1998)的问题。在培育导入具有实用性基因的品种时，制备出很多的转化植物是必要的，通过一年而高效率地稳定地获得转化植物的技术开发是重要的。还有，不依赖植物的种类或基因型的转化法，在高效率地培育实用品种方面是极为有用的。而且，不依赖于形成材料的植物组织的转化法的开发，也在高效率地促进转化方面是必要的。
开发象这样地使基因导入效率提高的方法、或者是基因导入困难的植物种类或基因型也能进行转化的方法是重要的。到现在有很多报道。然而，其中大多是通过研究培养基组成或标记基因、启动子的改变或者受试材料的报告。尽管有研究将土壤杆菌感染前的植物组织处理成适合于基因导入的状态的处理方法的例子，但它们是通过刀(メス)(Chan等，1993)、粒子枪(パ一テイクルガン)(Tingay等，1997)、超声波(Trick和Finer 1997，Amoah等，2001)、酶处理(Weber等，2003)等，每种都是由于破坏组织来提高感染效率。
Hiei等发现将植物材料离心处理后，通过土壤杆菌进行基因导入，以与没处理的组织相比高的效率进行转化(WO 02/12520，特开2000-342256)。尽管通过离心处理而提高转化效率的机理细节还不明确，但认为与上述物理破坏组织的方法不同，采用离心处理，在基因导入容易进行的生理状态下细胞发生变化。同样发现，实施热处理或者实施离心处理和热处理二者的情况，与没处理的组织相比，也以高效率进行转化(特开2000-342255；特开2000-342253)。
Teasdale等申请了将植物组织浸渍于含有具有感染性的转化载体的培养基中进行减压或/还加压的转化方法的专利(WO 99/48335)。Teasdale等将加压处理作为为了促进转化载体向植物组织中的浸透而进行的。然而，在其实验例中，尽管记载了进行减压处理的例子，但没有记载进行加压处理的例子。因此，实际上完全没有显示证明加压处理具有提高基因导入效率的效果数据。
Pullman和Peter申请了通过在加压条件下培养植物组织来提高胚发生(エンブリオジエニツク)的愈伤组织形成率的方法的专利(US 6,492,174)。在8周的培养期间中施加了1-2.5atm加压强度的试验中，1.5atm的培养显示最高的愈伤组织形成率。此外，其他试验完全是在极低的加压条件1.5atm下进行的。关于加压处理对基因导入带来的效果没有被记载。
专利文献1国际专利公开公报WO 02/12520专利文献2国际专利公开公报WO 99/48355专利文献3美国专利公报第6,492,174号专利文献4特许公报第2,649,287号专利文献5特许公报第3,329,819号专利文献6特开2000-342256专利文献7特开2000-342255专利文献8特开2000-342253专利文献9国际专利公开公报WO 95/06722专利文献10国际专利公开公报WO 03/027290非专利文献1Amoah，B.K.，Wu，H.，Sparks，C.和Jones，H.D.(2001)Factors influencing Agrobacterium-mediated transient expression of uidA inwheat inflorescence tissue.Journal of Experimental Botany 521135-1142.
非专利文献2Chan，M-T.，Cheng，H-H.，Ho，S-L.，Tong，W-F.和Yu，S-M.(1993)Agrobacterium-mediated production of transgenic rice plants expressing achimeric α-amylaze promoter/β-glucuronidase gene.Plant Molecular Biology，22，491-506.
非专利文献3Hiei，Y.，Ohta，S.，Komari，T.和Kumashiro，T.(1994)Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium andsequence analysis of the boundaries of the T-DNA.The Plant Journal，6，271-282.
非专利文献4Hoekema，A，Hirsch，P.R.，Hooykaas，P.J.J.和Schilperoort，R.A.(1983)A binary plant vector strategy based on separation of vir- andT-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmide.Nature，303，179-180.
非专利文献5Ishida，Y.，Saito，H.，Ohta，S.，Hiei，Y.，Komari，T.和Kumashiro，T.(1996)High efficiency transformation of maize(Zea mays L.)mediated by Agrobacterium tumefaciens.Nature Biotechnology.14，745-750.
非专利文献6Komari，T.(1990)Genetic characterization of adouble-flowered tobacco plant obtained in a transformation experiment.Theor.Appl.Genet.80167-171.
非专利文献7Komari，T.和Kubo T.，(1999)，Methods of GeneticTransformationAgrobacterium tumefaciens.In Vasil，I.K.(ed.)Molecularimprovement of cereal crops.，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，pp.43-82.
非专利文献8Lindsey，K.，Gallois，P.和Eady，C.(1991)Regeneration andtransformation of sugarbeet by Agrobacterium tumefeneration.Plant TissueCulture Manual，B71-13.Kluwer Academic Publishers.
非专利文献9McCormick，S.，(1991)Transformation of tomato withAgrobacterium tumefaciens.Plant Tissue Culture Manual，B61-9.KluwerAcademic Publishers.
非专利文献10Potrykus，I.，Bilang，R.，Futterer，J.，Sautter，C.和Schrott，M.(1998)Agricultural Biotechnology，NYMercel Dekker Inc.pp.119-159.
非专利文献11Rogers，S，G.，Horsch，R.B.和Fraley，R.T.(1988)Genetransfer in plantsProduction of transformed plants using Ti plasmid vectors.Method for Plant Molecular Biology，CAAcademic Press Inc.pp.423-436，非专利文献12Tingay，S.，McElroy，D.，Kalla，R.，Fieg，S.，Wang，M.，Thornton，S.和Brettell，R.，(1997)Agrobacterium tumefaciens-mediated barleytransformation.The Plant Journal 111369-1376.
非专利文献13Trick，H.N.和Finer，J.J.，(1997)SAATsonication-assistedAgrobacterium-mediated transformation.Transgenic Research，6329-336.
非专利文献14Visser，R.G.F.，(1991)Regeneration and transformation ofpotato by Agrobacterium tumefaciens.Plant Tissue Culture Manual，B51-9.Kluwer Academic Publishers.
非专利文献15Weber，S.，Friedt，W.，Landes，N.，Molinier，J.，Himber，C.，Rousselin，P.，Hahne，G和Horn，R.(2003)Improved Agrobacterium-mediatedtransformation of sunflower(Helianthus annuus L.)assessment of maceratingenzymes and sonication.Plant Cell Reports 21475-482.
发明内容
发明所要解决的课题本发明提供通过土壤杆菌属细菌来进行将基因导入到植物材料中的方法。本发明的方法以包含以下工序为特征1)将植物材料进行加压处理，然后2)使土壤杆菌感染植物材料。
本发明方法与未进行工序1)的加压处理的情况相比较，提高了基因导入效率。
解决课题的手段本发明者们为解决上述问题锐意研究努力的结果是，发现通过将植物组织在加压处理后与土壤杆菌进行共培养，与没处理的组织相比，获得稳定高效率的基因导入。而且，确认了由加压处理而提高基因导入效率的效果，无论单子叶、双子叶都能确认。此外，就基因导入了的植物材料，进一步进行转化细胞的筛选以及转化植物的再分化时，加压处理的材料与没处理的材料相比，发现转化效率飞跃性地提高。进一步明确了通过加压处理，植物组织的增殖(例如由未成熟胚的愈伤组织增殖)变得旺盛。
据此，本发明关于通过土壤杆菌属细菌来进行将基因导入到植物材料中的方法，包括
1)将植物材料进行加压处理，然后2)使土壤杆菌感染植物材料。
即，在本发明中，植物材料的加压处理不是与土壤杆菌感染同时进行，而是在其之前进行。
加压处理没有特殊的限定，优选1.7气压～10气压的范围，更优选优选以2.4～8气压范围进行。最优选4～8气压。上述加压处理的范围是以常压为1气压。因此，例如，1.7气压的加压处理是指在常压上加0.7气压的状态，同样地，10气压的加压处理是指常压加上9气压的状态。此外，加压处理的时间没有特殊的限定，优选0.1秒～4小时，更优选1秒～30分钟。
加压处理，也可以在液体或气体中进行。液体没有特别限定，可以使用水(例如灭菌蒸馏水)、液体培养基、其他不抑制植物组织生长的液体等。气体没有特别限定，可以使用空气、氧气、其他不抑制植物组织生长的气体等。
加压处理的方法，可以通过例如与注射器组合，用夹子将注射器夹住，通过夹紧夹子来提高注射器内的压力来进行。加压的强度，例如可以由注射器内空气体积的减少率来算出。或者，加压处理也可以通过以下来进行1)用压缩机等将气体送入含有植物组织的容器中提高容器的内压，或者2)将装入到密封成不与外面气体接触的袋子等中的植物组织，沉入到液体中，通过水压而加压。
本发明的方法特征在于使用加压处理了的植物材料作为土壤杆菌属细菌要感染的植物材料，而作为使用土壤杆菌属细菌的基因导入或转化方法本身，可以直接使用公知的方法。
使用土壤杆菌属细菌进行的基因导入以及转化方法使用土壤杆菌属细菌进行的基因导入，一般地包括以下工序a)制备植物材料的工序；b)制备含有具有所要导入基因的载体的土壤杆菌属细菌的工序；c)使b)制备的土壤杆菌属细菌感染工程a)制备的植物材料的工序；进一步，为了得到转化体，在上述工序c)之后也可以实施d)筛选转化细胞的工序；以及
e)根据要求，将筛选的转化体进行再分化的工序。
关于工序a)在本说明书中，供基因导入的“植物”包括单子叶植物以及双子叶植物。在单子叶植物中包括水稻(イネ)、玉米、大麦、小麦、石刁柏(アスパラガス)、高梁和其他，但并不限于这些。优选水稻或玉米。双子叶植物中包括烟草、大豆、马铃薯、向日葵和其他，但并不限于这些。优选是烟草。
此外，所说“植物材料”非限定性的包括为以土壤杆菌法进行的转化而提供的该植物的细胞、叶、根、茎、果实、及其他的任何部位的植物组织，未成熟胚，愈伤组织或者不定胚样组织(以下在本说明书中称作愈伤组织等，或者简称为愈伤组织)，或者整个植物体等植物所有的形态。
作为本发明方法中使用的植物形态，优选未成熟胚或愈伤组织，最优选未成熟胚。在本说明书中，所说的植物的细胞、组织、整个植物体采用的是在本技术领域中一般采用的意义。在本说明书中，所谓的未成熟胚是受粉后处于成熟过程的未成熟种子的胚。此外，供本发明方法所用的未成熟胚的阶段(熟期)，没有特别的限制，在受粉后的任何时期采摘的都可以。最优选受粉后2天以后的未成熟胚。转化之后，优选使用能够诱导出具有再生正常个体能力的愈伤组织的未成熟胚胚盘。此外，未成熟胚优选近亲交配、近亲交配之间的F1、近亲交配与自然受粉品种之间的F1、市售F1品种的未成熟胚。在本说明书中，所谓愈伤组织是指无秩序增殖的未分化状态的细胞块。为了得到愈伤组织，可以将植物组织分化的细胞置于含有植物生长激素(例如2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)或者细胞分裂素等植物生长调节物质的培养基(叫做脱分化培养基)中培养得到。为得到该愈伤组织而做的处理叫做脱分化处理，该过程叫做脱分化过程。
在工序a)中，根据需要，将植物组织、未成熟胚等从植物体、种子等中取出，制备成适合转化的材料。此外，根据要求，也可以将植物材料在用土壤杆菌感染之前培养。
本发明中，以在工序a)中的植物材料制备过程或制备之后在工序c)中的使土壤杆菌感染之前对植物材料实施加压处理为特征。
关于工序b)很久以前就已知根瘤的土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)引起很多双子叶植物的冠瘿病(crown gall disease)，在二十世纪70年代，发现Ti质粒与病原性相关，而且作为Ti质粒的一部分的T-DNA被重组到植物染色体组。之后明白了该T-DNA上存在与合成诱发肿瘤所必要的激素(细胞分裂素和植物生长激素)相关的基因，尽管是细菌基因却在植物中发现了。在切割T-DNA与向植物的传递中，在Ti质粒上的病毒结构域(vir结构域)中存在的基因组是必要的，此外为了将T-DNA切出得到，T-DNA两端上存在的边界序列(ボ-ダ-配列)是必要的。作为其他的土壤杆菌属细菌的毛根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)也具有根据Ri质粒的同样的系统(例如特开2000-342256的图3和图4)。
因为由于土壤杆菌的感染，T-DNA可以重组到植物染色体组中，因此如果在T-DNA上插入所需要的基因，期望能将该基因重组到植物染色体中。然而，因为Ti质粒是190kb或190kb以上非常大，用标准的基因工程方法在质粒上的T-DNA上插入基因是困难的。因此，开发了为在T-DNA上插入外源基因的方法。
首先，制备了从肿瘤性Ti质粒的T-DNA上去除了激素合成基因的解除型菌系(disarmed strains)LBA4404(Hoekema等，1983)、C58C1(pGV3850)、GV3Ti11SE等。通过使用这些，开发了2种方法将所要的基因导入到土壤杆菌的Ti质粒T-DNA中，或者将具有所要基因的T-DNA导入到土壤杆菌中。其中的一种是进行容易的基因操作就可能插入所要的基因方法，该方法通过三系杂交法(triparental mating)，通过同源重组，将在大肠杆菌中能够复制的中间载体导入到土壤杆菌的解除型Ti质粒的T-DNA结构域中，称作中间载体法。
还有一种是称作双元载体(binary vector)法，该法是基于在将T-DNA重组到植物中时，需要有病毒(vir)结构域，但没有必要为了机能而存在于同一质粒上。在该vir结构域中存在有virA、virB、virC、virD、virE以及virG，(植物生物技术事典(エンタプライズ株式会社发行(1989)))，所谓vir结构域，是指包含全部virA、virB、virC、virD、virE以及virG。因此，双元载体是将T-DNA重组到可在土壤杆菌和大肠菌双方中复制的小质粒中的东西，将其导入到具有解除型Ti质粒的土壤杆菌中来使用。
在向土壤杆菌导入双元载体时，可以通过电穿孔法或三系杂交法等公知的方法进行。在双元载体中，有pBIN19、pBI121、pGA482等，以这些为基础，构建了大量的新型双元载体用于转化。此外，在Ri质粒系统中，也构建了同样的载体用于转化。
土壤杆菌A281是强病原性(super-virulent)菌系，其宿主范围广，转化效率比其他菌系高。该特性是由于A281具有的Ti质粒的pTiBo542。使用pTiBo542到目前开发了2种新系统。一种是使用了具有pTiBo542解除型Ti质粒的菌系EHA101以及EHA105，由于适用于上述双元载体系统，这些作为转化能力高的系统而在各种植物的转化中被利用。
还有一种是超级双元载体(“super-binary”vector)(Hiei等，(1994)；Ishida等，(1996)；Komari等，(1999)；WO95/06722)系统(例如特开2000-342256的图4)。由于该系统是由具有vir结构域(virA、virB、virC、virD、virE以及virG(以下也将这些各叫做“vir片段结构域”))的解除型Ti质粒以及具有T-DNA的质粒组成，因此是双元载体系统的一种。但在使用超级双元载体这点上是不同的，超级双元载体是在具有T-DNA的端的质粒上，即在双元载体上，重组了基本上去除了vir片段结构域中至少一种vir片段结构域的vir结构域片段(其中优选至少含有virB或virG的片段，更优选含有virB和virG的片段)。此外，在具有超级双元载体的土壤杆菌中导入重组了所要基因的T-DNA结构域时，通过三系杂交法的同源重组可作为容易的手法来利用。
在本发明方法中，作为成为宿主的的土壤杆菌属细菌，没有特别的限制，可以优选使用根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)(例如上述的土壤杆菌LBA4404(Hoekema等，1983)以及EHA101。
根据本发明的方法，只要是基于土壤杆菌属细菌中病原性(vir)结构域的基因组的表达的基因导入系，可以没有特别的限制就能得到有意义的效果。因此，对于上述的中间载体、双元载体、强病原性双元载体、超级双元载体等中的任何载体系统都可以使用，可以取得本发明的效果。在使用将这些载体改变的不同载体系统时，也是同样的(例如将土壤杆菌属细菌vir结构域的一部分或者全部切除，然后重组到质粒中，将vir结构域的一部分或者全部切除，作为新的质粒的一部分导入到土壤杆菌中等)。此外，根据本发明的方法，在野生型的土壤杆菌属细菌中，也可以提高野生型T-DNA结构域向植物的导入效率，事实上提高感染效率。
期望向植物中导入的基因可以基于以下适当的选择标准来选择可以通过常规方法重组到上述质粒的T-DNA结构域中的限制酶部位中，对在该质粒上同时或者是以别的途径重组的卡那霉素、巴龙霉素等药物具有耐药性的基因等。由于体积大，具有多数限制部位的，以通常亚克隆手法将期望的DNA导入到T-DNA结构域内不是都容易。在这样的情况下，可以通过三系杂交法，利用土壤杆菌属细菌细胞内的同源重组，将目的DNA导入。尽管是非限定性的，但被导入的基因的大小优选是大约100bp～200kbp。
此外，将质粒导入到根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)等土壤杆菌属细菌中的操作可以通过现有方法进行，举例的话包括上述的三系杂交法或电穿孔法、电子注射法、PEG等化学处理的方法。
想要导入到植物中的基因，与现有技术一样，基本上是配置在T-DNA的左右边界序列之间的。然而，因为质粒是环状的，边界序列的数可以是1，在想要将多个的基因配置在不同部位上时，边界序列也可以是3个或3个以上。此外，在土壤杆菌属细菌中，可以配置在Ti和Ri质粒上，或者也可以配置在其他质粒上。甚至，也可以配置在多种类的质粒上。
关于工序c)通过土壤杆菌属细菌进行基因导入的方法，可以通过使植物材料与土壤杆菌属细菌单独的接触来进行。例如，可以通过制备大约106～1011细胞/ml程度的细胞浓度的土壤杆菌属细菌悬浮液，将植物材料在该悬浮液中浸渍3～10分钟左右，在固体培养基上进行数日的共培养来进行。
优选在使土壤杆菌感染植物材料的同时，或者感染之后除去土壤杆菌之前，将植物材料与土壤杆菌共培养。在共培养中使用公知的培养基。例如，在实施例中使用的nN6-As培养基、nNB-As培养基、LS-AS培养基或者其他、N6S3-AS培养基、2N6-AS培养基(Hiei，Y等，1994))等培养基是已知的。
在本发明中，在使土壤杆菌感染植物材料的工序c)之前或者进行中时，也可以对植物材料进行选自以下的至少一种处理加压处理、热处理、离心处理、以及超声处理。已知这些处理在通过土壤杆菌属细菌向植物材料导入基因的方法中也会提高基因的导入效率。例如，关于离心处理，例如在WO 02/12520、特开2000-342256中被记载，优选以100G～25万G、进行离心1秒～4小时。关于热处理，例如特开2000-342255中被记载，优选在33℃～60℃的温度范围内，进行热处理5秒～24小时。进一步，关于超声处理，例如在Trick和Finer 1997、Amoah等2001中被记载。
这些加压、加热、离心等处理，可以进行任意1种，也可以多种组合来进行。例如特开2000-342253记载了关于将热处理和离心处理组合来进行。
关于工序d)以及e)进一步根据要求，为了得到转化体，在上述工序c)之后，必需进行d)筛选转化细胞的工序；以及e)根据要求，将筛选的转化体进行再分化的工序即，一般地，为了进行植物的转化，在将外源基因导入到植物细胞后，筛选外源基因稳定地重组到染色体上的植物细胞是必要的。
筛选被转化细胞的工序是指，筛选具有表型的数据以及物理数据至少之一、优选二者的目的性状的细胞。
表型的数据例如转化效率可以通过进行以下评价来得到与所要导入到植物中的基因一起，导入标记基因和/或选择标记基因，评价其表达。作为标记基因和/或选择标记基因，可以使用例如GUS(β-葡糖醛酸酶)基因、或耐抗生素基因(例如耐PPT(フオスフイノスライシン)基因、耐卡那霉素基因)等。作为标记基因使用GUS基因时，转化效率的评价可以通过由X-gulc(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸)的GUS的切割而伴随的显色来评价。作为选择标记基因使用耐抗生素基因时，在转化后，可以由在加有抗生素的选择培养基上生长的情况来评价。
进一步，为了确认外源基因稳定地重组到染色体上，优选得到Southern印迹等的物理数据。更优选通过有性生殖向后代传递的工序、以及基于向后代基团的遗传性以及分子性分析的选择的工序。
也可以根据所要进行筛选的转化体的再分化，培育再分化个体，然后得到完整的植物体。在由筛选的转化细胞再生长成完整的植物体中，可以根据公知的方法(例如Hiei等1994；Ishida等1996)进行。
本发明方法，与不进行加压处理的情况相比较，提高了基因导入效率以及/或转化效率。基因导入效率可以通过例如评价导入的基因的暂时性表达范围来进行评价。在后面的实施例中，将未成熟胚的胚盘中的GUS基因的暂时性表达评价为1(散见点状的表达)～5(整个胚盘均见表达)的5个阶段指数。或者，在全体的表达量较低的情况下，也可以通过计算所有的点数来评价。
转化效率可以通过例如将由接种的未成熟胚得到的再分化植物中显示了GUS基因表达的作为转化体来计数，以接种的未成熟胚的数除其总数来算出。或者也可以通过将再分化植物中对于筛选压力显示出抵抗性的作为转化体来计数，以接种的未成熟胚的数除其总数来算出。
本发明还提供生产转化植物的方法。本发明的方法包括1)将植物材料进行加压处理，2)使土壤杆菌感染植物材料，3)筛选转化细胞，然后4)将所要筛选的转化体进行再分化。
效果本发明开发了比现有的土壤杆菌法更高效率地进行基因导入的廉价并且简单的方法。此外，提供对认为用现有土壤杆菌法进行基因导入很困难的植物种以及品种也适用的方法。本发明的方法与未进行加压处理的情况相比较，提高了基因导入效率及/或转化效率。
如
图1所示，通过在单子叶植物水稻中进行加压处理，与未处理的情况相比较，基因导入效率提高到2倍～3倍。此外，如图3所示，通过在双子叶植物烟草中进行加压处理，与未处理的情况相比较，基因导入效率提高到3倍～4倍。据此，通过使用本发明的方法，优选将基因导入效率实质性提高，更优选提高2倍或2倍以上。此外，转化效率如表1所示的那样，在水稻中通过进行加压处理，与未处理的情况相比较，提高到3倍～9倍。据此，通过使用本发明的方法，优选将转化效率实质性提高，更优选提高3倍或3倍以上。
附图的简单说明
图1显示在气体中加压处理对基因导入效率带来的效果(水稻，品种ゆきひかり)。对照无前处理；pres.w/o water气体中+5.7atm，5分钟加压处理；在水中加压蒸馏水中+6.6atm，5分钟加压处理。各处理后，接种LBA4404(pSB134)，进行7天共培养后，进行GUS分析。
图2显示加压处理对基因导入效率带来的效果(玉米)。A无前处理(对照)；B15,000rpm，10分钟离心处理；C+3.2atm，10分钟加压处理；D+6.6atm，5分钟加压处理。各处理后，接种LBA4404(pSB131)，进行3天共培养后，进行GUS分析。
图3显示加压处理对基因导入效率带来的效果(烟草，品种プチハバナSR1)。对照无前处理；加压+6.6atm，5分钟加压处理。各处理后，接种LBA4404(pSB134)，进行4天共培养后，进行GUS分析。
实施例以下通过实施例具体地说明本发明，但这些不限制本发明的技术范围。本领域人员可以基于本说明书容易地对本发明添加修饰或变更，这些也包含在本发明的技术范围内。
实施例1加压对水稻的转化带来的效果(1)加压处理在5mL的一次性注射器的前端上插入前端加热破碎了的微量加样器吸头，以适当长度切掉后，用石蜡膜盖住前端。向注射器中加入土壤杆菌混悬用液体培养基(AA 主要无机盐、LS 微量无机盐、MS 维生素、AA 氨基酸、0.2g/L 酪蛋白水解物、4g/L 蔗糖、2g/L 葡萄糖，pH5.2)或者无菌蒸馏水3mL，向其中加入无菌采取的未成熟胚(品种コシヒカリ，朝の光)。此外，向没有加入培养基或蒸馏水等液体的注射器中加入采集的未成熟胚(品种ゆきひかり)。将注射器组合，用夹子夹住注射器，通过夹紧夹子来提高注射器内的压力。在加压的状态下于室温静置。加压的强度由注射器内空气体积的减少率算出。对照是将几乎相同数量的未成熟胚采集到装有液体培养基或无菌蒸馏水的2mL埃彭道夫管中，于室温静置。
(2)接种在土壤杆菌的菌系以及土壤杆菌质粒载体中，使用根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)超级双元载体LBA4404(pSB134)(具有在T-DNA结构域上结合有玉米泛素启动子驱使的泛激素(ユビキチン)内含子的HPT基因，以及具有结合了以花椰菜花叶病毒35S启动子驱使的蓖麻过氧化氢酶内含子的GUS基因)。pSB134的制备是在pKY205(Komori等WO03/027290)上，通过将作为表达标记的由pSB32得来的35S-intron GUS-nos片段插入到Hind III部位中来进行的。
将注射器从夹子中取出，将注射器内的未成熟胚转移至装有液体培养基的2mL埃彭道夫管中，在含有50mg/L潮霉素(ハイグロマイシン)和50mg/L 壮观霉素(スペクチノマイシン)的AB培养基上培养3～4天，以白金接种环挑取LBA4404(pSB134)，混悬于含有100μM 乙酰丁香酚的大约109cfu/ml浓度的液体培养基1ml中。向除去了液体培养基的埃彭道夫管中加入土壤杆菌悬浮液1ml，用旋涡混合器搅拌30秒后，于室温静止5分钟。将未成熟胚在nN6-As培养基(N6 无机盐、N6 维生素、0.5g/L 酪蛋白水解物、0.5g/L L-脯氨酸、1mg/L 2，4-D、0.5mg/L NAA、0.1mg/L 6BA、20g/L蔗糖、10g/L 葡萄糖、10μM AgNO3、100μM 乙酰丁香酚、8g/L 琼脂糖、pH5.2)或者nNB-As培养基(N6 主要无机盐、B5 微量无机盐、B5 维生素、0.5g/L酪蛋白水解物、0.5g/L L-脯氨酸、2mg/L 2，4-D、1mg/L NAA、1mg/L 6BA、20g/L 蔗糖、10g/L 葡萄糖、100μM 乙酰丁香酚、8g/L 琼脂糖、pH5.2)上接种，于黑暗下在25℃培养1周。
(3)筛选、再分化用解剖刀将共培养后的未成熟胚分成4～6份，接种在nN6CC培养基(N6 无机盐、N6 维生素、0.5g/L 酪蛋白水解物、0.5g/L L-脯氨酸、1mg/L2，4-D、0.5mg/L NAA、0.1mg/L 6BA、20g/L 蔗糖、55g/L 山梨醇、250mg/L头孢噻肟(セフオタキシム)、250mg/L 羧苄西林、5g/L 凝胶剂(ゲルライト)、pH5.8)或者NBK4CC培养基(NBK4 主要无机盐、B5 微量无机盐、B5 维生素、AA 氨基酸、0.5g/L 酪蛋白水解物、0.5g/L L-脯氨酸、1mg/L 2，4-D、0.5mg/L NAA、0.1mg/L 6BA、20g/L 麦芽糖、55g/L 山梨醇、250mg/L 头孢噻肟、250mg/L 羧苄西林、5g/L 凝胶剂、pH5.8)中。
于照明下28℃培养1周后，将愈伤组织分成5份，接种在含有50mg/L潮霉素的nN6CC培养基或者NBK4CC培养基中，在相同条件下培养10天。将增殖的细胞块接种在含有50mg/L潮霉素的再分化培养基(N6 无机盐、N6 维生素、AA 氨基酸、1g/L 酪蛋白水解物、0.5mg/L 细胞分裂素(カイネチン)、20g/L 蔗糖、30g/L 山梨醇、4g/L 凝胶剂、pH5.8)或者(NBK4 主要无机盐、B5 微量无机盐、B5 维生素、AA 氨基酸、1g/L 酪蛋白水解物、2mg/L 细胞分裂素、20g/L 麦芽糖、30g/L 山梨醇、5g/L 凝胶剂、pH5.8)中(4)GUS分析将从共培养后的未成熟胚及再分化个体切取的叶片浸渍于含有0.1％的Triton X-100的0.1M磷酸缓冲液(pH6.8)中，于37℃静置1小时。用磷酸缓冲液除去土壤杆菌后，添加含有1.0mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(X-gluc)以及20％甲醇的磷酸缓冲液。于37℃处理24小时后，于显微镜下观察，考察呈蓝色的组织。
(5)转化效率的计算转化率的计算具体如以下进行。
在接种土壤杆菌的水稻未成熟胚中，在胚盘的大范围内观察到了表示GUS基因的暂时性表达的点。即使从1个胚盘分离的部位观察到的点，也认为是来自于每个被基因导入的独立的转化细胞。在共培养后以及静置(レステイング)培养后将增殖的未成熟胚分成4～6块的情况下，认为即使是来自1个未成熟胚，由分割得到的20～30个细胞块在潮霉素存在下增殖而来的愈伤组织及其再分化植物各自是独立的转化体。
将从分割而得到的细胞块增殖而来的抗潮霉素愈伤组织，从1个细胞块中选择1个愈伤组织，接种在含有潮霉素的再分化培养基中。将由此得到的再分化植物中显示了GUS基因的表达，作为转化体计数，用接种的未成熟胚个数除其总数，算出转化效率。
(6)加压强度对基因导入效率带来的效果将取出的品种“コシヒカリ”的未成熟胚加入到装有液体培养基的注射器中，分别施加0(常压)、0.6、1.4、3.2、6.6atm的压力15分钟后，浸渍于土壤杆菌混悬液中。在共培养基上培养1周后，考察GUS基因的暂时性表达。在以常压处理的对照未成熟胚中，尽管零散可见到胚盘的大约一半被染成蓝色的未成熟胚，但是大多是显示在胚盘表面上有点状的表达。以0.6atm强度加压的未成熟胚，显示了与对照的未成熟胚同样的表达样式。与此相对比的，以1.4atm强度加压的未成熟胚的大约半数被染色成蓝色。而且，以3.2以及6.6atm强度加压的未成熟胚，几乎所有的都是胚盘的整个表面被染成蓝色，显示了基因导入效率显著提高。
(7)加压时间对基因导入效率带来的效果将取出的品种“コシヒカリ”的未成熟胚加入到装有液体培养基的注射器中，施加+6.6atm的压力0、1、3、5或60秒后，浸渍于土壤杆菌混悬液中。在共培养基上培养1周后，考察GUS基因的暂时性表达。以0秒(常压)处理的对照未成熟胚在胚盘表面上显示了点状表达。与此相对比的，以+6.6atm强度加压1秒的未成熟胚，其几乎所有都在胚盘的整个表面显示暂时性基因表达。在加压3秒或3秒以上的未成熟胚中，也显示与1秒同样的表达样式，即使极短时间的加压处理，也显示了使基因导入效率显著提到的效果。
(8)土壤杆菌共存、非共存条件下的加压处理对转化效率带来的效果将取出的品种“コシヒカリ”的未成熟胚分别加入到装有无菌蒸馏水、液体培养基以及含有混悬有约1×109cfu/ml土壤杆菌LBA4404(pSB134)的100μM乙酰丁香酚的液体培养基的注射器中，以+6.6atm强度加压15分钟。在土壤杆菌混悬液中加压的未成熟胚，在加压后接种在共培养基上。在无菌蒸馏水以及液体培养基中加压的未成熟胚，加压后，浸渍于土壤杆菌混悬液后，接种在共培养基上。考察共培养1周的未成熟胚的GUS基因的暂时性表达。没有加压处理的对照的未成熟胚中，一部分的未成熟胚在胚盘的大约一半呈现蓝色，但是几乎所有的未成熟胚显示了点状表达。与此相对比的，加压处理的未成熟胚，不论与土壤杆菌共存还是非共存，供分析的未成熟胚全部都是在胚盘的整个表面上显示GUS基因的表达。在无菌蒸馏水、液体培养基之间也未见差别。
将在无菌蒸馏水中加压处理的未成熟胚以及与在土壤杆菌共存下加压处理的未成熟胚于含有潮霉素的培养基中培养，进行转化植物的筛选、再分化。在无菌蒸馏水中加压后，由接种了土壤杆菌的12个未成熟胚，得到63个系的潮霉素抗性并且GUS阳性的转化植物。转化效率是525％。另一方面，由在土壤杆菌混悬液中加压处理的12个未成熟胚，得到54个系的转化植物，效率是450％。
没有与土壤杆菌共存而加压处理的情况是，比与土壤杆菌共存下加压处理的时候转化率还要高，由此可以明确，由于本法中所见的加压处理而致的基因效率提高的效果，不是由于加压促进土壤杆菌向植物组织的浸透。即，表明本发明是通过与Teasdale等(WO99/48335)所述的作用机制完全不同的作用来提高基因导入效率的。
(9)气体中的加压处理对基因导入效率带来的效果将取出的品种“ゆきかり”品种未成熟胚分别加入到未装液体的注射器以及装有无菌蒸馏水的注射器中。未装液体的注射器以+5.7atm的强度加压5分钟。装有无菌蒸馏水的注射器以+6.6atm的强度加压5分钟。将加压的未成熟胚恢复常压后，浸渍于土壤杆菌混悬液中，接种在共培养基上。对照的未成熟胚在无菌水中在常压静置5分钟后，浸渍在土壤杆菌混悬液中，接种在共培养基上。以1(散见点状的表达)～5(整个胚盘均见表达)的5个阶段指数，考察共培养1周的未成熟胚的胚盘中GUS基因的暂时性表达。在气体中加压的未成熟胚的表达，与在蒸馏水中加压的未成熟胚相比，稍微差一些，但与没有处理的对照的未成熟胚相比，显示出明显的大范围表达(
图1)。
像这样，可知因加压而致的提高基因导入效率的效果，不仅是在将土壤杆菌接种前的植物组织在液体中加压的情况下，而且在在气体中加压的情况下也同样可见。
(10)加压处理对转化效率带来的效果将取出的未成熟胚(品种コシヒカリ，朝の光)加入到装有液体培养基的注射器中，施加+6.6atm的压力15分钟后，浸渍于土壤杆菌混悬液中。在共培养基上培养1周后，在含有潮霉素的培养基中培养，筛选转化植物，进行再分化。切取再分化的潮霉素抗性植物的叶子的一部分，进行GUS分析。结果显示于表1。
表1加压处理对转化效率带来的效果(水稻品种コシヒカリ、朝の光)
HmR，GUS+潮霉素抗性、GUS阳性加压处理的未成熟胚显示是没有处理的未成熟胚的3～9倍以上的转化效率，可知加压处理对提高转化效率极具效果。
实施例2加压对玉米的转化带来的效果无菌取出大小约为1.2mm的玉米未成熟胚(品种A188)，浸渍于土壤杆菌混悬用液体培养基(LS-inf，Ishida等，1996)中。将未成熟胚加入到装有液体培养基的注射器中，通过缩小夹着注射器的夹子的幅度来进行加压处理。以加压强度+6.6atm、5分钟，或者+3.2atm、10分钟来进行。离心分离是将未成熟胚加入到装有液体培养基的埃彭道夫管中，离心机15,000rpm，40℃，离心10分钟进行分离。将加压或离心处理的未成熟胚，浸渍于含有混悬有大约109cfu/ml土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404(pSB131)菌株(Ishida等，1996年)的100μM乙酰丁香酚LS-inf培养基中后，接种于LS-AS共培养基。于25℃黑暗下培养3日后，进行GUS分析。对照的未成熟胚在采集后，浸渍于液体培养基后，按照相同的方法接种土壤杆菌。
对照的未成熟胚显示在胚盘表面上蓝色点状的GUS基因的暂时性表达。在加压处理或离心处理后接种土壤杆菌的未成熟胚中，显示了胚盘的大约1/3都被染色成蓝色的区域状表达。尤其是+3.2atm、10分钟加压的未成熟胚中，很多个胚盘的整个表面都显示了GUS基因表达的未成熟胚(图2)。通过将土壤杆菌接种前的植物组织进行离心处理来提高转化效率已有报道(Hiei等，WO02/12520)。
由这些可知，加压处理是不仅对水稻，而且在其他单子叶植物的玉米中也具有提高基因导入效率的作用，并且其效果与已有报道的离心处理的效果相同或更好。
实施例3加压对烟草转化效率带来的效果将烟草(品种プチハバナSR1)的展开叶以常规方法灭菌后，切成大约1cm方形的叶片。将对照的叶片浸渍于混悬有根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404(pSB134)的LS-R培养基(Komari，1990)中后，于25℃缓慢振荡15分钟后，浸渍于LS-R培养基，于25℃黑暗下培养4日后。加压区的叶片在装有LS-R培养基的注射器中加压+6.6atm、15分钟后，以与对照叶片同样的方法接种土壤杆菌，进行培养。对共培养后的叶片进行GUS分析。
根据GUS分析后的各个叶片显示的GUS基因的表达部位的大小，以0(没有表达)～3(在整个叶片上表达)的4个阶段指数进行考察。结果于图3显示。对照的叶片中，在叶的切割部分显示GUS表达的叶片很多，在叶片中从切割部分向内的很大范围内几乎没有看到表达。与此相对比的是，加压处理后接种了土壤杆菌的叶片中，几乎所有的叶片在切割部分以及内部的大范围内呈现深蓝色，显示在大范围内导入了基因。由此可知，加压处理不仅是对水稻、玉米等单子叶植物，而且在双子叶植物中也具有提高基因导入效率的效果。
实施例4加压处理对愈伤组织增殖带来的效果将取出的品种“コシヒカリ”未成熟胚在土壤杆菌混悬用液体培养基中以+6.6atm的强度加压15分钟后，接种于NBK4CC培养基上。对照的未成熟胚在常压下在相同培养基中浸渍后，接种于NBK4CC培养基上。测定25℃黑暗下培养1周后10个未成熟胚的鲜重。试验重复进行5次。两个区都没有进行土壤杆菌的接种。结果显示于表2。
表2加压处理对细胞增殖带来的效果(水稻，品种コシヒカリ)
考察加压处理后培养1周的未成熟胚的鲜重。
没有进行土壤杆菌的接种。
将对照的未成熟胚培养1周时的平均鲜重是66.3mg/10个未成熟胚。加压处理后，培养相同时间的未成熟胚是75.1mg/10个未成熟胚，确认具有有意义的差别。培养1周的对照的未成熟胚，胚盘表面少许愈伤组织化，呈现淡淡的黄白色。与此相对比的是，加压处理的未成熟胚中，可见瘤状的愈伤组织化，显示比对照更深的黄白色。即使在用肉眼的观察中，也确认了加压处理的未成熟胚更旺盛的增殖。像这样可知，加压处理不仅提高基因导入效率，而且具有活跃细胞增殖的作用。
通过作为本发明的效果之一的高压力短时间处理而致的植物组织细胞增殖率的提高，与通过以施加+0.5atm的低压1～10周的状态进行培养而提高可形成胚的愈伤组织形成率的美国专利第6,492,174号的方法相比，不仅处理条件不同，而且作为处理的结果而得到的效果也是不同的，由此认为是由于其他的机理而致的。
权利要求
1.通过土壤杆菌属细菌介导来进行将基因导入到植物材料中的方法，本发明的方法包含以下工序1)将植物材料进行加压处理，然后2)使土壤杆菌感染植物材料。
2.权利要求1所述的方法，其中加压处理在1.7气压～10气压的范围内进行。
3.权利要求2所述的方法，其中加压处理在2.4气压～8气压的范围内进行。
4.权利要求1～3中任一项所述的方法，其中加压处理进行0.1秒～4小时。
5.权利要求4所述的方法，其中加压处理进行1秒～30分钟。
6.权利要求1～5中任一项所述的方法，其中加压处理在液体中或气体中进行。
7.权利要求1～6中任一项所述的方法，其中还包括在使土壤杆菌感染植物材料的工序2)之前或之中，对植物材料进行选自热处理、离心处理、超声处理中的至少1种处理。
8.权利要求1～7中任一项所述的方法，其中植物材料是单子叶植物。
9.权利要求1～7中任一项所述的方法，其中植物材料是水稻或玉米。
10.权利要求1～7中任一项所述的方法，其中植物材料是双子叶植物。
11.权利要求1～7中任一项所述的方法，其中植物材料是烟草。
12.权利要求1～11中任一项所述的方法，其中植物材料未成熟胚。
13.权利要求1～12中任一项所述的方法，其中在使土壤杆菌感染植物材料的工序2)之后，还包括以下工序3)筛选转化体，然后4)将所要筛选的转化株进行再分化。
14.权利要求1～13中任一项所述的方法，其与不进行工序1)的加压处理的情况相比较，基因导入效率提高。
15.生产转化植物的方法，包括1)将植物材料进行加压处理，2)使土壤杆菌感染植物材料，3)筛选转化细胞，然后4)将所要筛选的转化体进行再分化。
全文摘要
本发明涉及通过土壤杆菌属细菌来进行将基因导入到植物材料中的方法。本发明的方法以包含以下工序为特征1)将植物材料进行加压处理，然后2)使土壤杆菌感染植物材料。
文档编号A01H1/00GK1867675SQ20048002989
公开日2006年11月22日 申请日期2004年8月5日 优先权日2003年8月13日
发明者石田佑二 申请人:日本烟草产业株式会社