专利名称：昆虫病原线虫共生菌的分段供氧发酵工艺及其发酵物用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌的发酵工艺，具体说是一种提高昆虫病原线虫共生菌抗菌活性的分段供氧发酵工艺及其发酵物用途。
背景技术：
昆虫病原线虫共生菌是寄生于昆虫病原线虫肠道内的一类细菌，属肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，兼性厌氧、化能异养，革兰氏染色阴性。包括致病杆菌属(Xenorhabdus)和光杆状菌属(Photorhabdus)，分别与斯氏线虫属(Steinernema)和异小杆线虫属(Heterorhabditis)线虫共生。在自然界，此类细菌存在于三龄侵染期线虫的肠道内，随着线虫对昆虫的侵染，共生菌被携带到昆虫体内并释放到寄主血腔中，共生菌大量繁殖，产生毒素和抑菌物质，与线虫共同作用，杀死寄主昆虫。
自从Dutky(1959)提出昆虫病原线虫共生菌具有抗微生物活性的假设，直到1981年才paul et al.才从共生菌Xenorhabdus spp.中分离鉴定出几种抑菌化合物。对共生菌产生的抑菌物质的化学本质及其生物活性已有较为详细的阐(Frost，S.and Nealson，K.(1996)Molecular biology of thesymbiotic-pathogenic bacteriaXenorhabdus spp.and Photorhabdus spp.Microbiological Reviews 60，21-43.；Li，J.，Hu，K.and Webster，J.M.(1998)Antibiotics from Xenorhabdus spp.and Pthotorhabdusspp.(Enterobacteriaceae).Chemistry of Heterocyclic Compounds 34，1561-1570.)。共生菌产生的抑菌物质具有较广的抑菌谱，对细菌、真菌(包括人类致病菌)和酵母菌具有抑制作用，并对多种药物产生抗性的一些人类致病细菌具有较强的抑制作用，也具有抗肿瘤活性，在医药上具有较大的应用潜力，特别是一些具有抗真菌和杀线虫活性的代谢产物及其衍生物在农业上有较好的应用前景。
到目前为止，已从Xenorhabdus和Photorhabdus中分离鉴定出30多种具有生物活性的次生代谢产物。其中包括puromycin和madumycin II，这两种物质首先是从Streptomyces中分离出的。Xenorhabdus次生代谢产物的种类多于Photorhabdus。Xenorhabdus bovienii主要产生Xenorhabdins，Xenorhabdus nematophilus产生Xenocoumacins，而Photorhabdus则主要产生Hydroxystibenes和Anthraquinones。这些代谢产物不仅有多种化学结构，而且在医药和农业上有广泛的生物活性，如抗细菌、真菌、杀虫、杀线虫、抗溃疡、抗肿瘤和抗病毒作用。
抑菌物质的产生与共生菌的菌株和培养条件有关。Xenorhabdus spp在1.0％的蛋白胨培养基中不产生抑菌物质，而在酵母提取物培养基、LB培养基、海水培养基和TSB培养基中可以产生抑菌物质。X.nematophilus ALL在TSB培养基中产生的Xenocoumacins1和2的产量为300和100mg.L-1。在酵母提取物培养基中，Xenorhabdus sp.Q1在连续培养条件下，Xenorhabdins1和2的产量为10.8和36.4mg.L-1。在TSB培养基中，X.bovienii在分批培养条件下主要产生Xenorhabdins。
不同培养时间抑菌物质的产生也有一定的差异。共生菌在TSB培养基中，nematophin的浓度在不同的培养时间相差5倍。在培养的1-2d nematophin的浓度急剧增加，然后维持在较高的水平。X.bovienii产生的indoles2和indoles4的产量在培养的第1d达到最大，分别为17.00和11.56μg.ml-1，然后产量逐渐降低；而indoles1和indoles3在培养第1d的产量最小，分别为24.42和18.87μg.ml-1，随培养时间的延长产量逐渐增加。这说明indoles2和indoles4是在共生菌生长早期合成的，随后逐渐降解为indoles1和indoles3。Indoles是通过色氨酸合成的，它保留了色氨酸上的亚甲基碳，去除了羧基碳，这是因为向培养基中添加色氨酸可以提高indoles的产量。不同培养条件下P.luminscens产生的ST的量有较大的差异，即是同一菌株。
型态变化、培养温度和溶氧条件影响共生菌的生长和抑菌物质的产生。初生型共生菌可以产生抑菌物质，而次生型则不能；在体外培养中，共生菌能发生型态变化，这是影响抑菌素产生的一个主要问题。X.nematophilus D1在35℃的抑菌活性远低于15-30℃。Xenorhabdus和Photorhabdus是兼性厌养菌，氧气是其生长和抑菌物质产生所必须的。共生菌在封闭的容器中，在不振荡的条件下不产生抑菌素。
如前所述，共生菌在不同培养基和不同培养时间次生代谢产物有一定的差异；其型态变化、培养温度和溶氧条件等影响共生菌的生长和抑菌物质的产生。对共生菌的培养发酵与次生代谢产物的产生的相关技术和方法的文献或专利未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对昆虫病原线虫共生菌在培养发酵技术和方法上的不足，以嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophilus YL001为材料(该菌是从陕西杨陵筛选的一种线虫Steinernema sp中分离获得，经鉴定并命名为Xenorhabdus nematophilus YL001。)。针对该菌建立了一套分段供氧提高昆虫病原线虫共生菌抗菌活性的发酵工艺。本发明的具体工艺步骤是1.将种管保存的嗜线虫致病杆菌，划线于NA培养基平板上，28℃培养24～48h，挑取单菌落，再划线于NBTA培养基平板上，28℃培养24～48h；2.用接种环挑取NBTA培养基平板上的蓝色菌落，接种于装有50ml NB培养基的250ml三角瓶中，28℃、180r/min振荡培养16-24h，成为一级种子液；3.将一级种子液按9.0％的接种量接入装有种子培养基的250ml三角瓶中，装液量为25ml，pH 7.2，在26℃、220rpm振荡培养16-24h，成为二级种子液；
4.在7L搅拌式发酵罐内加入4.5L发酵培养基，0.01％消泡剂，pH 7.2，离位0.1-0.15MPa蒸汽灭菌30min冷却至26℃，按9.0％接入二级种子液，26℃培养72h，获得发酵物。发酵过程调节通气量和搅拌转速，分段供氧，即可获得发酵物，将发酵物过滤，去除细胞得到发酵液。
其中所述的NA培养基为牛肉膏3.0g、蛋白胨5.0g、营养琼脂20g、水1000ml、PH 7.2～7.4。
其中所述的NBTA培养基为NA+(TTC 0.04g、BTB 0.025g)。
其中所述的NB培养基为牛肉膏3.0g、蛋白胨5.0g、水1000ml，PH 7.2～7.4。
其中所述的种子培养基为甘油5g、酵母提取物15g、1M-MgSO45ml、(NH4)2SO42g、1M-KH2PO45ml、1M-K2HPO45ml、1M-Na2SO410ml、水1000ml，PH 7.2。
其中所述的发酵培养基为(g/L)葡萄糖6.13、蛋白胨21.29、MgSO41.50、(NH4)2SO42.46、KH2PO40.86、K2HPO41.11、Na2SO41.72。
其中发酵过程调节通气量和搅拌转速分段供氧模式为0-10h，通气量1.5L/min、搅拌转速200rpm；10-40h，通气量2.5L/min、搅拌转速200rpm→425rpm→250rpm；40-72h，通气量2.0L/min、搅拌转速250rpm。
嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophilus YL001的发酵液的应用在于制备农用杀菌剂，该杀菌剂用于防治植物病害。
该杀菌剂由下列组分的体积百份比构成嗜线虫致病杆菌Xenorhabdusnematophilus YL001的发酵液60％-85％，助剂1％-5％，余为表面活性剂，上述组分的总和为100％。
所述的助剂是苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸等物质中的一种，表面活性剂为本领域工作人员公知的物质的组合物。
本发明的工艺特点在发酵过程中采用通过调节通气量和搅拌转速分段供氧的发酵新工艺，可满足共生菌在不同生长阶段对氧的需求，有利于细胞生长和代谢物的产生。不但提高了细胞的生长量、得率和生产强度，而且也提高了抗菌物质的产量、得率和生产强度，从而提高了原料的利用率，降低了生产成本。
该菌的发酵物对植物病原真菌烟草赤星菌、番茄早疫菌、南瓜枯萎菌、黄瓜炭疽菌、稻瘟菌和辣椒疫霉菌有较强的抑制作用；对水稻白叶枯菌、金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌等细菌亦有较强的抑制活性。发酵物可用于制备农用杀菌剂，防治植物病害。
具体实施例方式
以下将本发明的内容通过下列的较优的实施例作进一步的阐述，但这些实施例并不限制本发明的保护范围。
嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophilus YL001的获得A、首先用0.1％甲醛溶液将浸染期的昆虫病原线虫(IJs)(该线虫从陕西杨陵筛选获得，经鉴定为斯氏线虫Steinernema sp)浸泡消毒3次，每次30min，每次消毒完后用无菌水冲洗；随后用0.1％乙汞硫代水杨酸钠将线虫浸泡30min，消毒完后用无菌水冲洗3次，最后将消毒过的线虫加到NBTA培养基平板上进行分离；C、用10％的次氯酸钠或1％的升汞将侵染期昆虫病原线虫浸泡30min，然后用无菌水冲洗3次，将消毒过的线虫直接散布在NBTA培养基上进行分离。NBTA培养基平板在28℃、黑暗条件下培养3-5d，线虫释放出共生菌，形成蓝绿色菌落，周围培养基中的染料被吸收变为黄色，即可得到昆虫病原线虫共生菌，经鉴定并命名为Xenorhabdus nematophilus YL001。
其中所述的NBTA培养基为牛肉膏3.0g、蛋白胨5.0g、营养琼脂20g、TTC 0.04g、BTB 0.025g、水1000ml、PH 7.2～7.4。
实施例11.将种管保存的嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophilus YL001，划线于NA培养基平板上，28℃培养24h，挑取单菌落，再划线于NBTA培养基平板上，28℃培养48h；2、用接种环挑取NBTA培养基平板上的蓝色菌落，接种于装有50ml NB培养基的250ml三角瓶中，28℃、180r/min振荡培养16-24h，成为一级种子液；3、将一级种子液按9.0％的接种量接入装有种子培养基的250ml三角瓶中，装液量为25ml，pH7.25，在26℃、220rpm振荡培养16-24h，成为二级种子液；4、在7L搅拌式发酵罐内加入4.5L发酵培养基，0.01％消泡剂，pH 7.2，离位0.1-0.15MPa蒸汽灭菌30min冷却至28℃，按9.0％接入二级种子液，在26℃、通气量2.5L/min、搅拌转速300rpm条件下，培养72h，获得发酵物。
NA培养基为牛肉膏3.0g、蛋白胨5.0g、营养琼脂20g、水1000ml、PH 7.2～7.4。
NBTA培养基为NA+(TTC 0.04g、BTB 0.025g)。
NB培养基为牛肉膏3.0g、蛋白胨5.0g、水1000ml，PH 7.2～7.4。
种子培养基为甘油5g、酵母提取物15g、1M-MgSO45ml、(NH4)2SO42g、1M-KH2PO45ml、1M-K2HPO45ml、1M-Na2SO410ml、水1000ml，PH 7.2。
发酵培养基为(g/L)葡萄糖6.13、蛋白胨21.29、MgSO41.50、(NH4)2SO42.46、KH2PO40.86、K2HPO41.11、Na2SO41.72。
实施例21、将种管保存的共生菌，划线于NA培养基平板上，28℃培养24～48h，挑取单菌落，再划线于NBTA培养基平板上，28℃培养24～48h；2、用接种环挑取NBTA培养基平板上的蓝色菌落，接种于装有50ml NB培养基的250ml三角瓶中，28℃、180r/min振荡培养16-24h，成为一级种子液；3、将一级种子液按9.0％的接种量接入装有种子培养基的250ml三角瓶中，装液量为25ml，pH 7.2，在26℃、220rpm振荡培养16-24h，成为二级种子液；4、在7L搅拌式发酵罐内加入4.5L发酵培养基，0.01％消泡剂，pH 7.2，离位0.1-0.15MPa蒸汽灭菌30min冷却至26℃，按9.0％接入二级种子液，26℃培养72h，获得发酵物。发酵过程调节通气量和搅拌转速，分段供氧。
其中所述的NA培养基为牛肉膏3.0g、蛋白胨5.0g、营养琼脂20g、水1000ml、PH 7.2～7.4。
其中所述的NBTA培养基为NA+(TTC 0.04g、BTB 0.025g)。
其中所述的NB培养基为牛肉膏3.0g、蛋白胨5.0g、水1000ml，PH 7.2～7.4。
其中所述的种子培养基为甘油5g、酵母提取物15g、1M-MgSO45ml、(NH4)2SO42g、1M-KH2PO45ml、1M-K2HPO45ml、1M-Na2SO410ml、水1000ml，PH 7.2。
其中所述的发酵培养基为(g/L)葡萄糖6.13、蛋白胨21.29、MgSO41.50、(NH4)2SO42.46、KH2PO40.86、K2HPO41.11、Na2SO41.72。
其中发酵过程调节通气量和搅拌转速分段供氧模式为0-10h，通气量1.5L/min、搅拌转速200rpm；10-40h，通气量2.5L/min、搅拌转速200rpm→425rpm→250rpm；40-72h，通气量2.0L/min、搅拌转速250rpm。
不同供氧模式发酵过程的主要参数
实施例3嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophilus YL001发酵液的应用在实施例1、2的基础上进行1.工艺中得到的发酵液进一步在14000r/min、4℃离心10min，收集上清液；2、用融化的PDA培养基将上清液和发酵物稀释10倍，分别将10ml培养基到入直径9.0cm的灭菌培养皿内，制成平板，以加无菌培养基的PDA为对照。从培养3～6d的植物病原真菌菌落边缘，用打孔器切成直径7.5mm的菌块，置于平板中央，于20℃黑暗条件下培养3d，测量各病原菌菌落直径；3、Xenorhabdus nematophilus YL001发酵物上清液，在100～300ml(发酵液)/L对烟草赤星菌、番茄早疫菌、南瓜枯萎菌、黄瓜炭疽菌、稻瘟菌和辣椒疫霉菌的菌丝生长有较强的抑制作用，抑制率在75～100％，其中发酵物对辣椒疫霉菌菌丝生长的抑制作用最高，EC50为16.3ml(发酵液)/L。
实施例4嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophilus YL001发酵液的应用在实施例1、2的基础上进行1、发酵液在14000r/min、4℃离心10min，收集上清液；2、将熔化的营养琼脂培养基冷却至45℃～50℃，加入供试病原细菌(1.5％V/V)摇均，每皿(d＝9.0cm)倒入15ml培养基，制好平板后，用打孔器(直径7.5mm)在平板上均匀的打三个孔，每孔内加入100μl共生菌发酵液或发酵物，以培养基为对照，在28℃培养24h，测量抑菌圈直径；3、X.nematophilus YL001的上清液和发酵物对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用(发酵液、发酵物的抑菌圈直径分别为26.50mm、25.25mm)；水稻白叶枯菌次之；对沙门氏菌的抑制作用较弱(发酵液、发酵物的抑菌圈直径分别为13.50mm、13.13mm)。
实施例5嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophilus YL001发酵液制备防治辣椒疫霉病的昆虫病原线虫共生菌杀菌剂的应用在实施例1、2的基础上进行取发酵物65升，农乳10025升，0.5kg/L苯甲酸钠水溶液10升，在反应釜中搅拌均匀，即得100升昆虫病原线虫共生菌杀菌剂。该杀菌剂用于防治辣椒疫霉病。
实施例6本实施例与实施例5不同的是，取发酵物80升，二丁基萘磺酸钠15升，0.5kg/L苯甲酸水溶液5升，在反应釜中搅拌均匀，即得100升昆虫病原线虫共生菌杀菌剂。其余同实施例5。
实施例7本实施例与实施例5不同的是，取发酵物65升，木质素磺酸钠25升，0.5kg/L山梨酸水溶液10升，在反应釜中搅拌均匀，即得100升昆虫病原线虫共生菌杀菌剂。其余同实施例5。
实施例8本实施例与实施例5不同的是，取发酵物70升，烃基萘磺酸盐的甲醛缩合物20升，0.5kg/L苯甲酸水溶液10升，在反应釜中搅拌均匀，即得100升昆虫病原线虫共生菌杀菌剂。其余同实施例5。
实施例9本实施例与实施例5不同的是，取发酵物65升，聚羧酸酯钠盐25升，0.5kg/L苯甲酸钠水溶液10升，在反应釜中搅拌均匀，即得100升昆虫病原线虫共生菌杀菌剂。其余同实施例5。
上述实施例还可以列举，只要是本领域公知的助剂都可以用于制备防治植物病害的昆虫病原线虫共生菌杀菌剂。
实施例10嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophilus YL001发酵物的应用在实施例5～实施例9的基础上进行从培养3～6d的辣椒疫霉菌菌落边缘，用打孔器切成直径7.5mm的菌块，置于含灭菌蛭石的花盆中，将辣椒种子用杀菌剂浸种6小时后，用清水冲洗两遍，播于含无菌蛭石纸杯中的辣椒疫霉菌块上，然后在上面覆一层无菌蛭石，并洒水。以蒸馏水浸种的为对照，在25℃培养，分别在第12天调查幼苗的发病情况，辣椒幼苗的病株减退率分别为60.6％。
实施例11嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophilus YL001发酵液的应用在实施例5～实施例9的基础上进行将已萌发的种子播于含无菌蛭石花盆中的辣椒疫霉菌块上，上面覆一层无菌蛭石，并洒水。在25℃培养24h，然后将浓度为100mL/L的昆虫病原线虫共生菌杀菌剂及1.7mL/L甲霜灵液体25mL分别浇灌于花盆中，以自来水为对照，以不含辣椒疫霉菌块的为健康对照。在25℃～28℃下培养12d，检查幼苗的发病情况，辣椒幼苗的病株减退率分别为74.34％；甲霜灵处理后辣椒幼苗的病株减退率分别为64.10％。
实施例12嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophilus YL001发酵液的应用在实施例5～实施例9的基础上进行将各供试杀菌剂按每亩使用剂量及用水量配制，清水为空白对照，每处理重复4次，每重复一个小区，小区面积为15～30m2。各小区在田间随机排列。
防治番茄和草莓灰霉病时，每亩用水60kg，防治黄瓜灰霉病，每亩用水45kg，施药用背负式喷雾器进行常规常量叶面喷雾。每隔7d施药1次，共施药4次。试验方法和药效统计方法按照农业部药检所颁布的方法进行。防治试验结果见表1、表2。
表1 实施例5杀菌剂防治番茄灰霉病药效试验结果(果实) 2005年4月 杨陵杨村南庄·陕西
注1表中同列数据后标相同字母者，表示在0.05水平上无显著差异；2本试验设在杨凌杨村乡南庄春茬温室番茄田，历年番茄灰霉病发生较重。土壤肥力中等，pH6.9；3施药前清除病果。
表2 实施例9杀菌剂防治黄瓜灰霉病药效试验结果 2005年3月 三原·陕西
注1、表中同列数据后标相同字母者，表示在0.05水平上无显著差异；2、本试验设在三原县渠岸乡大王庄村温室黄瓜田，历年灰霉病发生较重。土壤肥力中等；3施药前清除病果。
权利要求
1.一种昆虫病原线虫共生菌的分段供氧发酵工艺，其特征在于，发酵菌株为嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophilus YL001；并按下列步骤进行(1)将种管保存的上述嗜线虫致病杆菌，划线于NA培养基平板上，28℃培养24～48h，挑取单菌落，再划线于NBTA培养基平板上，28℃培养24～48h；(2)用接种环挑取NBTA培养基平板上的蓝色菌落，接种于装有50ml NB培养基的250ml三角瓶中，28℃、180r/min振荡培养16-24h，成为一级种子液；(3)将一级种子液按9.0％的接种量接入装有种子培养基的250ml三角瓶中，装液量为25ml，在26℃、220rpm振荡培养16-24h，成为二级种子液；(4)在7L搅拌式发酵罐内加入4.5L发酵培养基，0.01％消泡剂，pH7.2，离位0.1-0.15MPa蒸汽灭菌30min冷却至26℃，按9.0％接入二级种子液，26℃培养72h，发酵过程调节通气量和搅拌转速，分段供氧，即可获得发酵物，将发酵物过滤，去除细胞得到发酵液。
2.如权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，步骤(4)所述的种子培养基为甘油5g、酵母提取物15g、1M-MgSO45ml、(NH4)2SO42g、1M-KH2PO45ml、1M-K2HPO45ml、1M-Na2SO410ml、水1000ml，其PH为7.2。
3.如权利要求1所述分段供氧提高昆虫病原线虫共生菌抗菌活性的发酵工艺，其特征在于，步骤(5)所述的消泡剂为丙三醇聚氧丙烯聚氧乙烯醚。
4.如权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，步骤(6)所述的发酵培养基每升中含有下列重量的原料葡萄糖6.13g、蛋白胨21.29g、MgSO41.50g、(NH4)2SO42.46g、KH2PO40.86g、K2HPO41.11g、Na2SO41.72g。
5.如权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，步骤(4)所述的发酵过程调节通气量和搅拌转速分段供氧模式为0-10h，通气量1.5L/min、搅拌转速200rpm；10-40h，通气量2.5L/min、搅拌转速200rpm→425rpm→250rpm；40-72h，通气量2.0L/min、搅拌转速250rpm。
6.如权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，步骤(2)所述的NB培养基为牛肉膏3.0g、蛋白胨5.0g、水1000ml，PH7.2～7.4。
7.如权利要求1所述的发酵工艺，其特征在于，步骤(1)所述的NA培养基为牛肉膏3.0g、蛋白胨5.0g、营养琼脂20g、水1000ml、PH7.2～7.4，NBTA培养基为NA培养基+(TTC 0.04g、BTB 0.025g)。
8.嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophilus YL001的发酵液用于制备防治植物病害杀菌剂的应用。
9.一种防治植物病害的昆虫病原线虫共生菌杀菌剂，其特征在于，该杀菌剂由下列组分的体积百份比构成嗜线虫致病杆菌Xenorhabdusnematophilus YL001的发酵液60％-85％，助剂1％-5％，余为表面活性剂，上述组分的总和为100％。
10.如权利要求9所述的杀菌剂，其特征在于，所述的助剂是苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸等物质中的一种，表面活性剂为本领域工作人员公知的物质的组合物。
全文摘要
本发明涉及一种昆虫病原线虫共生菌抗菌活性的分段供氧发酵工艺及其发酵液的应用。该工艺以嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophilusYL001为材料，在发酵过程中，采用通过调节通气量和搅拌转速分段供氧。用本发明所建立的发酵工艺进行昆虫病原线虫共生菌的发酵，细胞生长量和抗菌活性明显高于单一供氧的发酵方式。其发酵工艺得到发酵液可用于制备防治植物病害杀菌剂。
文档编号A01N63/02GK1724651SQ20051004282
公开日2006年1月25日 申请日期2005年6月16日 优先权日2005年6月16日
发明者王永宏, 何军, 刘霞, 李广泽, 冯俊涛, 马志卿, 张兴 申请人:西北农林科技大学无公害农药研究服务中心