专利名称：一种促进植物生长和/或提高植物抗性的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中一种促进植物生长和/或提高植物抗性的方法。
背景技术：
非生物环境因子(如干旱、盐碱等)严重影响农作物的正常生长发育和产量，环境污染和人口爆炸则使粮食的供应更趋紧张。因而需要培育高抗性和高产优质的粮食作物。对于植物在逆境下反应的分子机制的研究，目前的难点在于已知的胁迫反应基因太少，因此研究植物对逆境响应的机制，最重要的就是发现更多的胁迫反应基因，并研究它们在逆境中的作用。
植物谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase，GST)在植物中是一类很丰富的酶，由一个古老而高度分歧的基因家族编码。GST的主要功能是催化生物体内某些内源或外源的有害物质的亲电子集团与谷胱甘肽的疏基结合，使其分解，或形成易溶于水的物质，排出体外。
刘新仿等发现拟南芥的一个GST与植物对紫外辐射损伤的耐受性有关；王丽萍等从盐地碱篷中克隆出一个与耐盐有关的GST。Bianchi等研究烟草Nt107基因在拟南芥中的同源基因GST8，在快速的脱水和渐进的干旱时，GST8的表达逐渐增加。推测GST8可能的作用是消除由干旱胁迫引起的活性氧的毒害。
对玉米GST研究，始于Frear在1970年对玉米抗除草剂阿特拉津GST的研究，发现玉米GST具有促进玉米体内GSH与三氮苯类除草剂阿特拉津的轭合作用，从而迅速消除其对玉米的毒性。对玉米谷胱甘肽转移酶基因BZ2研究发现，BZ2编码的蛋白在花青素生物合成的最后一步起作用，最终使花色素在玉米的液泡内凝集。目前，在玉米中已经发现42个谷胱甘肽转移酶，根据序列的相似性分为三类类型I、II、III，其中绝大多数玉米谷胱甘肽转移酶基因的功能研究并没有报道。玉米谷胱甘肽转移酶ZmGST7，由227个氨基酸残基组成，其编码基因ZmGST7，由840个碱基组成，其编码序列为第25-708位碱基(GenBank AJ010440)。目前，并没有发现它具有促进植物生长和/或具有抗逆功能的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种促进植物生长和/或提高植物抗性的方法。
本发明所提供的促进植物生长和/或提高植物抗性的方法，是将植物谷胱甘肽转移酶的编码基因导入目的植物，得到生长加快和/或抗性提高的转基因植株。
所述植物谷胱甘肽转移酶可来源于玉米、拟南芥、盐地碱篷或水稻，优选为玉米，所述植物谷胱甘肽转移酶优选为ZmGST7。
所述植物谷胱甘肽转移酶的编码基因通过植物表达载体导入目的植物；所述植物表达载体为Ti类质粒载体或病毒载体。
所述植物谷胱甘肽转移酶的编码基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种一般性启动子、增强启动子或诱导型启动子。
在所述表达载体中，启动所述植物谷胱甘肽转移酶的编码基因转录的启动子可为花椰菜花叶病毒35S启动子。所述表达载体优选为35S-ZmGST7。
在所述表达载体中，启动所述植物谷胱甘肽转移酶的编码基因转录的启动子还可为拟南芥rd29A基因启动子。所述表达载体优选为RD29AP-ZmGST7。
为了便于对转基因植物或转基因植物细胞进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入可选择性标记(GUS基因、GFP和荧光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记基因(庆大霉素，卡那霉素等)。为了转基因植物释放的安全性，在构建植物表达载体时也可不携带任何标记基因，在苗期进行特定PCR分子标记筛选。
含有所述植物谷胱甘肽转移酶的编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
实验结果表明玉米基因ZmGST7在正常条件下可以促进转基因拟南芥的生长，并且在低浓度的渗透胁迫下能够提高植物抗性。本发明的方法对于培育新型耐逆园林植物和农作物具有重要实用价值和经济效益。
图1A为35S-ZmGST7的BamHI、HindIII、Xhol分别酶切鉴定结果图1B为RD29AP-ZmGST7的EcoRI、NcoI、KpnI、SalI分别酶切鉴定结果具体实施方式
下述实施例中的实验方法如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
T0表示经过沾花侵染后的植株，T1表示T0代自交产生的种子及由它所长成的植株，T2表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株。
实施例1、利用ZmGST7促进拟南芥生长和提高拟南芥抗性
1、转ZmGST7植株的获得(1)构建ZmGST7的植物表达载体所利用的含有ZmGST7克隆来自于用抑制差减杂交方法构建的差减文库。具体的文库构建方法均按照Clontech公司的PCR-selectTMcDNA Subtraction Kit试剂盒推荐的条件进行，得到的ZmGST7 cDNA片段连接到pGEM T-easy载体上(购于Promega公司)，并转化到DH5α大肠杆菌细胞。所有克隆经过测序后发现其中一个克隆包含完整的ZmGST7基因编码序列，命名为pGEM T-easy-ZmGST7。
用EcoRI酶切pGEM T-easy-ZmGST7质粒，获得ZmGST7片段，将其连接到pGEM-7Zf(+)载体(购于Promega公司)的EcoRI识别位点间，经过基因方向的鉴定，用XbaI与SacI双酶切，得到两端含有XbaI与SacI酶切位点的ZmGST7片段，将此片段连接到用限制性内切酶XbaI和SacI去除GUS基因的pBI221(购于BioLabs公司)载体上的限制性内切酶XbaI和SacI的识别位点间，经限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切鉴定，得到含有ZmGST7基因序列的重组载体pBI221-ZmGST7-35S。pBI221-ZmGST7-35S用PstI酶切，EcoRI部分酶切，得到含有35S启动子和NOS终止子的ZmGST7片段，最后将该片段连接到植物表达载体p3301上(p3301购自澳大利亚CAMBIA公司)的限制性内切酶PstI和EcoRI的识别位点间，再用BamHI、HindIII、Xhol分别酶切鉴定，酶切鉴定结果如图1A所示，BamHI酶切得到一条大小为13kb的条带；HindIII酶切得到一条大小为11.5kb的条带和一条2kb的条带；Xhol酶切得到一条大小为10.6kb的条带，一条1.8kb的条带和一条560bp的条带；表明得到结构正确的由花椰菜花叶病毒35S启动子启动ZmGST7转录的重组表达载体35S-ZmGST7。
用NotI酶切pGEM T-easy-ZmGST7，获得ZmGST7片段，连接到pBluescriptIIKS/SK(+)(购于MBI Fermentas公司)载体的限制性内切酶NotI的识别位点间，经过基因方向的鉴定，用Xbal与SacI双酶切，得到两端含有Xbal与SacI酶切位点的ZmGST7片段，将此片段连接到用限制性内切酶Xbal与SacI去除GUS基因的pBI221(购于BioLabs公司)载体上的限制性内切酶Xbal与SacI的识别位点间，得到含有ZmGST7基因序列的重组载体pBI221-ZmGST7。用HindIII和Xbal酶切去除pBI221-ZmGST7载体的35S启动子。根据Yamaguchi Shinozaki等(MOLECULAR AND GENERAL GENETICS，1993，236331-340)发表的rd29A基因的5’端序列，设计了一对两端分别带有HindIII和Xbal酶切位点的特异引物(P15’-AAAAGCTTACGCATGATTTGATGGAG-3’(序列1)，P25’-AGTCTAGAAACCCTTTATTCCTGATGATTG-3’(序列2))，由上海生物工程公司合成。从拟南芥基因组DNA进行PCR扩增，反应体系为为25μl，包括1μl DNA模板，2.5μl10×buffer，2.5μl dNTPs(2mM)，1μl引物P1(10mM)，1μl引物P2(10mM)，0.3μlTaq酶(5U/μl)，16.7μl ddH2O。反应条件为94℃预变性3分钟；94℃，45秒，65℃，45秒，72℃，1分钟，35个循环后于72℃保温延伸10分钟。PCR产物用HindIII和Xbal酶切，得到含有HindIII和Xbal酶切位点的RD29A Promoter片段，将此片段连接到已经去除35S启动子的含有ZmGST7的pBI221-ZmGST7上，经HindIII酶切，EcoRI部分酶切，得到含有RD29A启动子和NOS终止子的ZmGST7片段，最后连接到植物表达载体p3301上的限制性内切酶HindIII和EcoRI的识别位点间，再用EGoRI、NcoI、KpnI、SalI分别酶切鉴定，酶切鉴定结果如图1B所示，NcoI酶切得到一条大小为11.5kb的条带和一条1.92kb的条带；KpnI酶切得到一条大小为11.2kb的条带和一条2.27kb的条带；EcoRI酶切得到一条大小为12.26kb的条带和一条1.2kb的条带；SalI酶切得到一条大小为10.9kb的条带，一条2.26kb的条带和一条280bp的条带；表明得到结构正确的由拟南芥rd29A基因启动子启动ZmGST7转录的重组表达载体RD29AP-ZmGST7。
(2)转化植物将重组表达质粒35S-ZmGST7或RD29AP-ZmGST7转化农杆菌GV3101，并提取质粒做酶切及PCR扩增检测，筛选阳性菌株用于转化植物。
将阳性农杆菌菌株分别接入YEB培养基，28℃培养5～6小时，OD600约0.5时，5000g，离心15分钟收集菌体细胞，用含有1×MS大量元素和5％蔗糖的溶液重悬细胞，加入体积百分含量为0.02％的表面活性剂silwet L-77(购自GE Silicones公司)用于转化植物。转化拟南芥采用沾花侵染(floral dipping)的方法，转化后黑暗低温(16摄氏度)培养24小时后转入正常培养条件下生长，即为T0代植株。收获T0代植株上的种子(T1代种子)，将7000粒T1代种子平铺到MS培养基上春化3天，然后直接播种到营养土中生长，正常生长20天后，用0.5‰(体积百分比)的除草剂草丁膦(PPT)喷雾筛选转化植株。在喷施抗除草剂后转化植株仍然能够正常生长，同时提取转化植株的基因组DNA，利用引物AAGACCTGGGCAACAAGAGCGA和TGGCGAAGAAATAGAGACACACCTTA进行PCR扩增ZmGST7基因，利用引物CCAGAAACCCACGTCATGCC和CAGGAACCGCAGGAGTGGA进行PCR扩增除草剂抗性基因bar基因，进一步鉴定转化植株(未转化植株中无相应的ZmGST7基因和除草剂抗性基因扩增条带)，结果得到100株T1代转化植株。T1代转化植株按照株系分别收获T2代种子。T2代种子种植后，用同样的方法鉴定转化植株，并收获T3代种子，结果得到50个35S-ZmGST7转化株系的T3代种子(每个株系各1000粒)和50个RD29AP-ZmGST7转化株系的T3代种子(每个株系各1000粒)。
2、转ZmGST7植株的生长性状观察将含有ZmGST7的转35S-ZmGST7的T3代种子、转RD29AP-ZmGST7的T3代种子(各取10个转化株系，每个株系各30粒)首先播种于含有7mg/L草丁膦的MS培养基上，4℃春化3天，光照培养生长4天，筛选能够存活的幼苗；未转化植株的种子(30粒)播种于MS培养基上，4℃春化3天，光照培养生长4天，作为对照幼苗。将筛选的转基因幼苗和对照幼苗同时转移到MS培养基上，培养皿直立放置，拟南芥幼苗倒置生长4天后，每个株系取10株观察比较植株根系，结果表明含有ZmGST7的转35S-ZmGST7的T3代植株幼苗的根长(平均为2.74cm)明显比对照(平均为2.15cm)的长，方差分析达到极显著水平(1％的显著水平)，而含有ZmGST7的转RD29AP-ZmGST7的T3代植株幼苗的根长(平均为2.26cm)与对照相比差异不大(表1)。
表1.含有ZmGST7的转35S-ZmGST7的T3代植株、转RD29AP-ZmGST7的T3代植株与未转化植株倒置生长4天后的根长(cm)比较
将上述含有ZmGST7的转35S-ZmGST7的T3代种子、转RD29AP-ZmGST7的T3代种子(各取10个转化株系，每个株系各30粒)首先播种于含有7mg/L草丁膦的MS培养基上，4℃春化3天，光照培养生长7天，筛选能够存活的幼苗；未转化植株的种子(30粒)播种于MS培养基上，4℃春化3天，光照培养生长4天，作为对照幼苗。将筛选的转基因幼苗和对照幼苗同时播种于小花盆中，生长到二十天后，明显观察到含有ZmGST7的转35S-ZmGST7植株比对照抽苔、开花提前3-4天，而转RD29AP-ZmGST7植株则与对照抽苔时间一致。表2显示移栽后的第二十天测量植株抽苔高度的差异。转35S-ZmGST7植株与对照的差异达到极显著水平(p＜0.01)。
表2.含有ZmGST7的转35S-ZmGST7的T3代植株、转RD29AP-ZmGST7的T3代植株与未转化植株移栽后的第二十天植株抽苔高度(cm)的比较
3、转ZmGST7植株的抗性观察将含有ZmGST7的转35S-ZmGST7的T3代种子，含有ZmGST7的转RD29AP-ZmGST7的T3代种子(各取10个转化株系，每个株系各30粒)首先播种于含有7mg/L草丁膦的MS培养基上，未转化植株的种子(30粒，对照)播种于MS培养基，4℃春化3天，光照培养生长4天，将能够存活的幼苗再转移到含有不同浓度的甘露醇(100mmol/L、200mmol/L、300mmol/L、400mmol/L)的MS培养基上，将培养皿直立放置，拟南芥幼苗倒置生长，4天后测量弯曲向下生长的根长。结果表明含有ZmGST7的转RD29AP-ZmGST7的T3代植株的幼苗在低浓度的甘露醇胁迫下相对根长比对照更长，尤其在200mmol/L甘露醇时达到极显著水平。含有ZmGST7的转35S-ZmGST7的T2代植株在低浓度的甘露醇胁迫下相对根长比对照长，但差异的幅度没有转RD29AP-ZmGST7的幼苗明显，只有在200mmol/L甘露醇时达到显著水平(表3-表6)。
表3.含有ZmGST7的转35S-ZmGST7的T3代植株、转RD29AP-ZmGST7的T3代植株与未转化植株在100mmol/L的甘露醇胁迫下生长4天的根长(cm)比较
表4.含有ZmGST7的转35S-ZmGST7的T3代植株、转RD29AP-ZmGST7的T3代植株与未转化植株在200mmol/L的甘露醇胁迫下生长4天的根长(cm)比较
表5.含有ZmGST7的转35S-ZmGST7的T3代植株、转RD29AP-ZmGST7的T3代植株与未转化植株在300mmol/L的甘露醇胁迫下生长4天的根长(cm)比较
表6.含有ZmGST7的转35S-ZmGST7的T3代植株、转RD29AP-ZmGST7的T3代植株与未转化植株在400mmol/L的甘露醇胁迫下生长4天的根长(cm)比较
本实施例的结果表明，玉米基因ZmGST7能够明显促进植物生长，并在低水平的渗透胁迫下能够提高植物的抗性。
序列表<160>2<210>1<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1aaaagcttac gcatgatttg atggag 26<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2agtctagaaa ccctttattc ctgatgattg 30
权利要求
1.一种促进植物生长和/或提高植物抗性的方法，是将植物谷胱甘肽转移酶的编码基因导入目的植物，得到生长加快和/或抗性提高的转基因植株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述植物谷胱甘肽转移酶来源于玉米、拟南芥、盐地碱篷或水稻。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述植物谷胱甘肽转移酶来源于玉米。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述植物谷胱甘肽转移酶为ZmGST7。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述植物谷胱甘肽转移酶的编码基因通过植物表达载体导入目的植物；所述植物表达载体为Ti类质粒载体或病毒载体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于在所述表达载体中，启动所述植物谷胱甘肽转移酶的编码基因转录的启动子是花椰菜花叶病毒35S启动子。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述表达载体为35S-ZmGST7。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于在所述表达载体中，启动所述植物谷胱甘肽转移酶的编码基因转录的启动子是拟南芥rd29A基因启动子。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述表达载体为RD29AP-ZmGST7。
全文摘要
本发明公开了一种促进植物生长和/或提高植物抗性的方法。本发明所提供的促进植物生长和/或提高植物抗性的方法，是将植物谷胱甘肽转移酶的编码基因导入目的植物，得到生长加快和/或抗性提高的转基因植株。所述植物谷胱甘肽转移酶可来源于玉米、拟南芥、盐地碱篷或水稻，优选来源于玉米。所述植物谷胱甘肽转移酶优选为ZmGST7。ZmGST7在正常条件下可以促进转基因拟南芥的生长，并且在低浓度的渗透胁迫下能够提高植物抗性。本发明的方法对于培育新型耐逆园林植物和农作物具有重要实用价值和经济效益。
文档编号A01G7/06GK1692701SQ200510069380
公开日2005年11月9日 申请日期2005年5月16日 优先权日2005年5月16日
发明者王国英, 郑军, 王建华, 赵晋锋, 曹永国 申请人:中国农业大学