专利名称：杂色鲍雌核发育诱导方法
技术领域：
本发明涉及一种杂色鲍雌核发育诱导方法，特别是涉及一种用异种精子激活卵子诱导杂色鲍雌核发育的方法。该技术诱导产生后代遗传物质以母本的基因为主，并参入少量父本基因，因此本发明可应用于鲍遗传育种，可以快速纯化种质，加快育种速度。
背景技术：
利用遗传生物技术，为贝类养殖业培育优良品种，具有深远的理论意义和广阔的应用前景。雌核发育是一种遗传生物技术，指卵子依靠自己的细胞核发育成个体的生殖行为，它需要同种或异种精子进入卵内，但这些精子只起激动作用并不参与发育，胚胎发育完全是在雌核的控制之下进行的，因此得到的后裔全部是母性性状，基因型与母本相同或略有差异。人工雌核发育的应用包括快速建立纯系、实现全雌养殖、遗传分析(确定性别控制机制、确定外界因素对遗传性或表型的影响、检测基因图距或隐性基因)、提高产量；综合育种、加快育种速度等。
以杂色鲍(Haliotis diversicolor)为母本、盘鲍(H.discus discus)为父本杂交，受精率可以达到50％以上，核型分析结果杂交幼体中包含异源二倍体、异源三倍体和非整倍体，扩增片段长度多态性(AFLP)分析结果表明，成体为含有极少量父本基因的异精雌核发育体。鲍的雌核发育通常采用理化方法进行诱导。Fujino等(Fujino，et al，Inductionof gynogenetic diploid by inhibiting second meiosis in the pacific abalone，日本水产年会志，1990，561755-1763)报道了皱纹盘鲍雌核发育二倍体的诱导方法先用紫外线失活皱纹盘鲍精子染色体，再用冷休克的方法诱导雌核发育卵染色体组加倍。本申请的发明人柯才焕在专利号为CN 03132936.5的发明专利“杂色鲍雌核发育的诱导方法”中应用紫外线照射失活皱纹盘鲍精子遗传物质，并用遗传失活精子激活皱纹盘鲍卵子的雌核发育，同时应用细胞松弛素B或6-二甲基氨基嘌呤诱导雌核发育二倍体。该类方法的不足之处在于1)精子需要失活处理，不便于现场操作；2)精子失活操作要接触紫外线或X射线或γ射线下照射，具有一定的危险性；3)精子失活操作的条件需要长期的试验摸索，不便于掌握；4)应用辐射的方法失活精子，不可能十分彻底清除父本遗传物质，因此雌核发育子代中必然混有正常二倍体或三倍体，给实验结果的分析带来困难，同时影响种质纯化的进程；5)紫外线、细胞松弛素B及6-二甲基氨基嘌呤等均具有潜在的致癌作用，可能影响操作者的健康。
发明内容
本发明的目的在于针对已有的杂色鲍雌核发育诱导方法中存在的不足，提供一种用异源精子诱导杂色鲍雌核发育的方法。
本发明所说的杂色鲍雌核发育诱导方法其步骤为1)、取排放40min内，最好为30min内的杂色鲍卵子，用排放3h内，最好为2h内的新鲜盘鲍精子授精，得到异源多倍体胚胎，授精精子浓度为6.0×106～2.4×107个·ml-1；2)、将发育胚胎在海水中孵化为幼体，海水的温度为16～32℃，用筛网富集上层幼体，转移至预投入青霉素-链霉素的培育池内，培育池内海水温度为16～32℃，青霉素-链霉素的含量为5～50mg/L。
检测时，可取2月龄的稚贝进行倍性检测，并用扩增片段长度多态性技术(AFLP)确定后代至少含有96.27％的杂色鲍基因。
与已有的杂色鲍雌核发育诱导方法相比，本发明具有以下突出效果1)、本发明诱导产生的后代主要含有母性亲本的基因，仅含有极少量父本基因，因此本发明可应用于杂色鲍遗传育种，特别是快速纯化种质，加快育种速度；2)、无须对异源精子进行射线失活处理，简单可行，便于现场操作，安全可靠；3)、对操作者的经验要求不高，便于掌握；4)、异源精子的遗传物质可以通过在发育过程中自发丢失，极少量父本基因的残余与母本基因有较大差异，易被检出。
5)、无需使用紫外线及细胞松弛素或6-二甲基氨基嘌呤等有害的辐射及化学药品，避免对操作者的身体伤害。
具体实施例方式
实施例1取排放30min内的杂色鲍卵子，用排放2h内的新鲜盘鲍精子授精，授精精子浓度为1.0×107个·ml-1。将发育胚胎在海水中孵化为幼体，海水的温度为25℃，用筛网富集上层幼体，转移至预投入青霉素-链霉素的培育池内，培育池内海水温度为25℃，青霉素-链霉素的含量为5mg/L。
被异种精子激活的发育卵，按普通杂色鲍种苗生产方法管理，生产出杂色鲍雌核发育二倍体种苗。取2月龄的稚贝进行倍性检测，证明为二倍体，并用扩增片段长度多态性技术(AFLP)确定后代至少含有96.27％的杂色鲍基因，平均每个个体约含0.79±0.87％的父本基因。
实施例2与实施例1类似，其区别在于取排放40min内的杂色鲍卵子，用排放1.5h内的新鲜盘鲍精子授精，授精精子浓度为6.0×106个·ml-1。将发育胚胎在海水中孵化为幼体，海水的温度为32℃，用筛网富集上层幼体，转移至预投入青霉素-链霉素的培育池内，培育池内海水温度为32℃，青霉素-链霉素的含量为25mg/L。
实施例3与实施例1类似，其区别在于取排放15min内的杂色鲍卵子，用排放3h内的新鲜盘鲍精子授精，授精精子浓度为2.4×107个·ml-1。将发育胚胎在海水中孵化为幼体，海水的温度为16℃，用筛网富集上层幼体，转移至预投入青霉素-链霉素的培育池内，培育池内海水温度为16℃，青霉素-链霉素的含量为50mg/L。
权利要求
1.杂色鲍雌核发育诱导方法，其特征在于其步骤为1)、取排放40min内的杂色鲍卵子，用排放3h内的新鲜盘鲍精子授精，得到异源多倍体胚胎；2)、将发育胚胎在海水中孵化为幼体，用筛网富集上层幼体，转移至预投入青霉素-链霉素的培育池内。
2.如权利要求1所述的杂色鲍雌核发育诱导方法，其特征在于在步骤1)中，取排放30min内的杂色鲍卵子。
3.如权利要求1所述的杂色鲍雌核发育诱导方法，其特征在于在步骤1)中，用排放2h内的新鲜盘鲍精子授精。
4.如权利要求1所述的杂色鲍雌核发育诱导方法，其特征在于在步骤1)中，授精精子浓度为6.0×106～2.4×107个·ml-1。
5.如权利要求1所述的杂色鲍雌核发育诱导方法，其特征在于在步骤2)中、将发育胚胎在海水中孵化为幼体，海水的温度为16～32℃。
6.如权利要求1所述的杂色鲍雌核发育诱导方法，其特征在于在步骤2)中，用筛网培育池内海水温度为16～32℃。
7.如权利要求1所述的杂色鲍雌核发育诱导方法，其特征在于在步骤2)中，青霉素-链霉素的含量为5～50mg/L。
全文摘要
杂色鲍雌核发育诱导方法，涉及一种杂色鲍雌核发育诱导方法，特别是涉及一种用异种精子激活卵子诱导杂色鲍雌核发育的方法。提供一种用异源精子诱导杂色鲍雌核发育的方法。其步骤为取杂色鲍卵子，用新鲜盘鲍精子授精，得异源多倍体胚胎，将发育胚胎在海水中孵化为幼体，用筛网富集上层幼体，转移至预投入青霉素—链霉素的培育池内。其后代主要含有母性亲本的基因，仅含有极少量父本基因，可应用于杂色鲍遗传育种，特别是快速纯化种质，加快育种速度；无须对异源精子进行射线失活处理，便于现场操作，异源精子的遗传物质可通过在发育过程中自发丢失，极少量父本基因的残余与母本基因有较大差异，易被检出。无需使用辐射及化学药品，避免对身体伤害。
文档编号A01K61/00GK1739465SQ20051009677
公开日2006年3月1日 申请日期2005年9月1日 优先权日2005年9月1日
发明者柯才焕, 蔡明夷 申请人:厦门大学