专利名称：一种制备朊蛋白基因敲除家畜的方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体地，本发明涉及一种制备朊蛋白基因敲除家畜的方法。
背景技术：
阮蛋白类疾病(prion diseases)，又叫传染性海绵状脑病(TransmissibleSpongiform Encephalopathies，TSE)，是一类致命的中枢神经系统退行性疾病。该疾病的主要特点是神经细胞的死亡、大脑空泡化以及伴随的星型胶质细胞增生等，这些将导致运动障碍、痴呆，最终导致患病动物的死亡。为大家比较熟悉的阮蛋白类疾病主要有发生在绵羊和山羊上的羊搔痒病(scrapie)，发生在牛身上的牛海绵状脑病(Bovine Spongiform Encephalopathy，BSE，即俗称的“疯牛病”)，以及发生在人身上的库鲁氏病(Kuru)、克雅氏病(Creutzfeldt-Jakobdisease，CJD)、Gerstmann-Straussler-Sheinker disease(GSS)、致死性失眠综合症(fatal familial insomnia，FFI)、新型克雅氏病(Variant Creutzfeldt-Jakobdisease，vCJD)等(Prusiner SBPrions.Proc Natl Acad Sci USA 1998，9513363-13383)。
现在已有很多证据表明，发生在牛身上的牛海绵状脑病可以通过一定途径传染给人并在人身上引起一种新型的克雅氏病(vCJD)，由于阮蛋白类疾病至今仍然没有有效的治疗手段，该疾病到目前为止已经导致了一百多人的死亡(主要在英国)，进而在全球范围内引起了巨大的心理恐慌，导致数百万头牛被屠宰后掩埋或焚烧处理，造成了巨大的经济损失。
大量的证据表明阮蛋白类疾病的病原体(英文叫prion，在哺乳动物的TSE疾病中致病型prion也可以翻译成阮病毒)仅由PrPSc组成，PrPSc是细胞内正常表达的朊蛋白(PrPC)的异构体(conformer)，该异构体富含β-折叠并具有抵抗蛋白酶消化的能力。PrPC是一个确切功能未知的由GPI(glycosylphosphatidylinositol)锚定在细胞膜上的糖蛋白(Prusiner SBNovelproteinaceous infectious particles cause scrapie.Science 1982，216136-144；Legname G，Baskakov IV，Nguyen HO，Riesner D，Cohen FE，DeArmond SJ，Prusiner SBSynthetic mammalian prions.Science 2004，305673-676)。根据Prusiner博士提出的TSE病原体只含有蛋白质“protein-only”的学说，当作为病原体的PrPSc进入体内后会引起PrPC转变成PrPSc，从而使PrPSc得到增殖，该学说同时预测如果动物体内不表达PrPC，将使PrPSc在体内不能增殖，从而使该动物具有抵抗TSE病原体感染的能力。该学说已经被两个独立的朊蛋白基因敲除(Prnp-/-)小鼠品系所完全证实，两个(Prnp-/-)小鼠品系不仅具有抵抗TSE病原体感染的能力还都能正常发育和繁殖后代(Bueler H，Fischer M，Lang Y，Bluethmann H，Lipp HP，DeArmond SJ，Prusiner SB，Aguet M，Weissmann CNormal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrPprotein.Nature 1992，356577-582)。
羊搔痒病是一种在绵羊或山羊身上自发产生同时可以在羊群之间互相传染的阮蛋白类疾病，也是第一种通过人工接种方法成功传播给啮齿类动物的阮蛋白类疾病，因而羊搔痒病常被用作TSE疾病研究的原型(Chandler R LEncephalopathy in mice produced by inoculation with scrapie brain material.Lancet 1961，11378-1379)。虽然在小鼠中敲除其朊蛋白基因不会对敲除小鼠本身造成明显的有害影响，但是并没有证据表明在绵羊或山羊中敲除其朊蛋白基因也会有相同的表型。此外，PRNP基因单基因敲除和双基因敲除绵羊或山羊的获得将有利于开展PrPC确切生理功能的研究，也对阮蛋白类疾病的发病机理的研究极有价值。最后，PRNP基因双敲除奶山羊的获得将在生物药业方面有直接的应用，因为根据“protein-only”学说，PRNP基因双敲除山羊将具有抵抗TSE疾病病原体感染的能力，利用这些动物作为生物反应器生产出来的药用蛋白将比较容易被消费者接受。
由于小鼠ES细胞的成功建立，基因打靶已经成为精确改造小鼠基因组的常规手段。尽管经过巨大的努力，具有生殖系统发育潜能的任何家畜的ES细胞到目前为止都没有建成，这使得精确改造家畜基因组在相当长的一段时间内都困难重重。近年来，随着动物克隆技术的快速发展，已经可以通过核移植经传染的胎儿成纤维细胞来制备转基因动物并且整个过程与ES细胞基因打靶非常相似(Schnieke AE，Kind AJ，Ritchie WA，Mycock K，Scott AR，Ritchie M，Wilmut I，Colman A，Campbell KHHuman factor IX transgenic sheep producedby transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts.Science 1997，2782130-2133)。终于，在2000年McCreath等人报道了一个里程碑意义的研究结果，他们通过绵羊的胎儿成纤维细胞的基因打靶成功的将含有人的α1抗胰蛋白酶基因的乳腺特异表达框架插入到绵羊的COLlAl(α1(I)procollagen)位点(McCreath KJ等，Production of gene-targeted sheep by nuclear transfer fromcultured somatic cells.Nature 2000，4051066-1069.)。此后，通过类似的技术路线又有数个实验室成功的敲除了猪和绵羊的α(1，3)galactosyltransferase基因(Dai Y，等，Targeted disruption of the alpha 1，3-galactosyltransferase gene incloned pigs.Nat Biotechnol 2002，20251-255；Lai L，等，Production of alpha-1，3-galactosyltransferase knockout pigs by nuclear transfer cloning.Science 2002，2951089-1092)。
迄今为止，现有技术中还没有PRNP基因单等位基因或双等位基因敲除山羊的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备朊蛋白基因敲除家畜的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种制备朊蛋白基因敲除家畜的方法包括以下步骤(a)通过基因打靶将一构建物定点引入家畜胎儿成纤维细胞，所述的构建物含有两个作为同源重组同源臂的朊蛋白基因片段和至少一个选择性标记基因片段；(b)筛选得到朊蛋白基因被敲除的家畜胎儿成纤维细胞；(c)将步骤(b)获得的家畜胎儿成纤维细胞作为核供体，制备朊蛋白基因敲除的家畜。
在另一优选例中，所述的朊蛋白单等位基因敲除的家畜的制备方法包括如下步骤(1)构建一种能通过同源重组敲除朊蛋白基因的DNA打靶载体；(2)将构建好的DNA打靶载体转染入家畜的细胞；(3)对转染的细胞进行药物筛选，获得药物抗性细胞克隆；(4)对获得的药物抗性细胞克隆进行鉴定，挑选出同源重组的细胞克隆；(5)将同源重组的细胞克隆细胞移植到去核的家畜卵母细胞中形成重构胚；(6)培养该重构胚发育到桑椹或囊胚期；(7)将发育到桑椹或囊胚期的重构胚移植到同步发情的受体家畜子宫内；(8)妊娠，分娩产生朊蛋白单等基因敲除的家畜。
在另一优选例中，还包括步骤(d)利用已获得的朊蛋白单等位基因敲除的家畜进行繁殖，获得朊蛋白双等位基因敲除的家畜。
在另一优选例中，还包括步骤(d)利用朊蛋白基因被敲除的家畜胎儿成纤维细胞进行朊蛋白第二个等位基因的打靶，获得朊蛋白双等位基因敲除的家畜胎儿成纤维细胞细胞，再利用该细胞进行动物克隆，获得朊蛋白双等位基因敲除的家畜。
在另一优选例中，所述的标记基因为抗性基因。
在另一优选例中，所述的标记基因选自下组新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因。
在另一优选例中，所述的标记基因选自下组新霉素抗性基因(neomycin)、潮霉素抗性基因(hygromycin)、嘌呤霉素抗性基因(puromycin)。
在另一优选例中，在5’同源臂序列的上游或3’同源臂序列的下游还含有负筛选标记基因。
在另一优选例中，所述的家畜为牛、绵羊、山羊、兔、猪。
在另一个优选例中，所述的动物为山羊。
在另一个优选例中，各同源臂序列的长度为1-20kb。
在本发明的第二方面，提供一种朊蛋白基因敲除的组织或细胞，所述组织或细胞来自采用所述的方法制备的朊蛋白基因敲除的家畜。
在本发明的第三方面，提供一种制备家畜成纤维细胞的方法，所述的家畜成纤维细胞的朊蛋白基因被敲除，该方法包括步骤(a)通过基因打靶将一构建物定点引入家畜胎儿成纤维细胞，所述的构建物含有两个作为同源重组同源臂的朊蛋白基因片段和至少一个选择性标记基因片段；
(b)筛选得到朊蛋白基因被敲除的家畜胎儿成纤维细胞。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1.山羊野生型PRNP基因、GTPrP打靶载体和中靶后的PRNP基因示意图。在野生型PRNP基因示意图中标明了该基因的三个外显子，用黑色框代表。在中靶后的PRNP基因示意图中同时标明了用于PCR鉴定的引物和Southern杂交的探针。该示意图同时注明了用不同限制性内切酶消化后进行Southern杂交的预期DNA条带大小。限制性内切酶位点Bg代表BglI；Xb代表XbaI；Sc代表ScaI；Ba代表BamHI；Sa代表SalI。
图2.G418药物抗性细胞克隆的PCR分析。在每个泳道上方标明了细胞克隆的编号，(a)，(b)，(c)使用的引物分别是P1/P4，P1/P2和P3/P5。具体的引物位置参见图1。(d)P1/P4引物的PCR产物的Southern杂交分析，所用探针是1.9kb打靶载体的5’同源臂。
图3.PCR阳性细胞克隆GTPrP74的Southern杂交分析。使用的探针分别是1.9kb打靶载体的5’同源臂(a)和1.1kb新霉素抗性基因片段(b)。限制性内切酶位点Bg代表BglI；Xb代表XbaI；Sc代表ScaI；Ba代表BamHI。
图4.克隆山羊的基因组DNA分析。(a)PCR分析，使用的引物是P1/P4。(b)Southern杂交分析，基因组DNA经BglI或XbaI消化后用1.9kb打靶载体的5’同源臂作为探针进行杂交。(c)五只健康存活的PRNP单等位基因敲除(PRNP+/-)山羊(45B，50A，50B，8A，14A)。
图5.PRNP+/-46A克隆山羊的朊蛋白表达水平的Western blot检测。使用野生型(WT)小羊和PRNP+/-46A羊的脑匀浆进行检测，所用的朊蛋白PrPC抗体是小鼠单克隆抗体，同时还使用了肌动蛋白(actin)的抗体作为对照以保证每个电泳道的蛋白总量相等。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，发现可将家畜的朊蛋白基因在细胞水平上敲除，然后通过体细胞克隆的方法制备朊蛋白基因敲除的家畜，获得的家畜朊蛋白基因功能失活，不表达功能性的朊蛋白，从而可赋予家畜抵抗朊蛋白类相关疾病的能力。基于此完成了本发明。
简而言之，本发明的技术路线是，通过基因敲除的方法，将特定的打靶构建物转染家畜胎儿成纤维细胞，定点敲除朊蛋白特异位点序列，建立朊蛋白基因被敲除细胞系。利用核移植技术，获得朊蛋白敲除的转基因克隆家畜。
本发明的基因打靶的构建物从5’→3’依次含有以下元件5’同源臂序列、选择性标记基因、和3’同源臂序列。各元件的作用如下5’同源臂序列和3’同源臂序列用于将位于其间的序列通过同源重组整合入染色体；选择性标记基因用于筛选发生重组的转化子。产生重组的转化子因含有标记基因而被选出。
在优选例中，所述构建物在5’同源臂序列的上游或3’同源臂序列的下游还含有负筛选标记基因，其作用是排除非同源重组型的转化子。发生同源重组时，位于同源臂外侧的负筛选标记基因将不会整合入染色体；而发生非同源的重组时，位于同源臂外侧的负筛选标记基因将会整合入染色体。通过筛选不含负筛选标记基因的转化子，就获得了发生预定的定点同源重组的转化子。可用于本发明的负筛选标记基因包括(但并不限于)自杀基因，如胸苷激酶(TK)基因等。
更具体的，本发明的主要技术路线如下1.从家畜的组织中提取基因组DNA。首先从妊娠35-45天的胎儿分离细胞，同时利用该胎儿的组织进行基因组DNA的提取。
2.从该基因组DNA中克隆出朊蛋白基因(PRNP)。方法一利用提取得到的基因组DNA进行基因组文库的建立，利用已知序列动物的朊蛋白基因设计杂交探针，得到朊蛋白基因。方法二直接利用提取得到的基因组DNA进行朊蛋白基因的PCR克隆。
3.构建一种能通过同源重组敲除朊蛋白基因的DNA打靶载体，选择标记基因可选新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因，在本发明的一个优选例中，选择新霉素抗性基因(neo)作为选择标记基因。
4.将构建好的朊蛋白基因DNA打靶载体转染该家畜的细胞。在转染之前将朊蛋白基因DNA打靶载体进行酶切，得到线性化的DNA打靶载体。转染方法优选电转染。
5.对转染的细胞进行药物(G418)筛选，获得药物抗性细胞克隆。
6.对获得的药物抗性细胞克隆进行鉴定，挑选出同源重组的细胞克隆。首先利用PCR方法对所有的药物抗性细胞克隆进行初步筛选，筛选出可能的中靶细胞克隆。而后对这些PCR鉴定为阳性的细胞克隆进行Southern杂交，以确证真正的中靶细胞克隆，即是朊蛋白基因敲除的细胞。
7.将获得的朊蛋白基因敲除的细胞移植到去核的家畜卵母细胞中，形成重构胚。体外或体内培养该重构胚，使其发育到桑椹/囊胚期。将发育到囊胚期或桑椹期的重构胚移植到同步发情的受体家畜的子宫内。移植后的受体在1-2月龄时用B超进行妊娠检查，出现孕囊的判定为怀孕。妊娠到期后，采用自然分娩或剖腹产羔。对获得的克隆家畜进行朊蛋白基因敲除的分子生物学鉴定。
8.用朊蛋白单等位基因敲除的家畜(PRNP+/-)的有性繁殖，获得朊蛋白双等位基因敲除的家畜(PRNP-/-)，或者利用朊蛋白单等位基因敲除家畜的细胞进行朊蛋白第二个等位基因的打靶，获得朊蛋白双等位基因敲除的细胞，再利用该细胞进行动物克隆获得双等位基因敲除的家畜(PRNP-/-)。
本发明的主要优点在于(1)采用本发明的方法可获得一种朊蛋白基因敲除的家畜，所述家畜具有抵抗朊蛋白类相关疾病(羊搔痒病、牛海绵状脑病(俗称疯牛病)等)的能力。所述家畜的获得具有重大的科学研究价值和应用价值。
(2)可以利用所述家畜作为研究对象开展朊蛋白类疾病相关的基础研究，进一步了解内源性朊蛋白(PrPC)在体内的正常生理功能，为防止和治疗朊蛋白类疾病提供科学依据。具有朊蛋白双等位基因敲除家畜的细胞和具有朊蛋白单等位敲除家畜的细胞也可用于朊蛋白类疾病在细胞生物学水平的基础研究。
(3)具体应用方面，朊蛋白双等位基因敲除的家畜因为具有抵抗朊蛋白类疾病，如疯牛病感染，可以用于防止此类疾病在更大范围的蔓延，同时缓解民众对该类疾病的恐惧心理。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1山羊朊蛋白基因的克隆和山羊朊蛋白基因打靶载体的构建1、原代山羊胎儿成纤维细胞的培养及其性别鉴定获得出生35天的山羊胎儿的皮肤或耳组织，然后用含0.25％胰酶，1mM EDTA的消化液在37℃水浴中消化约15分钟。
将消化后的单个细胞悬液离心，去上清后，将细胞团块重悬在含有2mM的谷氨酰胺(GIBCO)，1mM的丙酮酸钠(SIGMA)，1×的非必须氨基酸(SIGMA)，2ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，SIGMA)，10％胎牛血清(HyClone)，100units/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素(SIGMA)的Glasgow基本培养基(GMEM，SIGMA)中，最后将细胞悬液分到培养瓶中在二氧化碳培养箱中培养数天，在细胞密度达到80％左右时将其冻存。
山羊胎儿成纤维细胞系的性别是通过PCR扩增SRY基因来鉴定的，PCR所用引物序列如下SRY16f5’-CAATCGTATGCTTCTGCTATGTTC-3’(SEQ ID NO1)；和SRY654r5’-CAATGTTACCCTATCGTGGCC-3’(SEQ ID NO2)。
结果，获得了来自35日龄的奶山羊胎儿成纤维细胞，经鉴定为雌性，编号为GFF88。
2、打靶载体的构建PrPC是一个由动物体内常染色体单基因(PRNP基因)编码的蛋白，该基因包含三个外显子，而整个PrPC的编码区都在第三个外显子内。虽然整个山羊的PRNP基因全序列还没有报道，但是绵羊的PRNP基因已经被成功的克隆并进行了详细的分析。绵羊的PRNP基因包含三个外显子，总长度达21kb，其中770bp的整个编码区都位于第三个外显子内(Lee IY，Westaway D，Smit AF，Wang K，Seto J，Chen L，Acharya C，Ankener M，Baskin D，Cooper C，Yao H，Prusiner SB，Hood LEComplete genomic sequence and analysis of the prion protein generegion from three mammalian species.Genome Res 1998，81022-1037)。本发明人构建了启动子缺陷型打靶载体GTPrP(图1)对山羊PRNP基因进行打靶。
具体构建过程如下1.9kb的左侧同源臂和4.5kb的右侧同源臂是通过PCR方法从GFF88胎儿成纤维细胞的基因组DNA中扩增出来的，其引物是根据绵羊的PRNP基因的序列(GenBank号是U67922)设计的。1.9kb左侧同源臂的扩增引物为PrPLF5’-GAATCCGCGGTGTCGACTCTCTAGTCCATGATCGTTCCTC-3’(SEQ ID NO3)，其5’末尾带有SacII和SalI酶切位点；和PrPLR5’-TGTTCAATGGCCGATCCCATGATGACTTCTCTGCAAAATAAAG-3’(SEQID NO4)，其末端与neo的起始编码区序列互补。1.1kb的neo-pA片段的扩增引物为neoF5’-CTTTATTTTGCAGAGAAGTCATCATGGGATCGGCCATTGAACA-3’(SEQ ID NO5)，其5’末端序列与左侧同源臂的末端序列互补；和neoR5’-GAATGCGGCCGCAGTACTCCCCAGCTGGTTCTTTCCG-3’(SEQ ID NO6)，其5’末端含有NotI位点和ScaI位点。这两个片段通过PCR连接得到一个3.0kb的DNA片段。该片段经SacII和NotI酶切后连接于pBluescript IISK(STRATAGENE)载体。右侧同源臂的扩增引物为PrPRF5’-ATAAGCGGCCGCGGATCCAGACTATGAGGACCGTTACTATCGTG-3’(SEQ ID NO7)，其5’末尾带有NotI和BamHI酶切位点；和PrPRR5’-CCGCTCGAGGTCGACGTATCATTCACTTCGGCTCTGTAAA-3’(SEQ IDNO8)，其5’末尾带XhoI和SalI酶切位点，该PCR产物经Not I和Xho I酶切后与上述带有左侧同源臂和neo-pA片段的pBluescript II SK载体(Stratagene公司)连接，完成整个载体的构建。
在构建的GTPrP打靶载体中，1.1kb的neo-pA片段被置于PRNP基因的起始密码子之后。如果转入的GTPrP打靶载体与内源的PRNP基因之间发生同源重组，将会有大约430bp的PRNP基因编码区被删除，同时该区域会被1.1kb的neo-pA片段所代替。
实施例2利用GTPrP打靶载体敲除山羊PRNP基因载体GTPrP在经SalI线性化后，通过电转染将其转入传代到第三代的GFF88胎儿成纤维细胞系。将大约500百万个胎儿成纤维细胞与10μg线性化的GTPRP载体混合，转移到0.4cm的电转杯(Bio-Rad)，通过电转仪Gene pulserII(Bio-Rad)对其施以220v，950μF的脉冲，而后将细胞分到数个含GMEM培养液的培养皿。48小时后加入G418到终浓度为250μg/ml。
大约10天左右，可见有细胞克隆形成。将其中生长良好的细胞克隆挑出，转移到96孔板孔。在快长满时，分离出部分细胞用于PCR鉴定，剩余细胞继续传代直到获得足够的细胞分别用于冻存和抽提基因组DNA用作Southern杂交鉴定。
本发明人首先使用3组不同的引物对产生的细胞克隆进行PCR分析以便筛选出中靶的细胞克隆(targeted colonies)，每组引物中分别有一个引物在同源臂的外侧。各引物的具体位置见图1。具体的PCR过程如下将分离出来的细胞加入裂解缓冲液(40mM Tris-HCl，pH8.0，0.9％Triton X-100，0.9％NonidetP-40，0.4mg/ml proteinase K)，裂解后在65度水浴中消化30分钟，最后在95度水浴中处理10分钟，使蛋白酶(proteinase)K失活。利用TAKARA LA体系(购自TAKARA公司)进行PCR，在20μl的反应体系中加入2μl上述细胞裂解液作为模板。
PCR引物序列如下P1，5’-CACAGCCAGGCATTCAGAAAC-3’(SEQ ID NO9)；P2，5’-CCACCATGATATTCGGCAAG-3’(SEQ ID NO10)；P3，5’-CGCCTTCTTGACGAGTTCTTC-3’(SEQ ID NO11)；P4，5’-CACGATAGTAACGGTCCTCATAGTC-3’(SEQ ID NO12)；P5，5’-GTATGATGCAGGGAAACCAAAG-3’(SEQ ID NO13)。
PCR循环参数如下94℃，30秒；62℃，30秒；72℃，3.5分钟(对P1/P2和P1/P4引物)或者5分钟(对P3/P5引物)，共30个循环。如果是利用从组织或者血液中提取的DNA作为作为模板进行PCR鉴定，则只需加入1μl纯化的DNA作为模板即可，其它参数相同。
进一步利用Southern杂交方法对来分离自培养的细胞或者山羊组织的基因组DNA进行鉴定。样品首先在如下的裂解液(10mM Tris-HCl，pH8.0，50mMEDTA，10mM NaCl，0.5％SDS，0.4mg/ml proteinase K)中裂解过夜，然后进行基因组DNA的常规抽提。使用如下三组不同的内切酶(BglI，XbaI或者ScaI/BamHI，)对得到的基因组DNA进行酶切，而后将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，再转移到尼龙膜上。使用两种DNA片段作为杂交的探针(具体位置见图1)一个1.9kb的相当于打靶载体的左侧同源臂的片段(命名为5’arm)和1.1kb的neo片段。
实验结果如下本发明人将GTPrP通过电转染转入雌性GFF88山羊胎儿成纤维细胞系，GTPrP的两个同源臂就是扩增自该细胞系。经过8-10天的药物筛选，挑出了163个细胞克隆。这些药物抗性细胞克隆通过三个独立的PCR分析来检测其中的中靶细胞。在使用一个位于左侧同源臂外侧的P1引物和一个位于右侧同源臂内P4引物分析的112个细胞克隆中有10个中靶的细胞克隆。这是根据这些细胞克隆的PGR产物中存在两个预期大小的片段来决定的，一个2.8kb片段，来自正常PRNP等位基因的和一个3.5kb片段，来自中靶PRNP等位基因。如果转入的GTPrP打靶载体与内源的PRNP基因之间发生同源重组，将会有大约0.4kb的PRNP基因编码区被删除，同时该区域会被1.1kb的neo-pA片段所代替，当用P1/P4引物分析时就会出现一个新的3.5kb片段(图1)。
图2a是数个具有代表性的细胞克隆的P1/P4引物分析结果。然而，根据电泳时两个条带的浓度，可以判断10个P1/P4引物分析为阳性的细胞克隆中有8个是混合克隆。
为了进一步肯定打靶的成功，本发明人还使用了另外两组PCR对这些细胞克隆做了进一步验证。10个P1/P4引物分析为阳性的细胞克隆中，8个因为是混合克隆，没有对其作进一步的验证，剩余的两个细胞克隆(GTPrP74和GTPrP78)都被另外两组PCR证明是阳性克隆(图2b和2c)。此外，P1/P4引物扩增的产物还被转移到尼龙膜上并与1.9kb的相当于左侧同源臂的5’arm探针杂交，结果也证明了由P1/P4引物扩增产生的新的3.5kb条带不是非特异条带而确实是由中靶的PRNP等位基因产生的。
由于使用PCR分析可能会有假阳性出现，所以很有必要使用Southern杂交的方法对这些PCR分析为阳性的细胞克隆做进一步的确认。GTPrP78这个细胞克隆在扩增的过程中由于未能产生足够的细胞数用于抽提基因组DNA作为杂交使用，所以只对GTPrP74这个细胞克隆做了Southern杂交分析。
本发明人使用了三组不同的内切酶和两个不同的探针对野生型GFF88细胞和GTPrP74细胞克隆的基因组DNA进行了详细的分析(图3a和3b)。如果PRNP基因的等被成功打靶，位于被neo-pA片段所替换的0.4kb编码区内的两个BglI位点将消失，这使得当这些中靶细胞的基因组DNA用BglI酶切后与1.9kb的5’arm探针杂交时，除了会有一条6.1kb来自正常PRNP等位基因的BglI酶切片段外，还会出现一条新的来自中靶PRNP等位基因的大小为12.0kb的BglI酶切片段(图1和图3a)。
类似地，当使用XbaI或ScaI/BamHI两组酶分别酶切后与5’arm探针杂交时，除了内源的6.7kb的XbaI酶切片段或者4.4kb的ScaI/BamHI酶切片段外，还会各自出现一条新的7.4kb XbaI酶切片段或者5.5kb的ScaI/BamHI酶切片段(图3a)。当使用1.1kb的neo探针进行杂交时，只有新产生的与预期大小相符的片段可以被杂交出来(图3b)。这与PRNP基因的成功打靶相符，并且证明只有单一拷贝的打靶载体整合入到山羊的基因组中。
实施例3通过山羊PRNP+/-细胞的核移植制备PRNP+/-山羊在本发明人的研究中，核移植用的供质卵母细胞、临时寄母、受体均来自萨能奶山羊。
山羊的同步发情雌性山羊通过注射0.1mg的前列腺素(prostaglandin-Cl，PG，上海计划生育科学研究所)，24小时后注射25μg促黄体生成素释放激素(luteinizing hormone-releasing hormone，LHRH)进行同步发情。
母山羊的超数排卵肌肉注射促卵泡激素(follicle stimulation hormone，FSH)，每天注射两次，连续注射3天，每只山羊注射FSH的总剂量为240IU，在第三天注射一次PG，24小时后注射一次LHRH。
卵母细胞的回收LRH注射24-30小时内采用手术回收，用F10(GIBCO)培养液冲洗输卵管后收集卵母细胞，用0.2％的透明质酸酶去除附着的颗粒细胞，而后用M16培养液培养于37.5℃、5％CO2的培养箱中。
供核细胞即PrP基因敲除的山羊体细胞，在生长到80％密度时用含0.5％的胎牛血清饥饿培养5天，而后用0.25％的胰酶消化至单个细胞用于核移植(NT)。卵母细胞去核之前用含2.8mg/ml HEPES和7.5μg/ml细胞松弛素B(cytochalasin B，CB)的M16培养液洗涤3次，再置于此溶液中处理10-20分钟，而后进行去核与移核操作。将单个供核细胞注射到去核的卵母细胞的透明带下，使其紧贴于胞质膜，采用电刺激的方法进行融合，融合基质为含0.3mM甘露醇、0.05mM氯化钙、0.1mM硫酸镁、0.5％BSA的溶液，融合条件为DC600-610v/cm，脉冲持续时间80μs，连续刺激3次。融合后的胚胎于M16中培养5小时后，在含5μM离子霉素(ionomycin)、7.5μg/ml CB的M16液中处理5min，再在含2mM 6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)以及7.5μg/ml CB的M16液中处理5小时后移到M16培养液中培养。
将激活后的重够卵经短暂培养后，用1％的琼脂糖进行两次包埋，将包埋块移植到同步发情的临时寄母羊的输卵管内进行体内培养，5天后剪下临时寄母羊的输卵管后，用F10(GIBCO)培养液冲洗输卵管以回收NT胚胎。将回收的发育至桑椹/囊胚期NT胚胎移植到受体羊的子宫内，每只受体羊移植胚胎2-3枚。通过B超对受体羊的妊娠情况进行诊断，妊娠受体足月分娩，出生克隆羊。
实验结果如下编号为GTPrP74中靶细胞用作供核细胞，移植到去核的MII期奶山卵母细胞中，构建核移植胚胎。共进行了两批核移植实验(表1)。
在第一次核移植实验中，共有66枚发育到桑椹或囊胚期的胚胎移植到30个受体山羊子宫内，移植后35天时通过B超检查，有10只受体羊妊娠，其中2只妊娠受体羊早期流产，没有回收到可用于DNA分析的组织；3只妊娠受体羊没有明显的流产现象也没有小羊出生，可能胎儿组织溶解后被母体吸收了。剩余的5只受体羊怀孕到了足月，分娩出6只克隆羊，其中1只为死胎，3只克隆羊在出生后不久就相继死亡，2只克隆羊存活，目前仍生长正常。
在第二次核移植实验中，出生了5只克隆羊，其中2只在出生后48小时内死亡，3只存活，目前健康生长。表2列出了这11只克隆山羊的主要特征。
对这些克隆山羊进行了PCR和Southern杂交鉴定。PCR分析表明，第一次核移植出生的6只克隆羊中的5只以及第二次核移植出生的所有5只克隆羊均含有一个正常的PRNP等位基因和一个中靶的PRNP等位基因(表2)。图4a只是给出了最先出生的7只克隆羊的PCR鉴定结果。出生的11只克隆羊中仍然含有1只非中靶的小羊。
这说明经P1/P4引物PCR分析证明混合克隆的GTPrP74细胞克隆依然有非中靶细胞存在。对3只编号分别为8A、14A和45B的健康存活的小羊进行Southern杂交结果也证明这些小羊含有一个正常的PRNP等位基因和一个中靶的PRNP等位基因(图4b)。
所有5只继续存活的PRNP+/-克隆羊在出生后2个月(8A和14A)或者1个月(45B、50A和50B)，根据其体重及个体大小等判断这些小羊都显示出正常的发育情况。
表1、核移植情况
*两次核移植分组间大概有一个月的时间间隔。
表2、克隆羊的主要特征
*有三只最终受体羊(PrP7，Prp45和PrP50)分别各自出生了两只小羊。
实施例4PRNP+/-山羊的朊蛋白表达分析Western blot分析。对于细胞，收集后直接用裂解液(10mM Tris-HCl，pH7.4，100mM NaCl，10mM EDTA，0.5％Nonidet P-40，0.5％sodium deoxycholate)溶解。对于脑组织，利用与上面相同的裂解液制成10％(w/v)的匀浆液，1000g离心5分钟后，上清用于Western分析。等量的蛋白样品经12％的SDS-PAGE分离后，用半干法转移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride(PVDF))膜上。先用封闭液(50mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，10％non-fat dry milk)封闭1小时，而后用含1∶500稀释的抗阮蛋白单克隆抗体或者1∶1000稀释的抗actin单克隆抗体的封闭液在4度下孵育过夜。在洗涤三次后，用含1∶1000的山羊抗小鼠IgG的封闭液在室温孵育2小时。再次洗涤后，利用Pierce公司的SuperSignal WestPico chemiluminescent substrate试剂盒进行显色。
实验结果如下
为了证明使用1.1kb的neo-pA片段替换0.4kb的PRNP基因的编码区后可以使该中靶的等位基因在表达水平上失活，对1只编号为46A的PRNP+/-小羊的脑组织样品进行了PrPC蛋白表达水平的检测。PRNP+/-46A小羊是在第二批核移植中由编号为PrP46的受体羊在怀孕只有131天的时候分娩的，该小羊在出生后的第二天就自然死亡(见表2)。
分离自野生型山羊和PRNP+/-46A山羊大脑相同部位的脑组织首先被制成匀浆液，而后使用一个抗阮蛋白单克隆抗体进行检测。
结果显示，在两个样品中都可以检测到大小大约为28-36kDa的PrPC条带，然而与野生型山羊相比，PRNP+/-46A山羊脑内的PrPC表达水平明显下降(图5)，这说明了中靶的PRNP等位基因确实已被功能性失活。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海杰隆生物工程股份有限公司<120>一种制备朊蛋白基因敲除家畜的方法<130>059341<160>13<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>24<212>DNA<213>引物<400>1caatcgtatg cttctgctat gttc 24<210>2<211>21<212>DNA<213>引物<400>2caatgttacc ctatcgtggc c21<210>3<211>40<212>DNA<213>引物<400>3gaatccgcgg tgtcgactct ctagtccatg atcgttcctc40<210>4<211>43<212>DNA<213>引物<400>4tgttcaatgg ccgatcccat gatgacttct ctgcaaaata aag43<210>5<211>43<212>DNA
<213>引物<400>5ctttattttg cagagaagtc atcatgggat cggccattga aca43<210>6<211>37<212>DNA<213>引物<400>6gaatgcggcc gcagtactcc ccagctggtt ctttccg 37<210>7<211>44<212>DNA<213>引物<400>7ataagcggcc gcggatccag actatgagga ccgttactat cgtg 44<210>8<211>40<212>DNA<213>引物<400>8ccgctcgagg tcgacgtatc attcacttcg gctctgtaaa40<210>9<211>21<212>DNA<213>引物<400>9cacagccagg cattcagaaa c21<210>10<211>20<212>DNA<213>引物<400>10ccaccatgat attcggcaag 20
<210>11<211>21<212>DNA<213>引物<400>11cgccttcttg acgagttctt c 21<210>12<211>25<212>DNA<213>引物<400>12cacgatagta acggtcctca tagtc 25<210>13<211>22<212>DNA<213>引物<400>13gtatgatgca gggaaaccaa ag 2权利要求
1.一种制备朊蛋白基因敲除家畜的方法，其特征在于，包括以下步骤(a)通过基因打靶将一构建物定点引入家畜胎儿成纤维细胞，所述的构建物含有两个作为同源重组同源臂的朊蛋白基因片段和至少一个选择性标记基因片段；(b)筛选得到朊蛋白基因被敲除的家畜胎儿成纤维细胞；(c)将步骤(b)获得的家畜胎儿成纤维细胞作为核供体，制备朊蛋白基因敲除的家畜。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤(d)利用已获得的朊蛋白单等位基因敲除的家畜进行繁殖，获得朊蛋白双等位基因敲除的家畜。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤(d)利用朊蛋白基因被敲除的家畜胎儿成纤维细胞进行朊蛋白第二个等位基因的打靶，获得朊蛋白双等位基因敲除的家畜胎儿成纤维细胞细胞，再利用该细胞进行动物克隆，获得朊蛋白双等位基因敲除的家畜。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的标记基因为抗性基因。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的家畜为牛、绵羊、山羊、兔、猪。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，各同源臂序列的长度为1-20kb。
7.一种朊蛋白基因敲除的组织或细胞，其特征在于，所述组织或细胞来自采用权利要求1-3任一所述的方法制备的朊蛋白基因敲除的家畜。
8.一种制备家畜成纤维细胞的方法，所述的家畜成纤维细胞的朊蛋白基因被敲除，其特征在于，该方法包括步骤(a)通过基因打靶将一构建物定点引入家畜胎儿成纤维细胞，所述的构建物含有两个作为同源重组同源臂的朊蛋白基因片段和至少一个选择性标记基因片段；(b)筛选得到朊蛋白基因被敲除的家畜胎儿成纤维细胞。
全文摘要
本发明公开了一种制备朊蛋白基因敲除家畜的方法，即是将家畜的朊蛋白基因在细胞水平上先敲除后，再通过体细胞克隆的方法制备朊蛋白基因敲除的家畜，该家畜的朊蛋白基因的功能失活，不表达功能性的朊蛋白，从而使该家畜具有抵抗朊蛋白类相关疾病，如羊搔痒病、牛海绵状脑病(俗称疯牛病)等。
文档编号A01K67/027GK1970749SQ20051011077
公开日2007年5月30日 申请日期2005年11月25日 优先权日2005年11月25日
发明者成国祥, 陈建泉, 俞国华, 刘思国 申请人:上海杰隆生物工程股份有限公司