专利名称：一种软米育种方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，更具体地涉及植物基因工程领域。
背景技术：
软米是我国云南省特有的优质米，也是目前世界上正在兴起的一种新型稻米(宣文敏，农业与技术，2002(3)67-69，74)。软米米质界于糯性与粘性之间。天然软米最大的特点是稻米直链淀粉含量较低，一般小于10％(赵则胜等，中国特种稻，上海科学技术出版社，199549；宋文昌等，特种稻栽培与利用，科学出版社，199711-12)，这样的软米是制作我国驰名的“过桥米线”的专用稻米，同时还能被用于制作饭团等快餐食品的原料。随着人们生活节奏的加快和生活方式的改变，用于制作快餐食品重要原料软米的市场需求量也将会增加。
天然软米主要分布在云南省的德宏傣族自治州和保山地区的部分县，在临沧地区的耿马、云和、双江、永德等地也有少量栽培。软米地方品种的株高一般约175cm，高的可达205cm，虽茎秆粗壮，但叶较披散而色较淡，而且产量较低，每亩约250kg。天然的软米品种被异地种植后，往往难于保持其原有的优良品质(董保柱，云南农业科技，2000，513-15)。上海农科院作物所曾经开展过软米引种研究，最终因为云南软米在上海地区无法保持其原有的优良品质而终止了此项研究。
近年来根据市场需要，我国有些省份已相继利用杂交育种技术培育出一些优质的软米新品种。但是采用常规方法进行水稻育种，不仅操作烦琐、盲目性太大、所需时间长，而且有些不良的农艺性状有时很难去除，育种目标与结果往往比较难做到一致。自20世纪70年代随着基因工程技术的建立与完善，使利用转基因技术改良作物品质已成为可能。如在常规育种中结合采用转基因方法培育优质软米，不仅可以在较短时间内达到目的，而且大多不改变受体水稻的其它农艺性状，效果显著。
稻米直链淀粉主要由编码“结合于淀粉粒上的淀粉合成酶”(GBSS)的蜡质基因(Waxy)催化合成的(Okagaki等，Genetics，1988，1201137-1143)。目前已有报道表明导入水稻蜡质基因(Waxy)反义片段能够有效降低稻米直链淀粉含量(Shimada H，et al，Theor ApplGenet，1993，86(6)665-672；Terada R，et al，Plant Cell Physiol，2000，41(7)881-888；王新其等，上海农业学报，2002，18(增刊)69-73；陈秀花等，科学通报，2002，47(9)684-688；刘巧泉等，Transgenic Res，2003，1271-82；李建粤等，科学通报，2004，49(24)2556-2561；沈革志等，植物生理与分子生物学学报，2004，30(6)637-643)。现有的利用反义蜡质基因降低水稻稻米直链淀粉含量的报道，都是利用p13W4或p13W8两种只带有一份反义蜡质基因的载体(图1a和b)转化水稻，达到降低稻米直链淀粉含量的目的。但是分析这些已有的报道，从所有转基因后代中，稻米直链淀粉含量位于云南特种软米范围的后代比例都较低。这是由于目前人们使用的转化载体都是将一份蜡质基因反义片段构建在一个T-DNA区段上，利用含有这些载体的根癌农杆菌介导转化水稻获得的转基因后代，往往是单拷贝整合的后代比多拷贝整合的后代数量多。
李建粤等采用p13W4和p13W8两种载体(来自中科院上海植物生理与生态研究所王宗阳研究员)转化不同的水稻品种，获得转基因后代。在单独使用含有p13W4根癌农杆菌介导转化上师大2号品系时，由5块抗性愈伤分化获得转基因苗。利用PCR(图3)和Southern blot(图4)检测转基因T0代植株，4个转基因后代外源基因呈单拷贝整合，其中有一个植株为双拷贝整合(图4中第4泳道)。从T0代植株上收获T1代种子，采用比色法分析转基因T1代种子和未转基因种子糙米直链淀粉含量。结果显示，未转反义蜡质基因的对照糙米直链淀粉平均含量为14.7％，4个单拷贝植株糙米直链淀粉平均含量分别为12.9％、13.0％、14.2％和13.7％，糙米直链淀粉含量比对照有不同程度的降低，但降低幅度相对较小；由双拷贝整合的植株T1代种子糙米直链淀粉含量平均为6.8％，比对照降低53.4％，与对照差异经统计分析达极显著的水平。然而，这种利用一份蜡质基因的载体转化所获得的双拷贝、多拷贝整合的后代数量毕竟比较少，用于育种则带有偶然的成分，使育种的过程的不可预测性增加。
另外，随着商业化植物转基因品种的不断出现，基因工程食品的安全性问题越来越引起人们的关注。基因工程食品安全性问题主要是由于抗生素或耐除草剂等抗性选择标记基因存留于转基因植物中产生的，获得不带有抗性选择标记基因的转基因植物，对于转基因作物的推广应用极为重要。现有的利用根癌农杆菌介导的共转化法培育转基因后代，均需要利用抗性选择标记基因来筛选转化子，而且获得无抗性选择标记基因，同时目的基因呈双拷贝转基因植株的概率比较小，即便获得目的基因呈双拷贝整合的转基因植株，由于两个拷贝整合在水稻基因组的不同位点，筛选两个T-DNA整合位点都纯合的转基因后代也比较困难。
为了更有效地利用反义蜡质基因培育直链淀粉含量介于云南软米范围的特种水稻，有必要重新建立一种利用反义蜡质基因的表达载体转化粳稻和籼稻进行育种的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种软米育种方法及其应用，以克服现有的杂交育种操作烦琐、盲目性大、所需时间长、不良性状难以去除、育种目标与结果难以一致的缺陷；以及现有转基因方法只转化一份蜡质基因反义片段，多份拷贝整合的后代数量少、筛选两个只有目的基因的T-DNA整合位点都纯合的转基因后代比较困难、后代稻米直链淀粉含量仍较高、带有耐抗生素基因等抗性选择标记基因带来基因工程食品安全性问题的缺陷。
技术方案 本发明的内容之一是提供一种软米育种方法，包括如下步骤 (1)水稻组织经培养制备转化受体组织； (2)受体组织和带有双份反义蜡质基因和报告基因的载体的根癌农杆菌共培养； (3)培养组织转入筛选培养基进行筛选后，转入分化培养基获得再生植株； (4)转基因植株经检测确定为共转化的T0代转化子； (5)从T0代转化子收获T1代种子，利用报告基因检测T1代种子获得无抗性选择标记基因的后代； (6)收获T2代种子，并对T2代植株进行导入载体的检测，从中筛选获得反义蜡质基因为双份整合的纯合转基因后代。
上述的软米育种方法的优选方案为，所说的步骤(2)中双份反义蜡质基因转化载体为具有图2(c)所示结构表达载体。
上述的软米育种方法的另一优选方案为，所说的步骤(1)中经组织培养制备转化受体组织的水稻材料为授粉后的幼胚或由水稻成熟种子诱导成的愈伤组织。幼胚的选择优选授粉后12-15天的幼胚；所说的幼胚组织培养的时间为3到5天，优选为4天。成熟种子诱导产生的愈伤组织优选经过一次继代培养。
上述的软米育种方法的另一优选方案为，所说的步骤(2)中的根癌农杆菌还带有潮霉素抗性选择标记基因及gus报告基因。
上述的软米育种方法的另一优选方案为，所说的步骤(4)中转基因植株的检测是利用PCR检测或者Southern blot方法分析植株的DNA。
上述的软米育种方法的另一优选方案为，所说的步骤(5)中的检测是采用稻米中报告基因的检测来获得无抗性选择标记基因的种子，报告基因优选为gus基因。所说的步骤(6)中利用PCR检测T2代植株反义蜡质基因为双份整合的纯合转基因后代。
本发明的内容之二是提供所述软米育种方法的应用，即利用上述步骤(1)至(5)转化水稻，优选以带有双份反义蜡质基因转化载体的农杆菌转化禾本科植物。
上述的软米育种方法的应用的一种特例为，以所说的带有双份反义蜡质基因转化载体p13AW-2的根癌农杆菌转化水稻，优选转化稻米直链淀粉含量小于15％的粳稻或者籼稻品系或品种获得软米新品种。
有益效果 (1)利用杂交育种技术可以培育出一些优质的软米新品种，但采用常规方法进行水稻育种，不仅操作烦琐、盲目性太大、所需时间长，而且有些不良的农艺性状有时很难去除，育种目标与结果往往比较难做到一致，本发明提供的软米育种方法使有效地利用转基因技术在较短时间内达到改良稻米品质的目的已成为可能。
(2)现有转基因技术进行软米育种，都是利用反义蜡质基因p13W4或p13W8两种单份反义蜡质基因载体(图1)转化水稻。本发明提供的软米育种的方法，是以含双份反义蜡质基因的表达载体，利用根癌农杆菌介导共转化粳稻和籼稻，可更有效降低稻米直链淀粉含量，得到软米品种。
(3)利用p13W4载体单独转化水稻或利用p13W8载体共转化水稻的方法所获得的稻米，其所有转基因后代中，单拷贝整合的后代比多拷贝整合的后代数量多，造成后代的稻米直链淀粉含量位于云南特种软米范围的比例都较低，本发明的软米育种方法使转基因后代中保持高比例的低直链淀粉稻米。
(4)利用共转化法将分别含有抗性选择标记基因载体和只含有反义蜡质基因载体(p13W8，图1b)转化水稻，可以培育出直链淀粉含量比对照降低的转基因后代，但获得双拷贝转基因植株的概率比较小，而且即便获得双拷贝整合的转基因植株，由于两个拷贝整合在水稻基因组的不同位点，筛选两个T-DNA整合位点都纯合的转基因后代也比较困难。本发明提供的方法可以有效地获得双份反义蜡质基因整合的转基因植株，且两份反义蜡质基因整合在水稻基因组的同一染色体上，并呈紧密连锁，便于筛选纯合子。
(5)天然的软米品种被异地种植后，往往难于保持其原有的优良品质，利用本发明的育种方法转化本地适种的品种，可以解决这一问题。
(6)软米地方品种的产量较低，每亩约250kg，利用本发明的育种方法转化一些高产稳产品种可以大幅提高软米产量。
(7)本发明的育种方法不但可以适用于粳稻品种或种系，也适用于籼稻品种或种系。
(8)最为重要的是，本发明提供的育种方法采用从T0代共转化子植株上收获T1代种子，利用稻米gus报告基因的检测来获得无抗性选择标记基因的种子；再利用PCR检测T2代植株得到反义蜡质基因为双份的纯合转基因后代的检测鉴定方法，无须通过抗性标记进行筛选，所获的软米品种不带有耐抗生素或耐除草剂等抗性选择标记基因以及不含有来自于花椰菜花叶病毒的35S启动子，在育种过程中避免了基因工程食品安全性问题的困扰，对于转基因作物的推广应用意义重大。
本文所用的术语“软米”是指原产我国云南省特有的优质米，其米质界于糯性与粘性之间，稻米的直链淀粉含量较低，一般小于10％。
本文所用的术语“蜡质基因(Waxy)”是指编码“结合于淀粉粒上的淀粉合成酶”(GBSS)的基因。
本文所用的术语“p13AW-2表达载体”是指具有图2所示结构特征的表达载体。
本文所用的术语“PCR方法”是指聚合酶链式反应的基因扩增方法。
本文所用的术语“Southern blot方法”是指DNA印迹杂交的方法。
本文所用的术语“CaMV 35S基因终止子”是指来自于花椰菜花叶病毒的35S终止子。
本文所用的术语“gus基因”是指β-葡萄糖醛酸糖苷酶(GUS)基因。
本文所用的术语“T-DNA”是指根癌农杆菌Ti质粒基因组中可转移并整合到寄主植物细胞染色体上去的特定DNA片段，亦即一种转位单元。
图1是两种能够用于降低稻米直链淀粉含量的双元载体p13W4(a)和p13W8(b)T-DNA区的结构图。图中，232Wx-pro、232Int.l水稻232Waxy基因的启动子和第一内含子；Wx frag水稻232Waxy基因的反义DNA片段(756bp)；LB、RBT-DNA的左右边界；Nos-terNos基因终止子；35S-pro、35S-terCaMV 35S基因启动子和终止子；HPt潮霉素抗性基因；gusβ-葡萄糖醛酸糖苷酶基因；XhXhoI；EEcoRI；SaSacI；BBamHI；XXbaI；SSalI；PPstI；HHindIII。
图2是无抗性标记基因和35S启动子的双份反义蜡质基因载体p13AW-2(c)T-DNA区的结构图。图中，Wx-pro、Int.l水稻Waxy基因的启动子和第一内含子；Wx frag水稻Waxy基因的反义DNA片段；LB、RBT-DNA的左右边界；Terminator基因终止子。
图3是转基因水稻PCR检测结果。M标准DNA；1p13W4载体；2未转基因对照水稻；3-7转基因水稻。
图4是转基因水稻Southern blot分析结果。1p13W4载体；2-6转基因水稻；7未基因对照水稻。
具体实施例方式 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中涉及的细菌转化、PCR方法和Southern blot方法等主要参考《分子克隆实验指南》(萨姆布鲁克J等，分子克隆实验指南(第二版)，科学出版社，1992)。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 本实施例是描述利用根癌农杆菌介导将p13AW-2表达载体导入粳稻品种培育粳型软米的方法。
水稻品种上师大2号、超2-10等粳稻品系或品种。
根癌农杆菌菌种和质粒根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105来自于中国科学院上海植物生理和生态研究所，质粒p13AW-2来自于上海师范大学。
培养基和化学试剂培养基N6D2，N6D2C，N6D2S1，N6D2S2，MSRCH和1/2MS0H的成分和化学试剂见文献(刘巧泉等，植物生理学报，1998，24(3)259-271)。
水稻组织培养和转化受体组织的预处理取授粉后12-15天的幼胚，按照文献(颜昌敬主编，1991，农作物组织培养，上海科学技术出版社)的方法，经表面消毒后接种于N6D2培养基上，于26℃黑暗条件下培养4天。也可以取水稻的成熟种子，经灭菌后切取半粒保留胚部分的1/2种子接种于N6D2培养基上。由成熟胚制备转化受体组织的方法参照文献(李建粤等，科学通报，2004，49(24)2556-2561)。
根癌农杆菌的培养和水稻转化根癌农杆菌的培养和转化方法主要参考文献(Hiei Y等，Plant J，1994，6271-282)的方法，并有改动。将分别带有p13AW-2载体和带有潮霉素抗性选择标记基因及gus报告基因载体的根癌农杆菌菌液培养至OD600为0.4-0.55左右时离心收集菌体并重现悬浮于AAM培养基(Hiei Y等，Plant J，1994，6271-282)，再将两种根癌农杆菌以9∶1的比例混合。水稻受体组织浸入AAM混合菌液30-60分钟，取出吸干多余菌液，转移至N6D2C培养基，于26℃黑暗共培养3-4天。取出组织吸干菌液，转入N6D2S1培养基培养。
植株再生培养组织转入N6D2S2培养基继代培养2周后，将生长旺盛的愈伤组织转至再生培养基MSRCH上，光照14h/d培养，分化获得小苗。再转入1/2MS0H培养基使植株生根后，移入温室培育获得T0代植株。
转基因植株检测转基因水稻利用PCR检测和Southern blot分析其总DNA，确定T0代中的共转化子。
从T0代共转化子植株上收获T1代种子，采用稻米gus报告基因的检测可以获得无抗性选择标记基因的种子。再利用PCR检测T2代植株可得到反义蜡质基因为双份的纯合转基因后代。
从每个单株的穗子顶端取30-50粒种子，采用比色法(Juliano，B.O.，Cereal Sci.Today，1971，16334)分析转基因T1代种子和未转基因种子糙米直链淀粉含量。每个样品重复检测三次，并采用方差分析法进行统计分析。将稻米直链淀粉含量低于10％的，介于我国云南特种软米范围内单植后代留种。以同样的方法检测含有两份反义蜡质基因纯合的转基因后代种子的直链淀粉含量。
继续繁殖一代，观察转基因后代稻米直链淀粉含量性状的稳定性。
实施例2 本实施例是描述利用根癌农杆菌介导将p13AW-2表达载体导入籼稻品种培育籼型软米的方法。
水稻品种选取直链淀粉含量约为15％籼稻品种嘉早312和嘉早935。
根癌农杆菌菌种和质粒、培养基和化学试剂等方法按照实施例1。水稻组织培养和转化受体组织的预处理、根癌农杆菌的培养、植株再生等方法按照陈秀花等人的报道(陈秀花等，江苏农业研究，2001，22(1)1-6)。水稻转化、转基因植株检测等方法按照实施例1。
按照上述方法转化籼型水稻品种，同样可以大幅度降低稻米直链淀粉含量，培育籼型软米。
尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。
权利要求
1.一种软米育种方法，包括如下步骤
(1)水稻组织经培养制备转化受体组织；
(2)受体组织和带有双份反义蜡质基因和报告基因的载体的根癌农杆菌共培养；
(3)培养组织转入筛选培养基进行筛选后，转入分化培养基获得再生植株；
(4)转基因植株经检测确定为共转化的T0代转化子；
(5)从T0代转化子收获T1代种子，利用报告基因检测T1代种子获得无抗性选择标记基因的后代；
(6)收获T2代种子，并对T2代植株进行导入载体的检测，从中筛选获得反义蜡质基因为双份整合的纯合转基因后代。
2.根据权利要求1所述的软米育种方法，其特征在于，所说的步骤(2)中双份反义蜡质基因转化载体为带有图2(c)所示结构的表达载体。
3.根据权利要求1所述的软米育种方法，其特征在于，所说的步骤(1)中经组织培养制备转化受体组织的水稻材料为授粉后的幼胚或由成熟胚诱导的愈伤组织。
4.根据权利要求3所述的软米育种方法，其特征在于，所说的步骤(1)中幼胚组织培养的时间为3到5天或者成熟种子诱导产生的愈伤经一次继代培养。
5.根据权利要求1所述的软米育种方法，其特征在于，所说的步骤(2)中的根癌农杆菌还带有潮霉素抗性选择标记基因及gus报告基因。
6.根据权利要求1所述的软米育种方法，其特征在于，所说的步骤(4)中转基因植株的检测是利用PCR检测或者Southern blot方法分析植株的DNA。
7.根据权利要求1所述的软米育种方法，其特征在于，所说的步骤(5)中的检测是采用稻米中gus报告基因的检测来获得无抗性选择标记基因的种子。
8.根据权利要求1所述的软米育种方法，其特征在于，所说的步骤(6)中的检测是利用PCR检测植株DNA。
9.权利要求1所述的软米育种方法的应用，即利用上述步骤(1)至(5)转化禾本科植物，其特征在于，利用带有双份反义蜡质基因的转化载体的根癌农杆菌转化水稻。
10.根据权利要求9所述的软米育种方法的应用，其特征在于，以所说的带有双份反义蜡质基因转化载体p13AW-2的根癌农杆菌转化稻米直链淀粉含量小于15％的粳型或籼型水稻品系或品种获得软米新品种。
全文摘要
本发明公开了一种软米育种方法，特别是指利用摘要附图中(c)所示的基因序列转化水稻品系或品种。包括以带有双份反义蜡质基因表达载体及报告基因载体的根癌农杆菌共转化受体组织，转基因植株经检测确定为共转化T0代，通过后代稻米GUS活性检测获得无抗性选择标记基因的种子，再采用PCR方法对T2代进行导入载体的检测，筛选获得反义基因为双份整合的纯合转基因后代的方法。利用本发明的方法转化禾本科植物如水稻，可快速获得不含抗性选择标记基因的低直链淀粉含量的新型软米品种。
文档编号A01H1/04GK1957679SQ200510110050
公开日2007年5月9日 申请日期2005年11月4日 优先权日2005年11月4日
发明者李建粤, 杨丽君, 尹中明, 周永国, 沈忠伟 申请人:上海师范大学