专利名称：Mhc－ⅱ转基因动物耐受性的研究方法
技术领域：
本发明涉及用于测试蛋白质变体的免疫原性的体内系统。特别地，本发明涉及使用人类II类MHC分子转基因小鼠的方法，其中使该小鼠对特定蛋白质耐受并然后使用所述特定蛋白质的变体测试免疫原性的诱导。另外，本发明涉及用于从蛋白质变体库中选择免疫原性降低的蛋白质的体内系统，藉此被耐受化的(tolerised)人类MHC转基因小鼠被注射结合有不同变异蛋白质的文库细胞系或颗粒，藉此结合有具有比文库中其他蛋白质更低免疫原性的变异蛋白的特定细胞系或颗粒在体内被选择。
目前用于测试候选药物蛋白在人类中潜在免疫原性的方法是有限的，主要因为非人类物种具有不同于人类的MHC(主要组织相容性抗原)分子并因此在测试动物中对注入蛋白的免疫应答不反映在人类中对相同蛋白质的预期免疫应答。因此，使用人类细胞或具有人类MHC的细胞来测试蛋白质免疫原性是重要的。一种特别有价值的方法是使用人类血液样品在T细胞增殖测定中测试蛋白质。然而，该方法检测T细胞在体外对受试蛋白质的应答并且迄今还没有产生如体内发生的抗体生成的体外免疫原性方法得到证明。替代方法可以利用使用人类T和B细胞重建的小鼠或转基因小鼠，其中家居(resident)小鼠MHC和在一些情况中的T细胞受体分子已经被它们的人类对应物所取代。然而，这些方法可能不会形成人类中免疫原性的准确预测，因为它们没有考虑耐受性，特别是人类免疫系统对正常人类蛋白的耐受性。例如，人类MHC转基因小鼠将依然预期产生(mount)对抗所注射的人类蛋白的免疫应答，因为所述小鼠将不耐受这样的人类蛋白。因此需要改进的方法以促进蛋白质和蛋白质变体的体内免疫原性的测试，其考虑了在物种中对蛋白质的正常耐受性。
因此，本发明的第一个方面提供了用于测试从哺乳动物抗原衍生的变异抗原在所述哺乳动物II类MHC分子的非人类转基因哺乳动物中的免疫原性的方法，其中所述非人类哺乳动物不是所述哺乳动物抗原的来源，所述方法包括(a)通过与所述哺乳动物抗原的接触使所述转基因哺乳动物对所述哺乳动物抗原是耐受的；(b)将所述转基因哺乳动物与所述变异抗原相接触；和(c)检测所述变异抗原在所述转基因哺乳动物中的免疫原性。
本发明提供了用于测试蛋白质和蛋白质变体的免疫原性的新型体内系统。如这里所讨论的，变异抗原衍生于哺乳动物抗原。变异抗原可以包括具有增加、缺失或取代的或者通过化学方法衍生的蛋白质或多肽序列。所述抗原不是来源于在该方法中使用的非人类转基因哺乳动物。
特别地，本发明涉及使用允许展示人类T细胞表位的人类II类MHC分子转基因小鼠并测试小鼠背景中人类蛋白质和蛋白质变体的潜在免疫原性的方法。
在本发明的一个实施方案中，通过注射低浓度(例如，相当于人类血清和/或其他组织中发现的生理量)蛋白质在表达人类II类MHC(HLA-tg)种系的新生小鼠中诱导对人类蛋白的耐受性。蛋白质优选地是单体的并于免疫“惰性”缓冲液(如盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS))中静脉注入。在这类系统中，诱导耐受性的剂量频率将根据耐受性被诱导针对的蛋白质而不同。例如，正常以高血清浓度存在的蛋白质最可能需要比那些正常以低生理浓度发现的蛋白质更频繁地被注入以诱导耐受性。
优选地，未成熟小鼠(例如新生小鼠)将被使用以保证耐受化(tolerising)蛋白质存在于T细胞发育并因此诱导中心耐受的过程中。典型地，年龄不超过6周的小鼠将被反复注入，其中来自胸腺的成熟CD4+和CD8+T细胞的生成减少(正常成人期)。具有针对受试蛋白质或受试变异蛋白的不变异形式的已建立的耐受性，被耐受化的小鼠然后将被注射受试蛋白或蛋白变体并随后被检测对抗受试蛋白或蛋白变体的免疫原性。在具有完整的免疫球蛋白基因的小鼠中，免疫原性可以通过针对受试蛋白或蛋白变体的抗体的生成而被检测。或者，与免疫原性有关的其他测定法可以被采用，如使用来自被耐受化的HLA-tg小鼠的外周血液、脾或派伊尔氏斑(Peyer′s Patch)来检测受试蛋白-特异性T或B细胞应答的测定法。
在本发明的另一个实施方案中，通过对表达人类转基因(关于感兴趣的蛋白质)的小鼠回交人类HLA-tg小鼠而在小鼠中诱导耐受性。例如，表达人类IgG的人类HLA-tg小鼠能够被产生，其对人类IgG是耐受的。当人类IgG不是以这样的方式表达，如允许可变(V)区体细胞突变(somaticmutation)、易位或重排，或者通过类转换(class switching)的恒定(C)区改变，那么这些小鼠将对所表达的特定的人类IgG序列是耐受的但对某些人类V区体细胞突变、易位或重排或者通过类转换的C区改变不是耐受的。当人类IgG以这样的方式表达，如允许V区体细胞突变、易位或重排或者C区类转换，那么这些小鼠将不仅对含有特定种系的V和C区序列的特定人类IgG是耐受的而且对已经经历亲和力成熟并对任一抗原特异的人类IgG也是耐受的。
在这些条件下，可能生成表达内源性人类II类MHC的转基因小鼠并且能够获得在人类II类MHC背景中的中心耐受所针对的人类蛋白。被整合入小鼠基因组的人类转基因(编码感兴趣的人类蛋白)的拷贝数或者所述转基因的表达效率(由不同因素决定，如转录和翻译效率以及所述小鼠基因组内转基因的定位)将决定所表达的蛋白质的量并可以是不同的以产生具有不同的人类转基因表达水平的小鼠以便只有表达“生理量”的转基因的小鼠被选择用于回交至HLA-tg小鼠。
使用注射或转基因方法之一来诱导HLA-tg小鼠中对人类蛋白的耐受性，优选地使用表达单个人类II类MHC等位基因的小鼠。因此，上述方法被采用以在各自表达单个II类MHC异型(allotype)的一组小鼠中诱导耐受性。多个HLA-tg小鼠将被选择以便获得人类II类MHC异型的如所需比例一样大的总体覆盖度。应该理解，在本发明范围内，其他方法可以被采用以使HLA-tg小鼠对感兴趣的特定蛋白或蛋白变体是耐受的，包括诱导对特定蛋白耐受的特定白细胞的方法，删除对特定蛋白有反应性的特定白细胞的方法和在免疫系统暴露于特定蛋白或变体过程中调节免疫系统以便诱导耐受性的方法。还应该理解，如果可能，不表达特定受试蛋白或蛋白变体的小鼠同系物的小鼠将优选用于本发明以避免这些小鼠对受试蛋白或蛋白变体的任何固有的耐受性。
应该理解，根据本发明上面实施方案的被耐受化的HLA-tg小鼠能够以多种方式被用于测试特定蛋白或蛋白变体的免疫原性或者用于根据免疫原性分级一组蛋白变体。在对特定蛋白耐受化的小鼠中，能够测试对所述蛋白的变体的免疫原性，所述变体包括蛋白质中具有氨基酸改变的变体、具有氨基酸修饰((如脱酰胺或糖基化)差异、组成差异、物理差异(如聚集差异)或其他任何可能导致免疫原性的差异的变体。特别地，可以通过将感兴趣的蛋白质以渐增的浓度注入被耐受化的小鼠来确定高和延长的剂量(dosing)的后果。还可以考察与注入途径有关的免疫原性，其中蛋白质可以在被耐受化的小鼠中的不同部位注入并评估作为结果的免疫原性。应该理解，被耐受化的小鼠中的免疫原性的分析可以通过多种方法进行，包括在注射针对抗体的受试蛋白质或蛋白变体后测试来自小鼠的血液样品或其他组织样品(如派伊尔氏斑，脾)(如通过ELISA、RIPA、FACS和表面等离子体共振)；测试T细胞增殖或活化；测试蛋白反应性T细胞的生成，例如通过特定的肽-MHC复合体的结合；通过检测细胞因子生成、增殖、细胞表面标志的表达、Ca2+流量、PCR或DNA指纹印迹来测试T或B细胞；测试特异性免疫反应性B或T细胞的出现；或者通过测试免疫原性的其他任何方法。应该理解，具有完整功能性免疫球蛋白基因的被耐受化的小鼠中的免疫原性的分析可以通过单个受试蛋白的注射和经由抗体生成的免疫原性的测定来进行，例如通过测定与注射的受试蛋白结合的抗体的形成，或者通过注射受试蛋白或蛋白变体的混合物，例如通过测试为响应注射的混合物而形成的用于结合所述混合物中特定蛋白或蛋白变体的抗体(例如通过在单个受试蛋白或蛋白变体的阵列上免疫印迹；或者通过分离来自被注射小鼠的抗体或抗体序列并测定这些抗体用于结合单个受试蛋白或蛋白变体的特异性)。
本发明将特别适合于不同人类(或人源化的)单克隆抗体或其片段的免疫测试，藉此HLA-tg小鼠被耐受化人类单克隆抗体序列，并藉此这样的小鼠然后能够与在可变区具有体细胞突变(或其他非种系(non-germ-line)突变、易位或重排)的人类抗体关联的可变区突变反应。在这些例子中，具有缺失的或非表达性内源性小鼠免疫球蛋白基因的小鼠将是优选的。像这样，本发明将特别适合于人类或人源化单克隆抗体文库或组(panels)的比较性的免疫原性测试，以识别那些没有或具有低水平免疫原性的抗体。特别地，本发明用于测试被注入相同小鼠中的不同人类(或人源化的)单克隆抗体或其片段的混合物并用于测定(例如通过免疫印迹)混合物中单个抗体免疫原性的装置特别适合于快速分析大的抗体文库。对于展示在颗粒(如噬菌体、细胞或其他颗粒)上的抗体，本发明优选地(但非必须地)包括抗体文库直接注射在展示颗粒上，其中小鼠对注射的颗粒是耐受的。
作为本发明的扩展，应该理解，额外转基因感兴趣的蛋白质或蛋白变体的HLA-tg小鼠能够被用于产生具有耐受性的蛋白变体，所述耐受性的产生与特异性HLA背景(如人类HLA)有关。例如，当人类IgG种系以允许随后的V区体细胞突变、易位或重排或C区类转换的方式表达时，人类单克隆抗体能够随人类HLA背景的抗原的注射而被生成。然后，在这些小鼠中表达的人类HLA背景中，小鼠对已经经历亲和力成熟的人类IgG是耐受的并对任一抗原是特异性的。然后这可以降低这样的预期在这种人类HLA-tg小鼠中产生的人类抗体将在人类中是非免疫原性的。
应该理解，对感兴趣的蛋白或蛋白变体耐受或转基因的HLA-tg小鼠能够被用于涉及人类药物生成和测试的多种免疫原性筛选应用。例如，除了检测蛋白变体的免疫原性之外，这种HLA-tg小鼠能够用来绘制感兴趣的蛋白质或蛋白变体中的免疫原性区或免疫原性序列。特别地，感兴趣的蛋白或蛋白变体的肽扫描部分或所有序列能够通过直接注射入HLA-tg小鼠中和随后的免疫原性测定而被测试，例如通过来自血清或组织隔离群(isolates)的T细胞增殖的测定。以该方式，这种HLA-tg小鼠将特别有用于绘制蛋白质或蛋白变体的序列中的T细胞表位。然后这类T细胞表位序列能够在蛋白或蛋白变体中被修饰以在蛋白质或蛋白变体作为用于人的潜在药物的使用之前清除所述表位。
应该理解，对感兴趣的蛋白或蛋白变体耐受或转基因的HLA-tg小鼠能够以多种方式被使用来测试感兴趣的蛋白或蛋白变体的免疫原性，所述测试在以不同剂量、不同组分、不同时间点的注射和反复剂量之后进行，所述感兴趣的蛋白或蛋白变体来自不同制备批次，包括生产批次和含有不论是共同注射的还是存在于HLA-tg小鼠中的不同试剂，如感染性疾病试剂、各种其他细胞、其他药物、化学/环境试剂，以及在免疫妥协的或经受各种攻击、损伤或疾病的HLA-tg小鼠中。
在本发明进一步的扩展中，被感兴趣的蛋白质耐受化的HLA-tg小鼠被用来直接从变体蛋白文库中选择那些与文库其他成员相比具有低免疫原性的蛋白质。在这种选择中，HLA-tg小鼠对特定蛋白或蛋白变体的免疫原性应答直接导致针对所述蛋白或蛋白变体的选择，以便其他低免疫原性的蛋白被富集或识别。例如，由免疫原性蛋白或蛋白变体诱导的抗体直接结合所述免疫原性蛋白或蛋白变体，作为针对该变体的选择基础。几种方法已经被用来实现这种选择。例如，来自注射了变体蛋白文库的HLA-tg小鼠的血清免疫球蛋白可以被用来从所述文库中预吸收(例如，通过免疫沉淀或免疫层析)免疫原性蛋白变体而留下较少免疫原性或无免疫原性的变体，其可以在蛋白质分子水平(例如通过基于质谱的序列测定或指纹印迹)被识别或者通过与变体连接的颗粒，例如肽序列标签、核酸序列或用于在文库中识别特定蛋白变体的任何其他分子代码。其他体外方法能够被用来识别具有低免疫原性的变体，如这类变体只被捕获至固相上的方法，其中没有小鼠抗体出现来干扰蛋白变体上的特定捕获位点。例如，在人类IgG文库的例子中，固相抗原制备可以被用来捕获抗体，其中没有小鼠免疫球蛋白已经结合至人类IgG上的抗原结合位点。
作为从文库中选择具有低免疫原性的变体蛋白的体外方法的替代，体内选择方法可以被使用，其中较小免疫原性的或无免疫原性的变体在体内被选择。体内选择是经由在被耐受化的HLA-tg小鼠中诱导的抗体，从循环或所述小鼠内注射的小室中结合并清除特定变体或者通过直接杀灭或吞食表达这种变体的活细胞或与这种变体结合的颗粒，例如经由表面IgG的骨髓瘤细胞或者经由ADCC(抗体依赖的细胞毒作用)或CDC(补体依赖的细胞毒作用)的活噬菌体，或者通过抗体依赖的吞饮与特定变体连接的惰性颗粒。在基本方法中，HLA-tg小鼠被注射所述蛋白变体文库(例如，静脉内注射)并在所选择的时间点分析哪个蛋白变体依然未被宿主免疫球蛋白清除。该分析的进行可以例如通过在所选择的时间点纯化蛋白变体文库成员并识别在体内选择之后富集于文库内的变体。或者，当蛋白变体与核酸连接时(例如，在活细胞内，如骨髓瘤或是噬菌体)，所述分析的进行可以通过与富集的蛋白变体连接的基因的直接扩增和DNA测序或者在选择之前和之后的DNA指纹印迹来识别由所述选择所富集的指纹中的条带，这种条带然后提供了所富集的蛋白变体的识别。当蛋白变体在活细胞或颗粒上选择并且这种细胞或颗粒本身诱导免疫原性的情况下，HLA-tg小鼠可以被耐受化这种细胞或颗粒，例如通过注射或进一步添加至转基因背景，或者通过其他用于避免在蛋白变体选择过程中的这类细胞和颗粒的干扰的方法。
本发明的一个例子是由活细胞生成的抗体变体的体内选择，藉此一部分活细胞(如表达人类IgG的小鼠骨髓瘤(例如杂交瘤)细胞文库或展示抗体V区的噬菌体细胞)被注射入被耐受化的HLA-tg小鼠中。这些小鼠将生成针对任何由经注射的骨髓瘤细胞或噬菌体所生成的免疫原性人类IgG的抗体，并且这些抗体将结合表面IgG，从而抑制细胞生长/噬菌体感染力或者导致这些细胞或噬菌体的毁灭(通过ADCC、CDC或细胞内吞作用)。以这样的方式，被耐受化的HLA-tg小鼠将选择对抗生成免疫原性抗体的骨髓瘤细胞或噬菌体并且生成具有低或无免疫原性的抗体的细胞/噬菌体将从注射的群体中被富集。然后，这种生成具有低或无免疫原性的想要的抗体的细胞/噬菌体可以被回收，例如通过回收并培养富集的骨髓瘤细胞，通过使用抗Ig染色的细胞分选的使用来分选抗体生成细胞，或者通过细菌的周期感染扩增选择的噬菌体。或者，对于非永生化的(non-immortalised)哺乳动物细胞，如B细胞，标准的永生化和克隆程序可以被使用，如包括EBV转化或细胞融合或其他在克隆之前永生化的方法，或者核酸扩增方法(如PCR)可以被使用来从选择的抗体中分离V区基因。另外，在被耐受化的HLA-tg小鼠中的选择之前和之后的B细胞群的比较性分析可以被用来识别富集的B细胞谱系或特定抗体的富集，例如通过比较性PCR、比较性DNA指纹印迹或比较性的质谱方法，如LC-MS。
本领域技术人员将会理解，本发明用于测试蛋白质和蛋白变体的免疫原性的方法有很多变形，但是这些变形应该被认为在本发明范围之内，其利用对特定蛋白或蛋白变体耐受化的HLA-tg小鼠作为背景来测定蛋白质的免疫原性或者来选择具有低或无免疫原性的蛋白质或比较和分级基于免疫原性的不同蛋白质。还应该理解，对特定蛋白耐受化的HLA-tg小鼠是新颖的，尤其是具有除了人类HLA转基因外的一个或多个人类蛋白转基因的转基因小鼠。特别地，优选地编码尽可能多的人类重链和轻链可变区免疫球蛋白基因座的具有额外的人类IgG转基因的人类HLA-tg小鼠是新颖的，并特别有用于治疗性单克隆抗体的免疫原性测试或治疗性抗体从选择变体中的体内选择。还应该理解，本发明特别应用于生成作为药物或体内诊断试剂用于人类的蛋白质，藉此人类HLA-tg小鼠将被使用并且具有很少或没有免疫原性的蛋白质被选择，使用与人类中存在的相同HLA背景并使用在人类中预期的类似水平的耐受性(如果有)。应该理解，在本发明中，不同于小鼠的生物体可以被使用，其中人类HLA分子可以通过转基因或者通过其他如人类抗原展示细胞的注射的方法来提供。还应该理解，为不同于人类药物中的目的(例如对于动物药物)，不同于人类的HLA背景也可以被使用，具有诱导的针对所使用物种的蛋白质的耐受性。应该理解，耐受化的HLA-tg动物也能够在本发明范围内被使用并使用所述方法中的一些来选择具有高免疫原性的蛋白或蛋白变体用于疫苗中的使用。
本领域技术人员还应该理解，本发明通过广泛的体外或体内测试或分离方法来选择低免疫原性蛋白质和蛋白变体的方法有很多变形，但是这些变形应该被认为在本发明范围之内，其使用对特定蛋白或蛋白变体耐受化的HLA-tg小鼠作为背景用于这样的选择。还应该理解，通过被耐受化的HLA-tg小鼠的蛋白质或蛋白变体的分析或选择将通常需要一个范围的背景HLA异型中的平行分析或选择，一般通过一组具有不同异型的HLA基因型的转基因小鼠。对于在人类中应用的蛋白质或蛋白质变体的选择，代表至少50％人类群体的MHC异型范围是想要的，以避免在过少的异型上选择蛋白质，一旦所述蛋白质被注射入具有其他亚型的人类其可能导致免疫原性，所述其他亚型在被用于分析或选择的小鼠中是不存在的。
本领域技术人员还应该理解，本发明不应该被限制在转基因小鼠的使用，而可以包括被赋予转基因人类II类MHC并以相同方式被使用来测定蛋白变体的免疫原性或选择具有低免疫原性的蛋白变体的其他动物。还应该理解，本发明不应该被限制于蛋白质并可以应用于非蛋白质变体的免疫原性的测定或应用于选择具有低免疫原性的非蛋白质变体，如有机化学物质、无机化学物质、变应原、化妆品、环境污染物、传染剂和粮食。还应该理解，本发明可以被用于人用疫苗的开发和测试，例如测定在人类疫苗中使用的有效的T细胞表位，筛选有效的亚基或DNA疫苗，为人类中预期的效果来测试不同疫苗组成和给药途径，和测试用于预防疾病因子(如传染疾病、癌症和炎症)或诱导对抗疾病因子(如传染疾病、癌症和炎症)的免疫应答的潜在疫苗，藉此在测试潜在疫苗之前在小鼠(或其他动物)中引入或诱导这类疾病。还应该理解，除了人类II类MHC之外，本发明的HLA-tg转基因动物可以是关于其他的人类免疫系统的分子的单个组分或它们的组合的转基因，如T细胞受体、I类MHC、CD4、CD8和其他细胞因子或受体，在各自情况中引入人类免疫系统的其他组分，为模仿与人类免疫相关的一个范围的不同分子事件。以相同的方式，本发明的动物能够被植入一种或多种人类免疫系统的细胞以促进针对受试蛋白或非蛋白的人类免疫应答。
下述实施例被提供以描述本发明并不应该被理解为本发明范围的限制；实施例1.免疫原性/非免疫原性的受试抗体的生成。
被选择用于该研究的免疫原性受试抗体是已知为Remicade(Le等人，US6277969)的嵌合的抗TNFα抗体，具有来自小鼠cA2抗体的可变区(下文称为“Remicade”)。使用的其他受试抗体是已知为Herceptin(Carter等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，vol 89(1992)p4285，US5821337)(下文Herceptin)人源化的抗HER2抗体。使用的非免疫原性的对照抗体是整合了人类Vh3-53和VκO12种系序列的Herceptin衍生物(下文“GLH”＝Herceptin种系(germline Herceptin))。
使用现有技术公知的方法和适当的供应商关于这些方法中使用的酶和抗体的使用说明来进行重组DNA和抗体技术。常规方法的来源包括Molecular Cloning，A Laboratory Manual，3rd edition，vols 1-3，eds.Sambrook和Russel(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press；Current Protocols inMolecular Biology，ed.Ausubel，John Wiley和Sons；和Antibodies，ALaboratory Manual，eds.Harlow和Lane(1988)，Cold Spring Harbor。对于每条链，使用8个长度为30-60个氨基酸的编码完整人类VH和VL序列的寡核苷酸生成对应于Remicade、Herceptin和GLH抗体V区的序列。分开的VH和VL寡核苷酸首先被磷酸化，以等摩尔比例混合，在热循环仪中加热至94℃持续5分钟，随后冷却至65℃并在65℃下保持2分钟。然后在45℃下继续保持2分钟，35℃下保持2分钟，25℃下保持2分钟和4℃下保持30分钟。然后使用T4DNA连接酶(Life Technologies，Paisley，UK)14℃下连接寡核苷酸，持续18小时。
向各VH和VL寡核苷酸混合物中加入附加的编码包括Kozak序列、先导信号肽序列和先导内含子的5′侧翼序列和包括剪接位点和内含子序列的3′侧翼序列的寡核苷酸并如上退火。生成的VH和VL表达框作为HindIII-BamHI片段被克隆入质粒载体pUC19并确认完整的DNA序列。这些被转入表达载体pSVgpt和pSVhyg(Orlandi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86(1989)3833-3837)，所述载体分别包括人类IgG1或人类κ恒定区和哺乳动物中用于选择的标记。
用于抗体表达的宿主细胞系是NS0，一种生成非免疫球蛋白的小鼠骨髓瘤，获自欧洲动物细胞培养物保藏中心(European Collection of AnimalCell Cultures)，Porton，UK(ECACC编号85110503)。重链和轻链表达载体通过电穿孔被共转移入NS0细胞。表达gpt基因的克隆在添加了10％胎牛血清、0.8μg/ml麦考酚酸和250μg/ml黄嘌呤的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)中被选择。通过针对人类IgG的ELISA筛选用于生成人类抗体的转染的细胞克隆。使用Prosep-A(Millipore，Watford，UK)纯化抗体并通过针对人类IgGκ(Pharmacia Biotech，St Albans，UK)的ELISA测定浓度。纯化的Remicade、Herceptin和GLH抗体在两个测定中被测试结合，一个在标准ELISA中使用人源化的人类TNFα(在WO 03/042247 A2中描述)，另一个使用由4D5所描述的HER2+人类乳腺肿瘤细胞系SK-BR-3的增殖的抑制(Hudziak等人，Mol.Cell.Biol.，(March 1989)p1165-1172)。Remicade抗体表明了预期的在ELISA测定中与人类TNFα的结合但没有SK-BR-3的抑制。Herceptin没有结合人类TNFα而同时表现了SK-BR-3细胞增殖的抑制。GLH抗体既没有显示与人类TNFα的结合也没有显示SK-BR-3细胞的抑制。
实施例2.缺乏小鼠免疫球蛋白表达的人类HLA转基因小鼠。
缺乏小鼠II类MHC的人类HLA-DR1转基因小鼠(Altmann，D.M.等人，J Exp Med 181(1995)867-875)获自Imperial College，London UK。这些小鼠与获自Babraham Institute，Cambridge UK的缺乏免疫球蛋白重链(CΔ-/-)的小鼠杂交(Bruggeman，EP0438474B 1)并选择具有想要的人类HLA-DR1+/+、小鼠II-/-类MHC和小鼠IgCΔ-/-基因型的小鼠(下文“huDR+/IgCΔ-/-小鼠”)。这些hu DR+/IgCΔ-/-小鼠然后与缺乏免疫球蛋白轻链的小鼠(λ/κ-/-，Babraham Institute)进一步杂交并选择具有想要的人类HLA-DR1+/+、小鼠II-/-类MHC、小鼠Ig CΔ-/-和小鼠λ/κ-/-基因型的小鼠(下文“hu DR+/IgCΔ-/-λ/κ-小鼠”)。
实施例3.新生期耐受的诱导。
Remicade、Herceptin和GLH抗体在PBS中被透析并稀释至500μg/ml并在4℃下20,000g离心15分钟。50μl单个抗体的耐受化剂量被腹膜内注射入出生30小时内(＝第0天)的新生的hu DR+/IgCΔ-/-小鼠。对照小鼠被注射50μl PBS。然后5μg剂量的Remicade、Herceptin和GLH抗体与5μg KLH对照一起在总200MPL+TDM乳剂(RAS-Ribi佐剂，产品代码R-700，Corixa Corp，Hamilton，MT，USA)中在第10、16和24天被皮下注射。在第32天，小鼠被处死用于T细胞增殖测定。红细胞清除的Ficoll-纯化的脾细胞被制备并以5×106细胞与抗体或KLH脉冲的γ-辐射的LPS-胚细胞一起培养于T25摇瓶中，如Loirat，D.等人，J Immunol.，165(2000)4748-4755所描述的。在培养7天后，细胞以5×106细胞/孔和抗体或KLH脉冲的辐射的LPS-胚细胞一起铺板于平底96孔微量培养板中并在完全RPMI+3％FCS中培养另外72小时。使用1μCi/孔的3H-胸腺嘧啶脉冲细胞最后16小时并使用TOMTEC收集器(PE Applied Biosystems，Warrington，UK)收集至滤纸上。在微差频计数器(PE Applied Biosystems)上测定放射活性并且结果表示为关于抗体或KLH治疗vs PBS对照的cpm的刺激指数(SI)。
这些结果显示对于使用Remicade、Herceptin和GLH抗体耐受化并然后分别用相同抗体佐剂攻击的动物无显著性SI＞2。然而，10只被纯化的多克隆人类IgGT(huIgG)耐受化并然后用Remicade抗体攻击的动物有5只被观察到T细胞应答(SI＞2)。相反，用GLH攻击后的10只huIgG耐受小鼠中只有1只检测到了应答(SI＞2)，而对于用Herceptin耐受化的动物在用GLH攻击后没有检测到应答(SI＞2)。分别耐受huIgG或GLH的10只小鼠中有3或1只中，Herceptin诱导了应答。所有小鼠对佐剂中的KLH强烈应答，导致90％的小鼠中强烈的KLH特异性应答。这些结果说明了在huDR+/IgCΔ-/-小鼠中对单个Remicade、Herceptin和和GLH抗体的新生期耐受的成功诱导，以致使用相同抗体的攻击没能诱导T细胞增殖反应。
这些结果说明在耐受huIgG的小鼠中诱导了对免疫原性Remicade抗体的显著的T细胞应答。Herceptin(30％应答率)表现为比Remicade(50％应答率)小的免疫原性，而GLH没能在huIgG或Herceptin耐受小鼠中诱导应答。该实施例描述了本发明在使用人类HLA-DR转基因小鼠中的主要部分，所述转基因小鼠被赋予与人类对人类免疫球蛋白的耐受相当的对特定免疫球蛋白的耐受性。然后这种转基因小鼠能够被用来测试各种单克隆抗体在对特定免疫球蛋白耐受化的转基因的人类HLA-DR小鼠中对免疫原性的诱导，作为在人类中测试这种抗体的替代。该实施例显示，在人类中具有显著免疫原性的Remicade抗体在这种转基因的耐受化的人类HLA-DR小鼠中诱导了显著的免疫原性。在其他后续实验中，人类球蛋白制剂被用来如实施例3中耐受化hu DR+/IgCΔ-/-小鼠并然后这些小鼠用Remicade、Herceptin和GLH抗体攻击。结果显示，由于具有对单个抗体的耐受性，Remicade注射在＞30％的小鼠中导致SI＞2，而Herceptin和GLH在任何动物中显示没有SI＞2。
实施例4.人类Ig转基因小鼠的生成转人类IgM/κ基因的小鼠(四特征小鼠，Nicolson等人，J Immunol.，163(1999)6898-6906)与hu DR+/IgCΔ-/-λκ-小鼠(实施例2)杂交并选择具有想要的人类IgM/κ、人类HLA-DR1+/+、小鼠II-/-类MHC、小鼠IgCΔ-/-和小鼠λ/κ-/-基因型的小鼠(下文“hu IgCΔ-/-κ小鼠”)。
实施例5.人类Ig转基因小鼠中的免疫原性的测试使用与针对VH的D1.7/J4和针对Vκ的Jκ4结合的人类VH1-2和Vκ4.1种系基因生成用于在hu IgM/κ小鼠中的免疫原性测试的对照抗体(下文“VH1-2/Vκ4.1”抗体)。如实施例1中生成重组人类IgG1/κ抗体并且该抗体和来自实施例1的Remicade抗体都经受胃蛋白酶消化以生成用于注射的二聚Fab2片段。在消化之前，抗体在0.2M醋酸钠缓冲液(pH4.0)中透析并然后被调至2mg/ml。20μg/ml的胃蛋白酶(Sigma，Poole，Dorset UK)被加入等体积的0.2M醋酸钠缓冲液(pH4.0)并在37℃下保温6小时。加入2MTrizma基质(Sigma)以调节至pH7并且使用凝胶电泳来检查消化。抗体消化液在PBS中透析过夜并然后被应用至两个连续的Sephadex 75柱(Pharmacia)以分离Fab2片段。
使用CFA中的50μg VH1-2/Vκ4.1或Remicade Fab2片段免疫Hu IgM/κ小鼠并在4、8和12周各用IFA中的50ug Fab2片段加强免疫。通过使用PBS中的5μg/ml VH1-2/Vκ4.1、Remicade Fab2片段或全GLH抗体的对照(实施例1)涂布PVC微滴定板37℃过夜来测试人类IgM/κ抗体的生成。血清样品稀释于PBS，然后5％鸡血清和0.5％Tween-20于板孔中在室温下保持1小时，洗涤后，抗人类IgM Fc-HRP(Pharmacia)被加入同样的缓冲液持续1小时，随后加入ABTS(Sigma)持续30分钟并在OD415nm下检测。该实验证明了在用Remicade Fab2免疫的动物中诱导了强滴定度的特异性针对Remicade Fab2片段的IgM抗体但在用VH1-2/Vκ4.1 Fab2免疫的小鼠中没有诱导抗VH1-2/Vκ4.1抗体，因而说明了小鼠中具有人类免疫球蛋白/人类HLA-DR背景的Remicade的免疫原性。该实施例描述了在使用转人类HLA-DR和人类免疫球蛋白基因的小鼠中的本发明的主要部分，所述转基因小鼠具有与人类对一个范围的人类免疫球蛋白可变区序列的耐受性相当的对一个范围的免疫球蛋白可变区序列的耐受性。然后这种转基因小鼠能够被用来测试各种用于诱导免疫原性的单克隆抗体，作为在人类中测试这种抗体的替代。该实施例显示，Remicade抗体在这种转人类HLA-DR/Ig+基因的小鼠中诱导了显著的免疫原性，相当于在人类的发现，即针对Remicade的免疫原性在显著比例的免疫活性的患者中被诱导。
实施例6.人类Ig转基因小鼠中的抗体选择。
在PBS中的VH1-2/Vκ4.1和Remicade Fab2片段(来自实施例5)的100mg样品被静脉内共注射或单独注射入hu IgM/κ小鼠。在初始剂量后10天和20天后进行重复注射。最后剂量后2小时，分析小鼠血清中VH1-2/Vκ4.1或Remicade Fab2片段的存在或不存在。收集的血清在4℃下20,000g离心15分钟然后在PBS中透析过夜。然后Fab2片段如实施例5所述使用Sephadex 75纯化并作为稀释组如实施例1所述使用抗人类Fab-HRP(Pharmacia)检测与人类TNFα的结合。结果显示，对于用VH1-2/Vκ4.1和Remicade Fab2片段共注射的小鼠，回收的Fab2在所有受试小鼠中＞95％的组成为VH1-2/Vκ4.1。这些结果表明，与较小免疫原性的VH1-2/Vκ4.1相比，更大免疫原性的Remicade Fab2片段已经从血液系统中被清除。该效果可能是由于具有Remicade Fab2片段的免疫复合体的形成，其促进比VH1-2/Vκ4.1更快速的清除。该实施例描述了被耐受化的HLA-tg从具有其他诱导显著免疫原性的抗体的混合物中选择具有低免疫原性的抗体的能力。
权利要求
1.一种用于测试从哺乳动物抗原衍生的变异抗原在所述哺乳动物II类MHC分子的转基因非人类哺乳动物中的免疫原性的方法，其中所述非人类哺乳动物不是所述哺乳动物抗原的来源，所述方法包括(a)通过与所述哺乳动物抗原的接触使所述转基因哺乳动物对所述哺乳动物抗原是耐受的；和(b)将所述转基因哺乳动物与所述变异抗原接触；和(c)检测所述变异抗原在所述转基因哺乳动物中的免疫原性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中与所述哺乳动物抗原的接触是通过一种或多种编码所述哺乳动物抗原的转基因导入所述转基因哺乳动物来实现的，其中所述一种或多种转基因的表达使所述转基因哺乳动物对与所述哺乳动物抗原的进一步接触是耐受的。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述抗原是可溶性蛋白质并且其中所述转基因哺乳动物与所述蛋白质接触以诱导耐受性并然后用所述蛋白质的一种或多种变体攻击。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述抗原是单克隆抗体并且其中所述转基因哺乳动物与可溶性单体抗体接触以诱导耐受性并然后用所述单克隆抗体的一种或多种变体攻击。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述抗原是哺乳动物的多克隆抗体制剂并且其中所述转基因哺乳动物与所述可溶性多克隆抗体接触以诱导耐受性并然后用一种或多种单克隆抗体攻击。
6.如权利要求3-5任一项所述的方法，其中所述蛋白质是以佐剂或者是不溶的或固定化的形式。
7.根据权利要求2所述的方法，其中所述抗原是非蛋白质分子并且其中所述转基因哺乳动物与所述非蛋白质分子接触以诱导耐受性并然后用所述非蛋白质分子的一种或多种变体攻击。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述变异的非蛋白质分子是以佐剂或者是不溶的或固定化的形式。
9.如权利要求1-8任一项所述的方法，其中所述非人类哺乳动物是啮齿类动物。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述啮齿类动物是小鼠并且所述哺乳动物的II类MHC分子是人类的，例如人类HLA-DR.转基因小鼠。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述转基因小鼠是与所述抗原接触不超过6周但优选地在出生后32小时内以诱导对所述抗原的耐受性的新生小鼠。
12.如权利要求9-11任一项所述的方法，其中所述哺乳动物抗原是人类抗原。
13.如权利要求9-11任一项所述的方法，其中所述哺乳动物抗原是非人类抗原。
14.根据权利要求10-13任一项所述的方法，其中所述转基因小鼠被修饰以删除表达所述抗原或所述抗原的变体的任何小鼠基因或致使其失活。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述转基因小鼠被修饰以删除小鼠免疫球蛋白重链和轻链基因或致使其失活，然后在用受试单克隆或多克隆抗体攻击并检测其免疫原性之前使所述小鼠对人类免疫球蛋白是耐受的。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述转基因小鼠被修饰以删除小鼠蛋白基因或致使其失活，并然后在用一种或多种变异的非小鼠蛋白质攻击和检测其免疫原性之前使所述小鼠对非小鼠蛋白是耐受的。
17.根据权利要求10所述的方法，其中所述转基因小鼠编码人类免疫球蛋白的重链和轻链并且其中所述转基因小鼠随后与一种或多种受试单克隆抗体或多克隆抗体接触。
18.根据权利要求10所述的方法，其中所述转基因小鼠编码一种或多种人类蛋白质并且其中所述转基因小鼠随后与一种或多种变异的人类蛋白质接触。
19.根据权利要求10所述的方法，其中所述转基因编码一种或多种人类蛋白质并且其中所述转基因小鼠随后与一种或多种变异的人类蛋白质接触。
20.根据权利要求10-17任一项所述的方法，其中使用来自所述转基因哺乳动物的血清来检测免疫原性以测试针对所述受试单克隆或多克隆抗体或受试蛋白质的抗体的诱导。
21.根据权利要求10-17任一项所述的方法，其中使用利用小鼠血液或组织样品作为小鼠T细胞来源的T细胞增殖或T细胞活化测定法来检测免疫原性。
22.根据权利要求10-17任一项所述的方法，其中人类免疫原性的检测是通过测试蛋白反应性T细胞的生成，例如通过特异性的肽-MHC复合体的结合；经由检测细胞因子的生成、增殖、细胞表面标志的表达、Ca2+流量、PCR或DNA指纹印迹的T或B细胞的测试；或测试特异性免疫反应性B或T细胞的出现。
23.一种用于测试从人类抗原衍生的变异抗原在人类HLA-DR转基因小鼠中的免疫原性的方法，所述方法包括；(a)通过与所述人类抗原的接触使所述转基因小鼠对所述人类抗原是耐受的；(b)将所述转基因小鼠与所述变异抗原接触；和(c)检测所述变异抗原在所述转基因小鼠中的免疫原性。
24.一种用于测试从非人类抗原衍生的变异抗原在人类HLA-DR转基因小鼠中的免疫原性的方法，所述方法包括(a)通过与所述非人类抗原的接触使所述转基因小鼠对所述非人类抗原是耐受的；(b)将所述转基因小鼠与所述变异的非人类抗原接触；和(c)检测所述变异的非人类抗原在所述转基因小鼠中的免疫原性。
25.如权利要求1-24任一项所述的方法在测试变异抗原文库免疫原性中的用途。
26.如权利要求25所述的用途，其中所述变异抗原是人类抗原。
27.如权利要求26所述的用途，其中所述人类抗原是蛋白质。
28.如权利要求25所述的用途，其中所述变异抗原是非人类抗原。
29.如权利要求28所述的用途，其中所述非人类抗原是蛋白质。
30.如权利要求27所述的用途，其中所述蛋白质是抗体或抗体片段文库。
31.一种用于在人类HLA-DR转基因小鼠中选择从人类抗原衍生的一种或多种变异抗原的方法，所述方法包括(a)通过与所述人类抗原的接触使所述转基因小鼠对所述人类抗原是耐受的；(b)将所述转基因小鼠与两种或多种变异人类抗原的混合物接触；和(c)通过所述转基因小鼠中不同水平的免疫原性直接从所述混合物中选择单个变异人类抗原。
32.如权利要求31所述的用途，其中所述变异人类抗原被直接选择，通过测试被诱导的针对注射的变异人类抗原混合物的抗体以测定针对单个变异人类抗原的所述被诱导的抗体或者通过使用被诱导的针对所述混合物的抗体预吸收所述变异人类抗原混合物。
33.如权利要求31所述的用途，其中所述注射的变异人类抗原被连接至颗粒并且所述颗粒被用来识别单个变体。
34.如权利要求31所述的用途，其中所述注射的变异人类抗原被连接至活细胞并且所述活细胞被用来识别单个变体。
35.如权利要求31-34所述的用途，其中所述一种或多种变异抗原衍生于非人类抗原。
36.如权利要求31-34所述的用途，其中所述一种或多种变异抗原衍生于抗体。
全文摘要
本发明提供了测试变异抗原的免疫原性的新颖方法。特别地，提供了基于使用转基因动物的方法，其中所述转基因动物被耐受化(tolerised)针对特定抗原和然后暴露于所述抗原的变体并测定免疫应答。在一个实施方案中，所述转基因动物是人类II类MHC分子的转基因小鼠并且变异抗体库的免疫原性被测试。
文档编号A01K67/027GK101060776SQ200580039918
公开日2007年10月24日 申请日期2005年11月23日 优先权日2004年11月23日
发明者马修·贝克 申请人:安迪拓普有限公司