专利名称：菊芋叶片开发的植物源杀菌剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及菊芋叶片开发的植物源杀菌剂及其制备方法，属于植物源农药技术领域，专用于菊芋叶片开发为植物源杀菌剂。
背景技术：
近年来，虽然化学农药的使用在防治病虫草害中占主导地位，但其弊端也越来越引起国际社会关注。大量使用化学农药，特别是高毒农药，使病菌害虫等产生抗药性，大量杀死病菌害虫天敌，造成人畜中毒，也增加了农业经济成本，破坏生态环境等等。
克服化学农药的种种缺点，以及无公害农产品的大规模生产，迫切需要低毒、低残留、无污染、环境和谐的新型农药。植物是生物活性化合物的天然宝库，含有多种抗菌、杀虫活性成分，研究植物源杀菌剂也已成为新型农药开发的热点。植物源农药具有对人畜和有益生物的安全性，对作物无药害，无残留、不污染环境，病原菌和害虫不易产生抗药性，且开发研究生产资源丰富等特点。目前通过菊科植物开发植物源杀菌剂也有一些研究，但大多集中于菊属等，对于向日葵属的研究鲜有报道。
菊芋是菊科(Compositae)向日葵属中能形成地下块茎的栽培种，又称洋生姜、洋姜、鬼子姜等，学名Helianthus tuberosus L。菊芋喜温暖，但耐寒；喜湿润，但耐旱；喜肥沃，但耐贫瘠，耐盐碱，在我国大多地区都有种植，也可在滨海盐土栽培开用海水灌溉。菊芋的地上茎叶和地下块茎都是优良的饲料，地下块茎含丰富菊糖，可作蔬菜，也可以用于生产果糖糖浆和开发酒精，是未来的能源植物之一。菊芋因其具有良好的生物学特性以及经济价值，国内外对菊芋的研究工作主要集中在食品，饲料，栽培，生产果糖糖浆以及生态方面。而其能够经霜打和抵御多种病害，无须施用农药的特点易为人所忽视，因此国内外对其植株内成分抑制病原菌的研究至今仍是空白。本发明是在对菊芋叶片内化学物质抑菌活性研究的基础上，利用菊芋叶片中化学物质开发植物源杀菌剂，国内外尚属首例。
发明内容
技术问题本研究的目的在于提供了一种安全、有效、经济、无公害的天然植物源杀菌剂及其制备方法，同时充分开发利用菊芋这一植物资源。
技术方案1、菊芋叶片开发的植物源杀菌剂，其特征在于，该植物源杀菌剂是通过以下方法制备而成的(1)粉碎菊芋的新鲜叶片烘干，粉碎后过40目筛，获得菊芋叶干粉；
(2)提取称量制备好的菊芋叶干粉，配以质量为5-10倍的石油醚、乙醚、乙酸乙酯或去离子水作为提取溶剂提取，提取混合液减压过滤后获得菊芋叶提取液；(3)浓缩、干燥、贮存将提取液真空蒸发溶剂浓缩，即得膏状提取物，放在干燥器内干燥后获得提取物干样，置于4℃冰箱保存；(4)称取提取物干样，用上述一种提取溶剂或几种提取溶剂溶解，即可配成所需浓度的植物源杀菌剂。
上述菊芋叶片开发的植物源杀菌剂的制备方法中提取方法包括室温振荡提取法、索氏提取法或间歇振荡提取法，其中室温振荡提取法为把装有菊芋叶干粉和提取溶剂的容器置于振荡器内振荡1-3天，进行振荡提取，获得提取混合液；索氏提取法为菊芋叶干粉用滤纸包扎好，装入索氏提取器中，加入提取溶剂，温度控制在溶剂的沸点±5℃提取，待提取器支管中流下的液体为无色时，即为获得的提取混合液；间歇振荡提取法为将菊芋叶干粉置于容器中，加入提取溶剂，室温下振荡提取4h后静置8h，重复4次，总提取时间为48h，获得提取混合液。
上述制备方法中最佳提取溶剂是乙酸乙酯。
有益效果本发明所提供的菊芋叶片开发的植物源杀菌剂及其制备方法与现有技术相比，具有如下优点和积极效果(1)以常见植物菊芋为原料，原料来源广，价格低廉，生产成本低，生产工艺简单，适合各种规模生产。
(2)抑菌综合防治效果好。实验证明，本药剂能防治真菌、细菌引起的植物病害，能防治水稻纹枯病、小麦白粉病等作物病害。
(3)生产中无环境污染，低残留，对作物无害，对人畜安全，是一种无公害植物源杀菌剂，可用于有机产品的生产。
(4)充分开发利用了菊芋这一植物资源。
图120mg/ml菊芋叶片乙酸乙酯提取物药剂处理24h对水稻纹枯菌的抑制作用图220mg/ml菊芋叶片乙酸乙酯提取物药剂处理36h对水稻纹枯菌的抑制作用图320mg/ml菊芋叶片乙酸乙酯提取物药剂处理48h对水稻纹枯菌的抑制作用图4菊芋叶片乙酸乙酯提取物药剂不同浓度处理24h对水稻纹枯菌的抑制作用图5菊芋叶片乙酸乙酯提取物药剂不同浓度处理36h对水稻纹枯菌的抑制作用图6菊芋叶片乙酸乙酯提取物药剂不同浓度处理48h对水稻纹枯菌的抑制作用具体实施方式
实施例1
供试菊芋(中国)，以菊芋叶片为原料，分别以石油醚、乙酸乙酯、乙醚或去离子水为提取溶剂，按照以上方法配成药剂实施如下(1)原料处理菊芋的新鲜叶片采于南京农业大学山东莱州863中试基地，然后置于电热恒温鼓风干燥箱中，控温在(40±1)℃烘干至发脆。用微型植物试样粉碎机粉碎，过40目筛，得到菊芋叶干粉，密封于塑料袋中备用。
(2)索氏提取法提取称量25g菊芋叶干粉，用滤纸包扎好，装入250ml索氏提取器中，加入200ml提取溶剂提取，温度控制在溶剂的沸点±5℃提取，待提取器支管中流下的液体为无色时，约3小时，即停止提取。所得提取混合液减压过滤后即获得菊芋叶片提取液。
(3)浓缩、干燥、贮存将提取液用旋转蒸发器真空浓缩，即得膏状提取物，放在干燥器内干燥后获得提取物干样，置于4℃冰箱保存备用。
各溶剂提取率的计算公式如下提取率(％)＝提取物干样质量(g)/菊芋叶干粉质量(g)×100％各溶剂索氏提取法对菊芋叶片的提取率参见表1，各溶剂索氏提取法对菊芋叶片的提取率差异明显。石油醚、乙醚、乙酸乙酯和水的提取率分别是1.6％、2.1％、3.5％和6.7％；水提取率最高，达到6.69％，石油醚提取率最低，只有1.56％。
实施例2供试菊芋(中国)，以菊芋叶片为原料，分别以石油醚、乙酸乙酯、乙醚或去离子水为提取溶剂，按照以上方法配成药剂实施如下(1)原料处理菊芋的新鲜叶片采于南京农业大学山东莱州863中试基地，然后置于电热恒温鼓风干燥箱中，控温在(40±1)℃烘干至发脆。用微型植物试样粉碎机粉碎，过40目筛，得到菊芋叶干粉，密封于塑料袋中备用。
(2)间歇振荡提取法提取称量10g菊芋叶干粉，装入250ml三角瓶中，加入100ml提取溶剂，置于振荡器内，室温下振荡提取4小时后静置8小时，重复4次，总提取时间为48小时。所得提取混合液减压过滤后即获得菊芋叶片提取液。
(3)浓缩、干燥、贮存将提取液用旋转蒸发器真空浓缩，即得膏状提取物，放在干燥器内干燥后获得提取物干样，置于4℃冰箱保存备用。
各溶剂提取率的计算公式如下提取率(％)＝提取物干样质量(g)/菊芋叶干粉质量(g)×100％各溶剂间歇振荡提取法对菊芋叶片的提取率参见表2，各溶剂间歇振荡提取法对菊芋叶片的提取率差异明显。石油醚、乙醚、乙酸乙酯和水的提取率分别是1.1％、1.5％、2.3％和1.6％；乙酸乙酯提取率最高，达到2.3％，石油醚提取率最低，只有1.1％。
实施例3室内抑菌实验采用生长速率法测定菊芋叶片开发的植物源杀菌剂对水稻纹枯菌生长量的抑制作用。在无菌条件下，取0.60g的制备的菊芋叶片乙醚提取物干样，加3ml乙醚溶解，加入到融化的27ml PDA(马铃薯葡萄糖琼胶)培养基中摇匀后，平均倒入三个灭菌培养皿中(d＝8.5cm)，即3个重复，菊芋叶片提取物干样在PDA中的浓度为20mg/ml，凝固后分别接入水稻纹枯菌菌株(代号NN1，拉丁学名Rhizoctonia solani Kühn，由南京农业大学植物病理学专业分离，本实验室保存)。以3ml乙醚溶剂加入到培养基中作为对照。接入的菌株25-27℃培养，分别在接入菌株后24h、36h和48h观察测量。每个菌落按十字交叉法测量直径两次，以其平均值代表菌落的大小。抑菌率的计算公式如下校正直径(cm)＝菌落平均直径(cm)-菌饼直径(0.5cm)抑菌率(％)＝(对照校正直径-处理校正直径)/对照校正直径×100实验结果数据参见表3，药剂处理的水稻纹枯菌菌落直径显著小于对照，24h时对照水稻纹枯菌落校正直径为2cm，而乙醚提取物药剂处理的菌落校正直径为0.13cm，药剂抑菌率为93.75％；36h时对照水稻纹枯菌落校正直径为4.11cm，而乙醚提取物药剂处理的菌落校正直径为0.97cm，药剂抑菌率为76.47％；48h时对照水稻纹枯菌落校正直径为6.30cm，而乙醚提取物药剂处理的菌落校正直径为2.14cm，药剂抑菌率为66.01％。因此，在48h内药剂处理抑菌率均达到66％以上，药剂抑菌效果明显。
实施例4不同浓度药剂的室内抑菌实验采用平板二倍稀释法测定菊芋叶片开发的植物源杀菌剂不同浓度下对水稻纹枯菌生长量的抑制作用，从而确定其最低抑菌浓度(MIC)。在无菌条件下，称取菊芋叶片乙酸乙酯提取物干样2.4g，加12ml溶剂溶解后，提取物浓度为200mg/ml；取出其中6ml用灭菌水稀释一倍，则提取物浓度为100mg/ml，类似稀释方法配制成系列提取物浓度50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml、6.3mg/ml、3.1mg/ml、1.6mg/ml、0.8mg/ml、0.4mg/ml、0.2mg/ml的药液。分别取各浓度药液6ml加入到融化的24ml PDA培养基中摇匀后，平均倒入三个灭菌培养皿中(d＝8.5cm)，即3个重复，由此制备含有系列提取物浓度的PDA培养基平板，浓度分别为40mg/ml、20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.63mg/ml、0.31mg/ml、0.16mg/ml、0.08mg/ml、0.04mg/ml，待平板凝固后分别接入水稻纹枯菌菌株(代号NN1，拉丁学名Rhizoctoniasolani Kühn，由南京农业大学植物病理学专业分离，本实验室保存)。以加入相应量济剂的培养基作为对照。接入的菌株25-27℃培养，分别在接入菌株后24h、36h和48h观察测量。每个菌落按十字交叉法测量直径两次，以其平均值代表菌落的大小。抑菌率的计算公式如下校正直径(cm)＝菌落平均直径(cm)-菌饼直径(0.5cm)抑菌率(％)＝(对照校正直径-处理校正直径)/对照校正直径×100
实验结果数据参见表4，20mg/ml的菊芋叶片乙酸乙酯提取物浓度处理对水稻纹枯菌的抑制率在48h内均在80％以上，40mg/ml的浓度处理抑菌率在48h内均为100％，而0.04mg/ml的浓度处理已几乎没有抑制作用，所以乙酸乙酯提取物药剂处理最低抑菌浓度是40mg/ml。图1、图2和图3直观地显示20mg/ml乙酸乙酯提取物药剂的试验结果，图中上行为处理，下行为对照。图4、图5和图6，图中PDA培养基中提取物浓度，下行开始由左至右分别是0、1.25、2.5、5、10、20mg/ml，最右为40mg/ml。
实施例5大田作物抑菌试验试验设在江苏省农科院小麦试验田内，试验小区栽培条件均匀一致，小麦长势基本一致，自然感染小麦白粉病。设药剂浓度20倍和40倍，和空白对照共3个处理，3次重复，小区面积2m2。药剂浓度的均采用菊芋叶片乙酸乙酯提取物干样质量进行计算，换算方法如下20倍＝50mg/ml，40倍＝25mg/ml。试验于2006年4月26日进行；采用工农-16型背负手动式喷雾器进行低容量喷雾，药液均匀喷施在小麦植株上。
调查分三次，药前(4月25日)、施药后2天(4月28日)和9天(5月5日)，在各小区内，采取两点取样，每点查0.2m2的植株，调查每株的旗叶及旗叶下第一片叶的发病程度，计算病情指数和防效。
小麦白粉病叶片病情分级标准为0级叶无病斑；1级病斑面积占全叶面积的5％以下；3级病斑面积占全叶面积的6％～15％；5级病斑面积占全叶面积的16％～25％；7级病斑面积占全叶面积的26％～50％；9级病斑面积占全叶面积的50％以上。
病情指数和防治效果的计算公式如下病情指数(％)＝∑(各级病叶数×发病级数)/(调查总叶数×9)×100防治效果(％)＝[1-CK0×Pt1/(CK1×Pt0)]×100上述公式中，CK0空白对照区施药前病情指数；CK1空白对照区施药后病情指数；Pt0药剂处理区施药前病情指数；Pt1药剂处理区施药后病情指数。
通过试验观察和数据统计(表5)，发现药后两天和9天，各药剂处理病情指数与对照相比均有显著差异，20倍药后两天和9天病情指数分别为32.2％和20.4％，而对照病情指数分别为56.9％和38.7％，防效分别为42.6％和68.3％；各药剂处理间也存在明显的差异，20倍和40倍药剂处理9天防效分别为68.％和41.9％。从整体试验效果看，高浓度药剂处理对小麦白粉病田间防治效果较为理想。
表1各溶剂索氏提取法对菊芋叶片的提取率
表2各溶剂间歇振荡提取法对菊芋叶片的提取率
表320mg/ml菊芋叶片乙醚提取物药剂对水稻纹枯菌的抑制效果
表4不同浓度菊芋叶片乙酸乙酯提取物药剂对水稻纹枯菌的抑制效果
表5菊芋叶片乙酸乙酯提取物药剂对小麦白粉病田间实验效果
权利要求
1.菊芋叶片开发的植物源杀菌剂，其特征在于，该植物源杀菌剂是通过以下方法制备而成的(1)粉碎菊芋的新鲜叶片烘干，粉碎后过40目筛，获得菊芋叶干粉；(2)提取称量制备好的菊芋叶干粉，配以质量为5-10倍的石油醚、乙醚、乙酸乙酯或去离子水作为提取溶剂提取，所得提取混合液减压过滤后获得菊芋叶提取液；(3)浓缩、干燥、贮存将提取液真空蒸发溶剂浓缩，即得膏状提取物，放在干燥器内干燥后获得提取物干样，置于4℃冰箱保存；(4)称取提取物干样，用上述一种提取溶剂或几种提取溶剂溶解，即可配成所需浓度的植物源杀菌剂。
2.根据权利要求1所述菊芋叶片开发的植物源杀菌剂，其特征在于，制备方法中提取方法包括室温振荡提取法、索氏提取法或间歇振荡提取法，其中室温振荡提取法为把装有菊芋叶干粉和提取溶剂的容器置于振荡器内室温振荡1-3天，进行振荡提取，获得提取混合液；索氏提取法为菊芋叶干粉用滤纸包扎好，装入索氏提取器中，加入提取溶剂，温度控制在溶剂的沸点±5℃提取，待提取器支管中流下的液体为无色时，即获得提取混合液；间歇振荡提取法为把装有菊芋叶干粉和提取溶剂的容器置于振荡器内，室温下振荡提取4h后静置8h，重复4次，总提取时间为48h，获得提取混合液。
3.根据权利要求1或2所述菊芋叶片开发的植物源杀菌剂，其特征在于，制备方法中最佳提取溶剂是乙酸乙酯。
全文摘要
本发明提供了一种以菊芋叶片开发的植物源杀菌剂，以菊芋叶片为原料，粉碎烘干获得菊芋叶干粉，配以质量为5－10倍的石油醚、乙醚、乙酸乙酯或去离子水作为提取溶剂提取，减压过滤、浓缩、干燥获得提取物干样，再用提取溶剂溶解，即可配成所需浓度的植物源杀菌剂。本发明原料来源广，生产成本低，抑菌综合防治效果好，生产中无环境污染，低残留，对作物无害，对人畜安全，是一种无公害植物源杀菌剂。
文档编号A01P3/00GK1883276SQ20061008964
公开日2006年12月27日 申请日期2006年7月7日 优先权日2006年7月7日
发明者刘兆普, 刘海伟, 隆小华, 刘玲 申请人:南京农业大学