动物用饲料添加剂的制作方法

专利名称：动物用饲料添加剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有具生产酸性酶能力的曲霉属菌的动物用饲料添加剂。

背景技术：
家畜或宠物(以下称为动物)等的饲料虽然进行了粉碎等加工，但通常并不进行加热处理等，因此有消化吸收率低、饲料效率差的问题。另外，最近，已知作为人类疾病的溃疡性结肠炎或克隆氏病等炎症性肠道障碍在动物中也有报道，引起痢疾等症状。已知上述炎症性肠道疾病使饲料吸收低下或妨碍健康的健康育肥。引起动物肠道感染症的病原菌已知有病原性大肠杆菌、沙门氏菌属细菌、梭状芽孢杆菌属细菌、弯曲杆菌属细菌等。上述病原菌异常繁殖，则生产毒素(肠毒素、细胞毒素)，在肠道黏膜上引起障碍，引起稀便或严重的痢疾等。另外，球虫(コクシジウム)是寄生于鸡、猪、牛等的肠道内的原生动物(原虫)，感染后引起痢疾、食欲不振等。预防/治疗上述炎症性肠道疾病是使用抗生素，但会出现抗药性菌的问题。
近年来，为了改善肠内菌群平衡、抑制肠内病原菌的增殖，使用益生菌的技术受到人们的关注(专利文献1、专利文献2)。但是，乳酸菌或双歧杆菌大多在0.3％脱氧胆酸的浓度下死亡，或在pH4或以下死亡，除了总称为大肠菌群的细菌之外，胆汁酸中，在对于微生物具有强的抗菌性的脱氧胆酸存在下无法生存的菌种还有很多。因此，人们需求在动物的消化道内不会死亡、给宿主带来有利效果的菌种。
另一方面，有报道指出在动物用饲料的加工阶段，用酶或者产酶菌进行处理、进行一定程度的分解，由此可以减轻动物的胃肠负担，该技术可用于消化系统疾病的预防或改善(专利文献3)。还已知有使用曲霉使鱼粉在低水分下发酵，获得高浓度含有蛋白酶、脂酶等的鱼用鱼粉发酵饲料的方法(专利文献4)。但是，在上述技术中，在提高饲料中的水分含量进行饲料成分分解后，需要进行干燥、然后制成成品这样繁杂的步骤。并且，为成分分解而提高水分含量的饲料有容易产生腐败菌或霉菌等、难以保持品质的问题。
有人报道了通过将曲霉的孢子口服给予动物，使动物的粪便改质的方法，但是对于抑制在动物的肠内引起炎症等的有毒细菌的增殖、促进体重增加的用途并未进行研究，以在曲霉中生产酸性酶的形式给予动物也属未知(专利文献5)。
还有人报道在甲壳类的甲壳粉碎物中加入发酵营养源并混合，向其中接种曲霉属菌，使壳多糖或脱乙酰壳多糖分解，获得发酵物，给予动物(专利文献6)。该方法对动物的生长促进效果已得到部分确认，但对于其抑制动物肠内病原菌的增殖、预防并治疗肠道感染症并未进行研究，上述效果并未得到确认。
另一方面，有报道指出酱油曲霉、塔木里氏曲霉、米曲霉生产曲酸(非专利文献1)。还报道，曲酸对于气杆菌属(Aerobacter)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、芽孢杆菌属(Bacillus)、布鲁氏菌属(Brucella)、色杆菌属(Chromobacterium)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、双球菌属(Diplococcus)、埃伯泽氏菌属(Eberthella)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、钩端螺旋体属(Leptospira)、微球菌属(Micrococcus)、奈色氏球菌属(Neisseria)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、变形菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、八叠球菌属(Sarcina)、志贺氏菌属(Shigella)、沙雷氏菌属(Serratia)、螺菌属(Spirillum)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、弧菌属(Vibrio)具有抗菌活性(非专利文献2)。但是，给予了曲酸的小鼠中可见肝细胞肿瘤的发生，在大鼠中也显示曲酸的肝发癌性的可能性。另外，对于是否有遗传毒性也未明确，无法否定具有遗传毒性的可能性。即，对于饲料中含有曲酸必须小心。
专利文献1日本特表2005-507670号公报
专利文献2日本特表2004-523241号公报
专利文献3日本特开2004-141147号公报
专利文献4日本特表平6-319464号公报
专利文献5日本特开平11-171674号公报
专利文献6日本特开2002-238466号公报
非专利文献1George A，Burdock，Madhusudan G.Soni，和Iona G.Carabin(2001)Regulatory Toxicology and Pharmacology 33，80-101
非专利文献2Harry E.Morton，Walter Kocholaty，RenateJunowicz-Kocholaty，和Albert Kelner(1945)J.Bacteriol 50，579-584

发明内容
本发明的课题在于提供辅助动物的消化活动、提高饲料效率的安全且简便的方法。具体来说，其课题在于提供利用可在动物的消化器官内增殖的菌，抑制动物肠内的病原菌或球虫的增殖，由此预防并治疗感染症，实现动物的体重增加的方法。
本发明人为解决上述课题进行了深入的研究，结果发现酱油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉和米曲霉的酸性酶、尤其是酸性淀粉酶的生产能力优异；这些菌具有对于引起肠道感染症的病原菌的抗菌活性以及对球虫的杀原生动物活性；以及它们可发挥益生菌功能。还发现在以糙米作为营养源进行培养，这些菌的酸性酶生产能力极为优异。将这些菌与由菌体生产的酸性酶组合，与饲料一起被动物摄取，可以促进消化，预防并改善肠道感染症，有助于动物的体重增加，从而完成了本发明。
即，本发明如下所述。
(1)动物用饲料添加剂，该动物用饲料添加剂含有选自酱油曲霉(Aspergillus sojae)、塔木里氏曲霉(Aspergillus tamarii)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、黑色曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)的至少一种菌，以及由这些菌生产的、含酸性酶的培养物。
(2)(1)的动物用饲料添加剂，其中，上述菌是酱油曲霉和/或米曲霉。
(3)(1)或(2)的动物用饲料添加剂，其中，上述米曲霉IK-05074株(FERM BP-10622)或者具有与其相同的生产酸性酶的能力的该菌株的突变株。
(4)(1)-(3)中任一项的动物用饲料添加剂，其中，上述酸性酶是酸性淀粉酶。
(5)(1)-(4)中任一项的动物用饲料添加剂，其特征在于上述菌对于引起动物肠道感染症的病原菌具有抗菌活性和/或具有针对球虫的杀原生动物活性。
(6)(1)-(5)中任一项的动物用饲料添加剂，其中，上述培养物含有植物性营养源。
(7)(6)的动物用饲料添加剂，其中，上述植物性营养源是糙米。
(8)饲料，该饲料含有(1)-(7)中任一项的动物用饲料添加剂。
(9)饲料的制备方法，其特征在于在含有使菌增殖的营养源的固体培养基中培养选自酱油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉、米曲霉的至少一种菌，使饲料中含有所得培养物。
实施发明的最佳方式 本发明的动物用饲料添加剂中含有的酱油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉、米曲霉是在该技术领域中通过在曲霉种鉴定中常用的方法进行分类时分别分类为上述种的菌。菌种的鉴定例如可参照“H.Murakami，The Journal of General and Applied Microbiology，17，281-309页，(1971)”、“村上英也，日本酿造协会杂志，第74卷，第12号，849-853页，(1979)”、Nikkuni，S.，et al，The Journal of General andApplied Microbiology，44，225-230页，(1998)等。
酱油曲霉是在土壤、曲等中发现的丝状半知菌类的一种，是用于酱油、酱的酿造的菌。本发明的动物用饲料添加剂中，只要是具有生产以下详述的酸性酶中的至少一种、优选酸性淀粉酶的能力，且在使动物摄食方面为安全的即可，没有特别限制，均可使用。本发明的动物用饲料添加剂可以使用市售的菌株，上述菌可优选使用酱油曲霉AOK210株(株式会社秋田今野商店)。
塔木里氏曲霉是在土壤、曲、食品等中发现的丝状半知菌类的一种，是用于酱油、酱的酿造的菌。本发明的动物用饲料添加剂中，只要是具有生产以下详述的酸性酶中的至少一种、优选酸性淀粉酶的能力，且在使动物摄食方面为安全的即可，没有特别限制，均可使用。本发明的动物用饲料添加剂可以使用市售的菌株，上述菌可优选使用塔木里氏曲霉AOK43株(株式会社秋田今野商店)。
臭曲霉是在土壤、曲、谷物壳等中发现的丝状半知菌类的一种，是用于酒、酱、酱油的酿造的菌。本发明的动物用饲料添加剂中，只要是具有生产以下详述的酸性酶中的至少一种、优选酸性淀粉酶的能力，且在使动物摄食方面为安全的即可，没有特别限制，均可使用。本发明的动物用饲料添加剂可以使用市售的菌株，上述菌可优选使用臭曲霉AOK N4586株(株式会社秋田今野商店)。
黑色曲霉是在土壤、曲、谷物壳等中发现的丝状半知菌类的一种，是在造酒、食品加工、制糖、或制药等各种情况下使用的菌。本发明的动物用饲料添加剂中，只要是具有生产以下详述的酸性酶中的至少一种、优选酸性淀粉酶的能力，且在使动物摄食方面为安全的即可，没有特别限制，均可使用。本发明的动物用饲料添加剂可以使用市售的菌株，上述菌可优选使用黑色曲霉AOK B650株(株式会社秋田今野商店)。
还可以使用AOK210株、AOK43株、AOK N4586株或AOK B650株的突变株。突变株可以是这些菌株自然变异，也可以是通过化学突变剂或紫外线等进行突变处理得到菌株，从该菌株中选择分别与AOK210株、AOK43株、AOK N4586株或AOK B650株同样具有生产酸性酶能力的菌株。除生产酸性酶的能力之外，也优选使用与上述菌株同样地进一步具有抗菌活性、杀原生动物活性、胆汁酸耐性、耐酸性的至少一种的上述菌株的突变株。进一步优选使用上述以外的微生物学性质也与上述AOK210株、AOK43株、AOK N4586株或AOK B650株同样的突变株。
米曲霉是在土壤、曲等中发现的丝状半知菌类的一种，是用于酱油、酱的酿造的菌。本发明的动物用饲料添加剂中，只要是具有生产以下详述的酸性酶中的至少一种、优选酸性淀粉酶的能力，且在使动物摄食方面为安全的即可，没有特别限制，均可使用。本发明的动物用饲料添加剂可以使用市售的菌株，上述菌可优选使用米曲霉IK-05074株。IK-05074株是由各种发酵食品中分离的菌株，于2006年2月15日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，保藏号FERMP-20798，于2006年6月20日根据布达佩斯条约转移为国际保藏，保藏号为FERM BP-10622。
IK-05074株的微生物学性质如下。
(1)菌落的性状(察氏(Czapek-Dox)琼脂培养基(在25℃下培养7天)) 大小为直径50-60mm，颜色由黄变化为绿、随着时间为褐色。菌丝体不明显，背面无色。
(2)形态 分生孢子梗薄壁-厚壁，滑面-稍有粗面，直径为20μm或以下，长度为2mm或以下，顶囊为直径40-50μm、80μm或以下的球形。
初生小埂在大的分生孢子梗上均存在，长度12μm或以下。
次生小梗瓶状，长度8-12μm，具有短颈部。
分生孢子直径5-6μm的球形，颜色由黄至绿，表面为滑面-微粗面。
以上推定IK-05074株属于米曲霉。
本发明的动物用饲料添加剂中，可以使用IK-05074株的突变株。IK-05074株的突变株可以从使IK-05074株自然变异、或进行化学突变剂或紫外线等突变处理得到的菌株中筛选与IK-05074菌株具有相同生产酸性酶能力的菌株。除生产酸性酶的能力之外，优选使用与IK-05074株同样进一步具有至少一种抗菌活性、杀原生动物活性、胆汁酸耐性、耐酸性的IK-05074株的突变株。进一步优选使用除上述以外的微生物学性质也与IK-05074株同样的突变株。
本发明的动物用饲料添加剂中，例如可以在从土壤、曲、食品、谷物壳等中分离的酱油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉、米曲霉中分离具有酸性酶生产能力的菌株使用。
生产酸性酶的能力是指生产酸性酶，其程度为可在培养菌体得到的培养物中检测出酸性酶活性的程度。培养物的酸性酶活性的检测可按照常规方法进行。例如可按照日本国税厅所定分析法(改正第3回税厅训令第1号)的固体曲的分析方法——葡糖淀粉酶活性测定法、α-淀粉酶活性测定法、耐酸性α-淀粉酶活性测定法、酸性蛋白酶活性测定法和酸性羧基肽酶活性测定法测定。
本发明中使用的酱油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉、米曲霉优选对于引发动物肠道感染症的病原菌具有抗菌活性。
上述病原菌通常属于肠杆菌科。属于革兰氏阴性细菌的病原菌有属于病原性大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌属(Salmonella)和弯曲杆菌属(Campylobacter)的细菌。属于革兰氏阳性细菌的病原菌有属于梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、利斯特氏菌属(Listeria)，葡萄球菌属(Staphylococcus)和链球菌属(Streptococcus)。
病原性大肠杆菌例如有肠侵袭性大肠杆菌(Enteroinvasive E.coli)(EIEC)、产毒性大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli)(ETEC)、肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic E.coli)(EPEC)、产志贺毒素大肠杆菌(Shigatoxin producing E.coli)(STEC)和肠聚集性大肠杆菌(EnteroaggregativeE.coli)(EAEC)等。属于沙门氏菌属的细菌有雏白痢沙门氏菌(S.pullorum)、鸡沙门氏菌(S.gallinarum)、伤寒沙门氏菌(S.typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)、猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis)、德彼沙门氏菌(S.derby)和都柏林沙门氏菌(S.dublin)。属于弯曲杆菌属的细菌有空肠弯曲杆菌(C.jejuni)、大肠弯曲杆菌(C.coli)、胎儿弯曲杆菌(C.fetus)、胎儿弯曲杆菌肠亚种(C.fetussubsp.Intestinalis)等。
属于梭状芽孢杆菌属的细菌有产气荚膜梭状芽孢杆菌(C.perfringens)、肉毒梭状芽孢杆菌(C.botulinum)、难辨梭状芽孢杆菌(C.difficile)等。属于芽孢杆菌属的细菌有蜡状芽孢杆菌(B.cereus)等。属于利斯特氏菌属的细菌有单核细胞增生利斯特氏菌(L.monocytogenes)等。属于葡萄球菌属的细菌有金黄色葡萄球菌(S.aureus)等。属于链球菌属的细菌有猪链球菌(S.suis)、化脓链球菌(S.pyogenes)等。本发明的动物用饲料添加剂中含有的上述曲霉属菌特别对于沙门氏菌属细菌中的肠炎沙门氏菌、梭状芽孢杆菌属细菌中的产气荚膜梭状芽孢杆菌、水肿病菌等大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有高的抗菌活性。
对病原菌具有抗菌活性是指与病原菌一起接种于相同的培养基上时，具有抑制病原菌增殖的能力。具有抗菌活性的酱油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉、米曲霉例如可如下获得将土壤、曲等分离源添加到接种了肠炎沙门氏菌(SE)、产气荚膜梭状芽孢杆菌(CP)、大肠杆菌(EC)、金黄色葡萄球菌(SA)等病原菌的琼脂培养基中，进行培养，然后分离形成抑菌圈的菌体。这样得到的菌具有上述抑制上述病原菌增殖的能力，因此通过给予动物可以预防并治疗动物的肠道感染症。
使引起动物肠道感染症的病原菌的增殖得到抑制，这可通过例如测定动物盲肠内容物或粪便中病原菌的菌体浓度(活菌数)等确认。
本发明中使用的酱油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉、米曲霉优选具有针对引起动物肠道感染症的球虫的杀原生动物活性。
球虫是指属于孢子虫类(孢子虫(Sporozoasida)亚纲)的原生动物。具体有艾美耳球虫属(Eimeria)、等孢球虫属(Isospora)、弓形虫属(Toxoplasma)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)等。属于艾美耳球虫属的原生动物有柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)、堆型艾美耳球虫(E.acervulina)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)、和缓艾美耳球虫((E.mitis)、邱氏艾美耳球虫(E.zuernii)、牛艾美耳球虫(E.bovis)等。属于等孢球虫属的袁虫有猪等孢球虫(I.Suis)、贝氏等孢球虫(I.Belli)、人等孢球虫(I.Hominis)等。属于弓形虫属的原生动物有刚地弓形虫(T.gondii)等。属于隐孢子虫属的原生动物有微小隐孢子虫(C.parvum)等。本发明的动物用饲料添加剂特别对于柔嫩艾美耳球虫、邱氏艾美耳球虫的感染症适用。
具有针对球虫的杀原生动物活性是指在使球虫的卵囊与菌体的培养物共存时，具有抑制卵囊的出芽、繁殖，优选减少卵囊的能力。具体来说，是指具有使卵囊的细胞壁变形、溶解，使卵囊崩解的能力。崩解或细胞壁的状态可使用显微镜观察。
具有针对球虫的杀原生动物活性的酱油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉、米曲霉例如可通过以下方法获得。将土壤、曲等分离源加入到培养皿中，该培养皿中加入了使柔嫩艾美耳球虫或邱氏艾美耳球虫的卵囊悬浮的无菌水，在37℃下进行培养，进行1-7天的观察。从可见卵囊的变形或溶解的培养皿中分离菌体，将其再次加入到培养皿中，该培养皿中加入了使柔嫩艾美耳球虫或邱氏艾美耳球虫的卵囊悬浮的无菌水，在37℃下进行培养，确认卵囊的变形或溶解。这样，对在培养皿中含有的菌体进行培养，分别选择具有酱油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉、米曲霉的微生物学性质的菌体，由此可以获得本发明中使用的曲霉属菌。这样得到的菌体给予动物，由此可以预防、治疗动物的肠道球虫感染症。
给予上述曲霉属菌是否可使球虫的增殖受到抑制，这可以通过例如在显微镜下观察动物的盲肠内容物或粪便中的球虫卵囊来确认。
本发明的动物用饲料添加剂中含有的酱油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉、米曲霉优选对于胃酸或胆汁酸具有耐性。由此，在动物的肠道内，菌体也可以生产有用的酸性酶，使酸性酶的消化辅助功能持续。另外，这些曲霉属菌具有对上述病原菌的抗菌活性时，可以抑制引起动物肠道感染症的病原菌的增殖，有助于改善肠内菌群的平衡。对于胃酸或胆汁酸具有耐性是指在通常的消化器官内的条件下菌体不会死亡，可以达到肠道内。通常，人或动物的胃内部在空腹时pH达到2或更低，在摄取食物的状态下，胃内部的pH在3.5-6的范围，比空腹时高。因此，可在本发明的饲料添加剂中使用的具有耐酸性的菌株例如在pH3.5对分离源处理2小时左右时，可以通过筛选具有存活能力的菌株来获得。并且，通过将这样筛选的菌体在10g/L脱氧胆酸浓度的存在下处理24小时左右，筛选仍具有存活能力的菌株，可以获得适合用于本发明的饲料添加剂的、对于胃酸或胆汁酸具有耐性的菌株。另外，菌体不死亡地到达肠道，这可例如可以通过测定动物排泄物中的菌体浓度等来确认。
本发明的动物用饲料添加剂可以在上述菌种中单独含有一种菌株，也可以将两种或以上菌株组合含有。其中，优选含有酱油曲霉或米曲霉的至少一种。
本发明的动物用饲料添加剂中含有的酱油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉、米曲霉的菌体浓度只要是在将饲料添加剂给予动物时菌体在消化器官内不会死亡的范围即可，通常，只要是为了制备具有酸性酶活性的饲料添加剂，培养适当浓度的菌体，适当调节饲料添加剂中酸性酶活性即可。
本发明的动物用饲料添加剂中含有的酸性酶优选为上述菌体所生产的消化酶，只要在胃肠内酸性条件下不失活、具有活性即可，没有特别限定，其中最佳pH为2.5-5.5。例如可以是酸性的α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、高峰淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、核糖核酸酶、核酸酶、木聚糖酶、果胶酶、脂酶等，本发明的动物用饲料添加剂含有其中的一种或多种。其中特别优选含有分解家畜的饲料成分中主要成分之一的淀粉的酸性淀粉酶。本发明的动物用饲料添加剂中含有的酸性淀粉酶只要是水解淀粉的酸性酶即可，没有特别限定，例如有α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶等。其中可优选pH在最佳的3附近的耐酸性α-淀粉酶。
本发明的动物用饲料添加剂可以含有酱油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉、米曲霉所生产的酸性酶的至少一种，可进一步含有来自其它菌种或其它生物种的酶。
本发明的动物用饲料添加剂中的酸性酶的含量可根据动物的种类、体重等适当调节。通常，按照日本国税厅所定分析法(改正第3回税厅训令第1号)的固体曲的分析方法测定酸性酶的活性时，1g动物用饲料添加剂中的酸性酶活性总和优选为12,000U或以上，进一步优选20,000U或以上。特别是1g动物用饲料添加剂中的酸性淀粉酶活性优选为100U或以上，进一步优选300U或以上。另外，酸性蛋白酶活性和酸性羧基肽酶活性的总和优选为10,000U或以上，进一步优选15,000U或以上。
本发明的动物用饲料添加剂可以通过培养上述酱油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉、米曲霉中的至少一种菌、生产酸性酶获得。本发明的动物用饲料添加剂中使用的酱油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉、米曲霉在通过在通常的培养条件下培养，由此生产酸性酶。例如培养温度可在25℃-40℃下进行，通常优选在28℃-32℃下培养。培养方法可以采用往复式振荡培养、小型发酵罐培养等液体培养法或固体培养法，在上述菌体所具有的酸性酶生产基因中也存在只在固体培养基中表达的基因，因此本发明优选使用固体培养法。
培养中所使用的培养基成分可以使用动物或植物性的任意成分，优选含有植物性的营养源，例如优选含有植物性的营养源，例如优选含有糙米、糠、米糠、大豆、大麦等。其中特别优选以糙米作为营养源。由此可以提高酸性淀粉酶等酸性酶的生产效率。
其它碳源可以添加葡萄糖、蔗糖、糖蜜等糖类，氮源可以添加氨、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵等铵盐或硝酸盐等。
本发明的动物用饲料添加剂中，可以将上述所得培养物直接作为动物用饲料添加剂，还可以从所得培养物中分离含有菌体和酸性酶的一部分，使其包含于动物用饲料添加剂中。例如，使用固体培养基进行菌体培养时，将菌体与培养基一起粉碎，将所得含在动物用饲料添加剂中，这从简便性方面考虑优选。进一步优选进行使培养物干燥、或者进一步添加用于提高保存性的任意成分等的加工，提高产品的品质稳定性。
干燥方法没有特别限定，例如可通过通风干燥、自然干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等进行，其中优选使用通风干燥。还可以采用冷冻干燥，此时可以添加保护剂。保护剂的种类没有特别限定，优选选择脱脂乳、谷氨酸钠和糖类的一种或多种使用。使用糖类时，其种类没有特别限定，优选使用葡萄糖或海藻糖。
干燥后，向所得干燥物中加入脱氧剂、脱水剂，加入到阻气性的铝袋中密封，在比室温低温的温度下储存。由此可以使菌体长时间以存活状态保存。
优选本发明的动物用饲料添加剂的曲酸含有浓度低。通常，曲酸的含有浓度优选为0.1mg/L或以下，进一步优选0.01mg/L或以下。
本发明的动物用饲料添加剂可以与通常所使用的动物用饲料的成分混合，制成用于促进动物生长的饲料。上述曲霉属菌进一步对引发动物肠道感染症的病原菌具有抗菌活性和/或具有针对球虫的杀原生动物活性时，可以制成用于预防、治疗病原菌和/或球虫导致的动物肠道感染症的饲料。
饲料的种类或成分只要不会使本发明的动物用饲料添加剂中含有的菌体死亡、且酸性酶不失活即可，没有特别限定，通常可以添加到家畜的饲料或宠物食品、动物用饲料补充剂等动物饲料中使用。
本发明的饲料可通过将本发明的动物用饲料添加剂添加到饲料成分中制备。本发明的饲料中含有的动物用饲料添加剂的含量可根据所要给予的动物的种类、体重、年龄、性别、使用目的、健康状态、饲料成分等适当调节，并没有特别限定，通常，相对于饲料总量可以以干燥状态制成10-5000ppm，优选50-1000ppm。
本发明的动物用饲料添加剂可以直接添加到饲料成分中混合，添加并混合粉末状、固体形状的动物用饲料添加剂时，为了容易混合到饲料中，可以以液体状或凝胶状的形式使用。这种情况下，可以使用水、大豆油、菜籽油、玉米油等植物油，液体动物油、聚乙烯基醇或聚乙烯基吡咯烷酮、聚丙烯酸等水溶性高分子化合物作为液体载体。为了保持饲料中均体浓度的均匀性，优选配合海藻酸、海藻酸钠、占吨胶、酪氨酸钠、阿拉伯树胶、瓜耳胶、罗望子多糖类等水溶性多糖类。为了防止杂菌的繁殖，可以配合有机酸，使液体活菌剂为酸性。
摄取本发明的饲料的动物种类没有特别限定，例如有哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类、鱼类等。其中，特别适合用于家禽、家畜。被动物摄取的饲料的量可根据动物的种类、体重、年龄、性别、使用目的、健康状态、饲料的成分等适当调节。
实施例 (1-1)耐酸性、胆汁酸耐性曲霉属菌的筛选 将马铃薯右旋糖琼脂培养基的pH调节为5，在121℃下灭菌15分钟。在该琼脂培养基的温度降低至60℃时，以1L培养基10g的浓度添加脱氧胆酸钠，接种保存于株式会社秋田今野商店(日本国秋田县大仙市刈和野248)的曲霉菌，酱油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉、米曲霉在培养基中良好生长。其中，酱油曲霉AOK210株、塔木里氏曲霉AOK43株、臭曲霉AOK N4586株、黑色曲霉AOK B650株生长发育特别良好。
(1-2)耐酸性、耐胆汁酸性曲霉菌的筛选 与上述同样，在含有脱氧胆酸钠的培养基中接种以各种发酵食品作为分离源的多种曲霉菌，从在培养基中生长发育的菌株中筛选生长发育最为良好的菌株。该菌株为米曲霉IK-05074株，保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心。
IK-05074株的微生物学性质如上所述。
(2-1)菌种的比较试验 (a)菌体的培养和酸性酶活性的测定 以糙米为固体培养基，进行(1-1)中筛选的AOK 210株、AOK 43株、AOK N4586株和AOK B650株的培养。即，将100g糙米在水中浸泡一昼夜，使其溶胀，然后加入到在盖子上具有无菌滤器的直径14cm、深10cm的聚碳酸酯制容器中，厚度为2cm，在高压釜中、在121℃下灭菌15分钟。向该容器中接种上述各菌体，在28℃下培养5天，制备种菌。
接着，将与上述同样溶胀的糙米层合在30×40×10cm的不锈钢盘中，厚度为1.5cm，盖上具有用20×25cm的滤器覆盖的通气孔的盖子，放入大型高压釜中，在121℃下灭菌25分钟。将该盘冷却后，将预先培养的上述种菌全量接种。将该盘放入28℃的孵卵器中培养7天。
培养后在35℃下通风干燥，用喷射磨粉碎，得到各菌种的固体培养物。对于川地曲霉(Aspergillus kawachii)AOK 1006s株(株式会社秋田今野商店)也与上述同样地得到固体培养物。
测定各1g固体培养物的耐酸性α-淀粉酶活性、和酸性蛋白酶活性、以及酸性羧基肽酶活性的总和。结果如表1所示。上述酸性酶的测定按照国税厅所定分析法(改正第3回税厅训令第1号)的固体曲的分析方法中的耐酸性α-淀粉酶活性测定法、酸性蛋白酶活性测定法和酸性羧基肽酶活性测定法进行。
(b)给予试验 进行将上述得到的菌株给予雏鸡的试验。将上述得到的AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株的固体培养物以相对于饲料(SD肉鸡早后期用、日本配合饲料株式会社制备)的总质量为100ppm、150ppm的浓度混合到饲料中，作为实施例1-8。AOK1006s株的固体培养物同样地混合到饲料中，作为比较例1和2。还进行高压釜灭菌，不添加菌，而以150ppm的浓度将糙米混合到饲料中，作为对照组。给予试验是以10只为一组，使孵化后第一周的雏鸡自由摄取上述饲料28天，进行肥育。孵化后第35天的各组雏鸡的平均体重如表1所示。
[表1] AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株的固体培养物的耐酸性α-淀粉酶活性是培养AOK1006s得到的培养物的耐酸性α-淀粉酶活性的4倍或以上。酸性蛋白酶活性和酸性羧基肽酶活性的总和也约为2.5倍-6倍。由此可知，上述四种菌体的酸性淀粉酶、酸性蛋白酶和酸性羧基肽酶的生产能力优异。其中特别是AOK210株的酸性淀粉酶、酸性蛋白酶和酸性羧基肽酶的全部的生产能力均优异。
给予含有本发明的动物用饲料添加剂的饲料的实施例1-8组的雏鸡体重比比较例1和2组的雏鸡体重增加。由此可知，含有本发明的动物用饲料添加剂的饲料的促进动物生长的效果优异。特别是使用AOK210株制备的含有动物用饲料添加剂的饲料，其促进动物体重增加的效果优异。
(2-2)菌种的比较试验 (a)菌体的培养和酸性酶活性的测定 以糙米为固体培养基，进行(1-2)中筛选的IK-05074株的培养。培养是培养10天、制备种菌，以及将该种菌全量接种、培养10天，除此之外均与上述同样进行。川地曲霉AOK1006s株的培养也同样进行。培养后，与上述同样地得到它们的固体培养物。
接着，将马铃薯右旋糖液体培养基在121℃下灭菌15分钟，然后降低至60℃，将脱氧胆酸钠以每1L培养基中5g的浓度添加，在该培养基中接种IK-05074株，在28℃下培养6天。将该培养物用0.4μm的滤器过滤，收集菌体。向收集的菌体中通入培养前的培养基，洗涤三次，出去菌体以外的酶，接着向菌体中添加培养基成分，在36℃下通风干燥24小时，得到不含有酸性酶的IK-05074株的固体培养物。
按照与(2-1)(a)同样的方法测定每1g各固体培养物的耐酸性α-淀粉酶活性、以及酸性蛋白酶活性和酸性羧基肽酶活性的总和。结果如表2所示。
(b)给予试验 IK-05074株对雏鸡的给予试验如(2-1)(b)同样的方法进行。将上述得到的IK-05074株的固体培养物以100ppm、150ppm的浓度混合到饲料中，将其分别作为实施例9和10。将川地曲霉的固体培养物同样地混合到饲料中，将其作为比较例3和4，将除去了酸性酶的IK-05074株的固体培养物以150ppm的浓度混合到饲料中，以此作为比较例5。还将进行高压釜灭菌、不添加菌的干燥的糙米以150ppm的浓度混合到饲料中，以此作为对照组。给予试验是以10只为一组，使孵化后第一周的雏鸡自由摄取上述饲料48天，进行肥育。孵化后第55天各组雏鸡的平均体重如表2所示。
[表2] 培养IK-05074株所得到的培养物的耐酸性α-淀粉酶活性是培养川地曲霉所得到的培养物的耐酸性α-淀粉酶活性的约57倍。酸性蛋白酶活性和酸性羧基肽酶活性的总和也约为6倍。由此可知，IK-05074株的酸性淀粉酶、酸性蛋白酶和酸性羧基肽酶的生产能力优异，特别是酸性淀粉酶的生产能力优异。
给予含有本发明的动物用饲料添加剂的饲料的实施例9和10的雏鸡体重与比较例3-5组的雏鸡体重相比增加。由此可知，含有动物用饲料添加剂的饲料具有促进动物生长的效果，其中，该动物用饲料添加剂含有本发明的米曲霉和其生产的酸性酶。
(3)固体培养基的比较试验 (a)菌体的培养和耐酸性α-淀粉酶活性的测定 以糙米、大麦和破碎大豆作为固体培养基，进行AOK210株的培养。即，分别将100g糙米、大麦和破碎大豆在水中浸泡过夜，使其溶胀，然后分别铺在30×40×5cm的不锈钢盘中，厚度为2.0cm，将表面用滤纸覆盖，然后进一步盖上不锈钢的盖子，放入大型高压釜中，在121℃下灭菌30分钟。将该盘冷却后，将(2-1)(a)中培养的种菌总量分开接种于各培养基中。将该盘放入28℃的孵卵器中培养5天。
培养后，在35℃下通风干燥，通过喷射磨粉碎，得到固体培养物。测定各固体培养物的耐酸性α-淀粉酶活性。结果如表3所示。耐酸性α-淀粉酶活性的测定与上述同样。
(b)给予试验 进行将上述得到的干燥固体培养物给予雏鸡的试验。将上述固体培养物以相对于饲料(SD肉鸡早后期用、日本配合饲料株式会社制备)总质量为50ppm、100ppm的浓度混合到饲料中，以此作为实施例11-16。将高压釜灭菌、不添加菌的干燥的糙米以100ppm的浓度混合到饲料中，作为对照组。给予试验以10只为一组，使孵化后第一周的雏鸡自由摄取上述饲料35天，进行肥育。孵化后第42天各组雏鸡的平均体重如表3所示。
[表3] 以糙米为固体培养基成分得到的培养物的耐酸性α-淀粉酶活性与以大豆、大麦为固体培养基成分得到的培养物的耐酸性α-淀粉酶活性相比约为1.5倍，明显高。由此可知，使用糙米作为固体培养基成分时，特别是酸性淀粉酶的生产能力增大。
给予含有本发明的动物用饲料添加剂的饲料的实施例11-16的雏鸡体重与对照组的雏鸡体重相比增加。特别是含有以糙米作为固体培养基成分制备的动物用饲料添加剂的本发明的饲料其促进体重增加的效果优异。
(4-1)曲霉菌的培养物的抗菌活性测定 通过将AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株与病原菌共同培养，试验这些菌对病原菌的抗菌活性。
对于肠炎沙门氏菌(SE)，使用标准琼脂培养基、在37℃下进行24小时好氧培养。刮取在平板上生长的菌落，使其悬浮于无菌生理盐水中。制备500ml脑心浸液“日水”，高压釜灭菌后无菌加入到1L容量的三角烧瓶中，SE的终浓度为约1.0×104-1.0×105CFU/ml。向三角烧瓶中分别无菌加入各5g(2-1)(a)所得的AOK210株、AOK43株、AOKN4586株和AOK B650株的粉碎固体培养物，以此作为实施例17-20。将无菌加入5g AOK1006s株的粉碎固体培养物的三角烧瓶作为比较例6，以未加入曲霉培养物的三角烧瓶作为对照组。将各三角烧瓶在37℃的恒温箱中、在好氧条件下缓慢搅拌培养。
对于产气荚膜梭状芽孢杆菌(CP)，使用Anaero Pack Kenki(三菱气体化学(株)制备)，在加入了蛋黄的CW琼脂培养基(日水制药(株)制备)中、在37℃下进行24小时的厌氧培养。刮取在平板上生长的菌落，使其悬浮于无菌生理盐水中。制备500ml脑心浸液“日水”，高压釜灭菌后无菌加入到1L容量的三角烧瓶中，CP的终浓度为约1.0×104-1.0×105CFU/ml。向三角烧瓶中分别无菌加入各5g(2-1)(a)所得的AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株的粉碎固体培养物，以此作为实施例21-24。将无菌加入5g AOK1006s株的粉碎固体培养物的三角烧瓶作为比较例7，以未加入曲霉培养物的三角烧瓶作为对照组。将各三角烧瓶在37℃的恒温箱中、使用Anaero Pack Kenki、在厌氧条件下缓慢搅拌培养。
试验开始后，在第0天、3天、7天实施SE和CP的活菌数测定。SE的活菌数测定方法是将收集的培养液用无菌生理盐水梯度稀释10倍后，将各0.1ml稀释梯度液涂布在X-SAL琼脂培养基“日水”上，在37℃下进行24小时好氧培养，计数生长的特征性菌落。CP的活菌数测定是将采集的培养液用无菌生理盐水梯度稀释为10倍，然后将各0.1ml梯度稀释液涂布在加入了蛋黄的CW琼脂培养基(日水制药(株)制备)上，使用Anaero Pack Kenki、在37℃下进行24小时厌氧培养，计数生长的特征性菌落。
为了同时对曲酸浓度进行定量，将培养液以8,000rpm离心10分钟，将该上清用混合有纤维素的酯型膜滤器(孔径0.45μm、ADVANTEC MFS，INC.制备)过滤。HPLC装置是使用Waters600(多溶剂传输系统(Multisolvent Delivery system))和Waters490E(Programmable multiwavelength Detector)。柱是使用YMC-PackODS-AM 6.0mm×150mm(YMC(ワイエムシイ)制造)。流动相使用0.1mol/L磷酸二氢钠溶液(pH3.0)-甲醇(97∶3)，流速为1.0ml/分钟，柱温为40℃，测定波长为270nm，进行曲酸的检测。校正曲线是使用曲酸(试剂特级，和光纯药工业(株)产品)制备。
表4表示SE的活菌数，表5表示SE共培养试验的培养物的曲酸浓度，表6表示CP的活菌数，表7表示CP的共培养试验的培养物的曲酸浓度。
[表4]
[表5]
[表6]
[表7]
如实施例17-20所示，AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOKB650株的固体培养物与比较例6所示的AOK 1006s株的固体培养物相比，显示明显高的对SE的抗菌活性。特别是与AOK210株共培养时，SE的活菌数从试验第3天以后为检测下限或以下，可见最高的抗菌活性。对于AOK43株，试验第7天，SE的活菌数为检测下限或以下。在对照组中，至试验第7天仍可见活菌数的升高，第7天显示2.8×108CFU/ml。
在任何一种悬浮液中，曲酸含量均为检测下限或以下。
如实施例21-24所示，AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOKB650株的固体培养物与比较例7所示的AOK 1006s株的固体培养物相比，显示明显高的对CP的抗菌活性。特别是与AOK210株共同培养时，CP的活菌数自试验第3天以后为检测下限或以下，可见最高的抗菌活性。对于对照组，可见至试验第7天菌数仍升高，在第7天显示1.0×106CFU/ml。
在任何一种悬浮液中，曲酸含量均为检测下限或以下。
对于大肠杆菌(EC)，通过标准琼脂培养基(日水制药(株)制备)、在37℃下好氧培养24小时。刮取在平板上生长的菌落，使其悬浮于无菌生理盐水中。制备500ml脑心浸液“ニツスイ”(日水制药(株)制备)，高压釜灭菌后无菌加入到1L容量的三角烧瓶中，EC的终浓度为约1.0×105-1.0×106 CFU/ml。向三角烧瓶中无菌加入各5g(2-1)(a)中得到的AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株的粉碎固体培养物，以此作为实施例25-28。将无菌加入5g AOK1006s株的粉碎固体培养物的三角烧瓶作为比较例8，将不加入曲霉培养物的三角烧瓶作为对照组。各三角烧瓶在37℃的恒温箱中、在好氧条件下缓慢搅拌培养。
对于金黄色葡萄球菌(SA)，在标准琼脂培养基、在37℃下好氧培养24小时。刮取在平板上生长的菌落，使其悬浮于无菌生理盐水中。制备500ml脑心浸液“ニツスイ”(日水制药(株)制备)，高压釜灭菌后无菌加入到1L容量的三角烧瓶中，SA的终浓度为约1.0×105-1.0×106CFU/ml。向三角烧瓶中无菌加入各5g(2-1)(a)中得到的AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株的粉碎固体培养物，以此作为实施例29-32。将无菌加入5g AOK1006s株的粉碎固体培养物的三角烧瓶作为比较例9，将不加入曲霉培养物的三角烧瓶作为对照组。各三角烧瓶在37℃的恒温箱中、在好氧条件下缓慢搅拌培养。
试验开始后，在第0天、3天、7天实施EC和SA的活菌数测定。SE的活菌数测定方法是将收集的培养液用无菌生理盐水梯度稀释10倍后，将各0.1ml稀释梯度液涂布在肠杆菌培养基(chromocult coliformagar)“Merck”(Merck制备)上，在37℃下进行24小时好氧培养，计数生长的特征性菌落。SA的活菌数测定是将采集的培养液用无菌生理盐水梯度稀释为10倍，然后将各0.1ml梯度稀释液涂布在加入了蛋黄的甘露醇高盐琼脂培养基“荣研”(荣研器材(株)制备)上，在37℃下进行48小时好氧培养，计数生长的特征性菌落。
表8表示SE的活菌数，表9表示SA的活菌数。
[表8]
[表9]
如实施例25-28所示，AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOKB650株的固体培养物与比较例8所示的AOK 1006s株的固体培养物相比，显示明显高的对EC的抗菌活性。特别是与AOK210株共培养时，EC的活菌数从试验第3天以后为检测下限或以下，可见最高的抗菌活性。对于AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株，试验第7天，EC的活菌数为检测下限或以下。在对照组中，至试验第7天仍可见活菌数的升高，第7天显示1.0×107CFU/ml。
如实施例29-32所示，AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOKB650株的固体培养物与比较例9所示的AOK 1006s株的固体培养物相比，显示明显高的对SA的抗菌活性。特别是与AOK210株共培养时，SA的活菌数从试验第3天以后为检测下限或以下，可见最高的抗菌活性。对于AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株，试验第7天，SA的活菌数为检测下限或以下。在对照组中，至试验第7天仍可见活菌数的升高，第7天显示7.2×107CFU/ml。
(4-2)米曲霉培养物的抗菌活性的测定 通过将IK-05074株与病原菌共培养，按照与(4-1)同样的方法测试IK-05074株对于病原菌的抗菌活性。
将加入了肠炎沙门氏菌(SE)和(2-2)(a)中得到的IK-05074株的粉碎固体培养物的三角烧瓶作为实施例33，将加入了SE和AOK1006s株的粉碎固体培养物的三角烧瓶作为比较例10，将未加入曲霉培养物的三角烧瓶作为对照组。
将加入了产气荚膜梭状芽孢杆菌(CP)和(2-2)(a)中得到的IK-05074株的粉碎固体培养物的三角烧瓶作为实施例34，将加入了CP和AOK1006s株的粉碎固体培养物的三角烧瓶作为比较例11，将未加入曲霉培养物的三角烧瓶作为对照组。
试验开始后，在第0天、3天、7天实施SE和CP的活菌数测定。同时对曲酸浓度进行定量。
表10表示SE的活菌数，表11表示SE的共培养试验中培养物的曲酸浓度，表12表示CP的活菌数，表13表示CP共培养试验的培养物的曲酸浓度。
[表10]
[表11]
[表12]
[表13]
如实施例33所示，与IK-05074株共培养时，在试验第3天以后SE的活菌数为检测下限或以下，与比较例10所示的AOK1006s株的固体培养物相比，显示明显高的对SE的抗菌活性。在对照组中，试验后可见菌数的升高，在第3天显示为3.3×108CFU/ml。
在任何悬浮液中，曲酸含量均在检测下限或以下。
如实施例34所示，与IK-05074株共培养时，在试验第3天以后CP的活菌数在检测下限或以下，与比较例11所示的AOK1006s株的固体培养物相比，显示明显高的抗CP的抗菌活性。对于对照组，在至试验第7天菌数升高，在第7天显示1.3×106CFU。
在任何悬浮液中曲酸含量均为检测下限或以下。
将加入了大肠杆菌(EC)和(2-2)(a)所得的IK-05074株的粉碎固体培养物的三角烧瓶作为实施例35，将加入了EC和AOK1006s株的粉碎固体培养物的三角烧瓶作为比较例12，将未加入曲霉培养物的三角烧瓶作为对照组。
将加入了金黄色葡萄球菌(SA)和(2-2)(a)所得的IK-05074株的粉碎固体培养物的三角烧瓶作为实施例36，将加入了EC和AOK1006s株的粉碎固体培养物的三角烧瓶作为比较例13，将未加入曲霉培养物的三角烧瓶作为对照组。
试验开始后，在第0天、3天、7天实施EC和SA的活菌数测定。
表14表示EC的活菌数，表15表示SA的活菌数. [表14]
[表15]
如实施例35所示，与IK-05074株共培养时，在试验第3天以后EC的活菌数为检测下限或以下，与比较例12所示的AOK1006s株的固体培养物相比，显示明显高的对EC的抗菌活性。在对照组中，试验后可见菌数的升高，在第3天显示为4.0×108CFU/ml。
如实施例36所示，与IK-05074株共培养时，在试验第3天以后EC的活菌数为检测下限或以下，与比较例13所示的AOK1006s株的固体培养物相比，显示明显高的对SA的抗菌活性。在对照组中，试验后可见菌数的升高，在第3天显示为3.7×108CFU/ml。
(5-1)肠炎沙门氏菌对雏鸡的攻击试验 相对于雏鸡的饲料(SD肉鸡早期用，日本配合饲料(株)制备，未添加抗菌性物质的饲料)的总质量，将(2-1)(a)所得的AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株的粉碎固体培养物混合成100ppm，将所得饲料分别作为实施例37-40。将12只来自肉种鸡(商品名Chunky)的种蛋孵化的雏鸡作为一组，给予实施例37-40的饲料14天。另一方面，将AOK 1006s株的粉碎固体培养物混合成100ppm，将所得饲料作为比较例14。将混合100ppm乳糖代替曲霉培养物所得的饲料作为对照组，同样地进行试验。在7日龄，每只雏鸡口服给予1.8×105CFU肠炎沙门氏菌(SE)。SE使用由在群马县养鸡业者农场死亡的鸡的盲肠内容物中分离的菌株。在14日龄，用棉棒擦试盲肠内容物和总排泄腔，采集粪便。
盲肠内容物的SE活菌数按以下方法测定，计算感染指数和防御指数。
将1g盲肠内容物加入灭菌磷酸缓冲生理盐水，稀释为10倍，充分混合，制备试样原液。接着将试样原液用无菌生理盐水以10倍分梯度稀释，制成梯度稀释液。将试样原液和梯度稀释液分别各以0.1ml涂抹在SS琼脂平板培养基“日水”(日水制药(株)制备)和亮绿琼脂平板培养基(Difco Laboratories制备)上，在37℃下培养24小时，测定在各平板培养基上生长的典型的SE菌落数。并且由菌落钩取菌体，接种于赖氨酸脱羟酶试验用的SIM琼脂培养基“日水”(日水制药(株)制备)和TSI琼脂培养基“日水”(日水制药(株)制备)上，在37℃下培养24小时，进行性状的确认。
其中可以确认为SE的菌落数乘以稀释液的稀释倍率，计算1g盲肠内容物中的SE活菌数。根据该结果如下计算感染指数和防御指数。感染指数是表示病原菌的感染率的程度的值，防御指数是与给予不含有曲霉的饲料进行比较时，各饲料的防御病原菌感染的能力的值。
感染指数各个体盲肠内容物中的SE活菌数的对数平均值(logCFU/g的平均值) 防御指数对照区的感染指数/各试验组的感染指数 由总排泄腔采集的粪便是按以下方法、按个体进行定性培养，由此确认SE的性状。即，将附着于棉棒上的粪便悬浮于10ml无菌磷酸缓冲生理盐水中，制成试样原液，然后各以0.1ml涂抹在SS琼脂平板培养基和亮绿琼脂平板培养基上，在37℃下培养24小时，判定是否形成在各平板培养基上生长的典型的SE的菌落。并且由菌落钩取菌体，接种于LIM琼脂培养基“日水”(日水制药(株)制备)、SIM琼脂培养基和TSI琼脂培养基上，在37℃下培养24小时，进行性状的确认。
结果如表16所示。
[表16]
给予了含有实施例37-40的AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株的饲料的雏鸡，其盲肠内容物的SE菌体浓度极低，SE的感染指数极低。特别是在实施例37中可得到高的防御指数。给予了含有比较例14的AOK 1006s株的饲料的雏鸡与对照组相比，SE的活菌数没有变化。由此显示酱油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉所生产的含有酸性酶的培养物具有预防SE感染症的效果。
(5-2)肠炎沙门氏菌对于雏鸡的攻击试验 将(2-2)(a)所得的IK05074株的粉碎固体培养物混合成100ppm，将所得雏鸡的饲料作为实施例41，将AOK 1006s株的粉碎固体培养物混合为100ppm，将所得饲料作为比较例15，将混合100ppm乳糖代替曲霉培养物所得的饲料作为对照组，使用这些饲料培养培育雏鸡，进行SE攻击试验。试验方法是口服给予2.0×105 CFU的SE，除此之外与上述同样。
结果如表17所示。
[表17]
给予了含有实施例41的IK-05074株的饲料的雏鸡，其盲肠内容物的SE菌体浓度极低，SE感染指数极低。给予了含有比较例15的AOK1006s株的饲料的雏鸡与对照组相比，SE活菌数几乎没有变化。由此显示，含有本发明的米曲霉所生成的酸性酶的培养物具有预防SE感染症的效果。
(6-1)产气荚膜梭状芽孢杆菌对于雏鸡的攻击试验 相对于雏鸡的饲料(SD肉鸡早期用，日本配合饲料(株)制备，未添加抗菌性物质的饲料)的总质量，将(2-1)(a)所得的AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株的粉碎固体培养物混合成100ppm，将所得饲料分别作为实施例42-45。将12只来自肉种鸡(商品名Chunky)的种蛋孵化的雏鸡作为一组，给予实施例42-45的饲料14天。另一方面，将AOK 1006s株的粉碎固体培养物混合成100ppm，将所得饲料作为比较例16。将混合100ppm乳糖代替曲霉培养物所得的饲料作为对照组，同样地进行试验。在7日龄，每只雏鸡口服给予1.1×109CFU产气荚膜梭状芽孢杆菌(CP)。CP使用由在群马县养鸡业者农场死亡的鸡的盲肠内容物中分离的菌株。在14日龄，用棉棒擦试盲肠内容物和总排泄腔，采集粪便。
盲肠内容物的CP活菌数按以下方法测定，计算感染指数和防御指数。
将1g盲肠内容物加入灭菌磷酸缓冲生理盐水，稀释为10倍，充分混合，制备试样原液。接着将试样原液用无菌生理盐水以10倍分梯度稀释，制成梯度稀释液。将试样原液和梯度稀释液分别各以0.1ml涂抹在梭状芽孢杆菌测定用培养基(日水制药(株)制备)上，使用AnaeroPack Kenki，在35℃下厌氧培养24小时，判定是否形成在各平板培养基上生长的黑色菌落。并且由菌落钩取菌体，接种于加入了蛋黄的CW琼脂培养基(日水制药(株)制备)上，在35℃下进行24-48小时的好氧和厌氧培养，进行性状的确认。
其中确认的CP的菌落数乘以稀释液的稀释倍率，计算1g盲肠内容物中的CP活菌数。根据该结果如上计算感染指数和防御指数。
由总排泄腔采集的粪便是按以下方法、按个体进行定性培养，由此确认CP的性状。即，将附着于棉棒上的粪便悬浮于10ml无菌磷酸缓冲生理盐水中，制成试样原液，将试样原液以0.1ml涂抹在梭状芽孢杆菌测定用培养基(日水制药(株)制备)上，使用Anaero Pack Kenki，在35℃下厌氧培养24小时，判定是否形成在各平板培养基上生长的黑色菌落。并且由菌落钩取菌体，接种于加入了蛋黄的CW琼脂培养基(日水制药(株)制备)上，在35℃下进行24-48小时的好氧和厌氧培养，进行性状的确认。
结果如表18所示。
[表18]
给予了含有实施例42-45的AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株的饲料的雏鸡，其盲肠内容物的CP菌体浓度极低，SE的感染指数极低。特别是在实施例42中可得到高的防御指数。给予了含有比较例16的AOK 1006s株的饲料的雏鸡与对照组相比，CP的活菌数没有变化。由此显示酱油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉所生产的含有酸性酶的培养物具有预防CP感染症的效果。
(6-2)产气荚膜梭状芽孢杆菌对于雏鸡的攻击试验 将(2-2)(a)所得的IK-05074株的粉碎固体培养物混合成100ppm，将所得的雏鸡的饲料作为实施例46。将AOK 1006s株的粉碎固体培养物混合成100ppm，将所得的饲料作为比较例17。将混合100ppm乳糖代替曲霉培养物所得的饲料作为对照组，使用这些饲料饲养雏鸡，进行CP攻击试验。除了口服给予1.5×109CFU的CP之外，试验方法均与上述同样。
结果如表19所示。
[表19]
给予了含有实施例46的IK-05074株的饲料的雏鸡，其盲肠内容物的CP菌体浓度极低，CP的感染指数极低。给予了含有比较例17的AOK1006s株的饲料的雏鸡与对照组相比，CP的活菌数几乎没有变化。由此显示本发明的米曲霉所生产的含有酸性酶的培养物具有预防CP感染症的效果。
(7-1)大肠杆菌对于犊牛的攻击试验 将出生后1周龄的雄犊牛(荷斯坦)以8头为一组进行饲养。相对于犊牛用混合饲料(ミラクルメイト(株)科学饲料研究所制备)的总质量，将(2-1)(a)所得的AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株的粉碎固体培养物混合成100ppm，将所得饲料分别作为实施例47-50。喂这些犊牛用混合饲料饲养至4周龄。另一方面，将AOK 1006s株的粉碎固体培养物混合成100ppm，将所得饲料作为比较例18。混合100ppm的乳糖代替曲霉培养物，将所得的饲料作为对照组，进行同样的试验。在2周龄，以每头1.2×106CFU对所有犊牛口服给予大肠杆菌(EC)。喂饲至4周龄，计算各组犊牛的死亡率。
另外采集小肠内容物，按以下方法测定小肠内容物的EC活菌数。
将1g小肠内容物加入灭菌磷酸缓冲生理盐水，稀释为10倍，充分混合，制备试样原液。接着将试样原液用无菌生理盐水以10倍梯度稀释，制成梯度稀释液。将试样原液和梯度稀释液分别各以0.1ml涂抹在肠杆菌培养基(chromocult coliform agar)“Merk”上，在37℃下培养24小时，测定在各平板培养基上生长的典型的EC菌落数。确认为EC的菌落数乘以稀释液的稀释倍率，计算1g小肠内容物中的EC活菌数。根据该结果如上计算感染指数和防御指数。
结果如表20所示。
[表20]
给予含有实施例47-50的AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株的饲料的犊牛，其死亡率为0％。小肠内容物的EC感染指数低。特别在实施例47中得到了高的防御指数。给予了含有比较例18的AOK 1006s株的饲料的犊牛的死亡率为13％。与对照组比较，EC的活菌数没有变化。由此显示酱油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉所生产的含有酸性酶的培养物具有预防EC感染症的效果。
(7-2)大肠杆菌对犊牛的攻击试验 将IK-05074株的粉碎固体培养物混合成100ppm，将所得的犊牛用混合饲料作为实施例51。将AOK 1006s株的粉碎固体培养物混合成100ppm，将所得的饲料作为比较例19。将混合100ppm乳糖代替曲霉培养物所得的饲料作为对照组，使用这些饲料饲养犊牛，进行EC攻击试验。除了口服给予1.5×106CFU的EC之外，试验方法与上述EC攻击试验同样。
结果如表21所示。
[表21]
给予含有实施例51的IK-05074株的饲料的犊牛，其死亡率为0％。小肠内容物的EC感染指数低。给予了含有比较例19的AOK 1006s株的饲料的犊牛的死亡率为13％。与对照组比较，EC的活菌数没有变化。由此显示本发明的米曲霉所生产的含有酸性酶的培养物具有预防EC感染症的效果。
(8-1)水肿病菌对仔猪的攻击试验 相对于仔猪的饲料(SD仔猪人工乳早期用，日本配合饲料(株)制备，未添加抗菌性物质的饲料)的总质量，将(2-1)(a)所得的AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株的粉碎固体培养物混合成100ppm，将所得饲料分别作为实施例52-55。将30头35日龄的仔猪(大约克夏)作为一组，饲育19天。另一方面，将AOK 1006s株的粉碎固体培养物混合成100ppm，将所得饲料作为比较例20。将混合100ppm乳糖代替曲霉培养物所得的饲料作为对照组，同样地进行试验。在40日龄，每头口服给予2.3×105CFU水肿病菌(大肠杆菌)，使其感染。饲养至54日龄，计算各组仔猪的死亡率。
与上述同样，采集小肠内容物，测定小肠内容物的EC活菌数，计算感染指数和防御指数。
结果如表22所示。
[表22]
给予含有实施例52-55的AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株的饲料的仔猪，其死亡率约为20-30％左右，与给予比较例20的饲料的组的死亡率相比较小。另外，小肠内容物的EC感染指数低，特别在实施例52中，得到了高的防御指数。另外，与对照组比较，浮肿病菌的活菌数几乎没有变化。由此显示含有本发明的酱油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉所生成的酸性酶的培养物具有预防水肿病的效果。
(8-2)水肿病菌对仔猪的攻击试验 将(2-2)(a)所得的IK-05074株的粉碎固体培养物混合成100ppm，将所得的仔猪用饲料作为实施例56。将AOK 1006s株的粉碎固体培养物混合成100ppm，将所得的饲料作为比较例21。将混合100ppm乳糖代替曲霉培养物所得的饲料作为对照组，使用这些饲料饲养仔猪，进行水肿病菌攻击试验。除了口服给予1.8×105CFU的水肿病菌之外，试验方法与上述水肿病菌攻击试验同样。
结果如表23所示。
[表23]
给予含有实施例56的IK-05074株的饲料的仔猪，其死亡率为约20％左右，与给予了比较例21的饲料的组的死亡率相比较小。小肠内容物的EC感染指数低。与对照组相比，水肿病菌的活菌数几乎没有变化。由此显示本发明的米曲霉所生产的含有酸性酶的培养物具有预防水肿病的效果。
(9-1)球虫防除试验 (a)柔嫩艾美耳球虫防除试验 收集自然感染柔嫩艾美耳球虫的鸡粪，在实体显微镜下分离卵囊，用生理盐水洗涤。向直径9cm的培养皿中加入5ml生理盐水，加入约4000个/ml洗净的卵囊。将(2-1)(a)得到的AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株的粉碎固体培养物以各50mg加入到培养皿中，分别作为实施例57-60。将加入了50mg AOK 1006s株的粉碎固体培养物的培养皿作为比较例22，将不加入曲霉培养物的培养皿作为对照组。将各培养皿在37℃下振荡(150rpm)。7天后在实体显微镜下进行卵囊个数的测定、细胞壁的变形或溶解状态的观察，计算卵囊减少率和溶解变性率。
结果如表24所示。
[表24]
1)第7天残留的卵囊中的比例。
如实施例57-60所示，AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOKB650株的固体培养物与比较例22的所示的AOK 1006s株的固体培养物相比，柔嫩艾美耳球虫的卵囊数目明显减少，并且显示高的溶解变性活性。特别是在AOK210株中，通过对柔嫩艾美耳球虫的卵囊进行处理，可以得到极高的卵囊减少率和溶解变性率。
(b)邱氏艾美耳球虫防除试验 收集自然感染邱氏艾美耳球虫的牛痢疾粪便，在实体显微镜下分离卵囊，用生理盐水洗涤。向直径9cm的培养皿中加入5ml生理盐水，加入约2000个/ml洗净的卵囊。将(2-1)(a)得到的AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOK B650株的粉碎固体培养物以各50mg加入到培养皿中，分别作为实施例61-64。将加入了50mg AOK 1006s株的粉碎固体培养物的培养皿作为比较例23，将不加入曲霉培养物的培养皿作为对照组。将各培养皿在37℃下振荡(150rpm)。7天后在实体显微镜下进行卵囊个数的测定、细胞壁的变形或溶解状态的观察，计算卵囊减少率和溶解变性率。
结果如表25所示。
[表25]
1)第7天残留的卵囊中的比例。
如实施例61-64所示，AOK210株、AOK43株、AOK N4586株和AOKB650株的固体培养物与比较例23的所示的AOK 1006s株的固体培养物相比，邱氏艾美耳球虫的卵囊数目明显减少，并且显示高的卵囊溶解变性活性。特别是在AOK210株中，通过对邱氏艾美耳球虫的卵囊进行处理，可以得到极高的卵囊减少率和溶解变性率。
(9-2)球虫防除试验 (a)柔嫩艾美耳球虫防除试验 将加入了(2-2)(a)中得到的IK-05074株的粉碎固体培养物的培养皿作为实施例65，按照与上述同样的方法进行柔嫩艾美耳球虫防除试验。另外以加入了AOK 1006s株的固体培养物的培养皿作为比较例24，同样进行试验。
结果如表26所示。
[表26]
1)第7天残留的卵囊中的比例。
如实施例65所示，IK-05074株的固体培养物与比较例24所示的AOK 1006s株的固体培养物相比，柔嫩艾美耳球虫的卵囊数目明显减少，并且显示高的卵囊溶解变性活性。
(b)邱氏艾美耳球虫防除试验 将加入了(2-2)(a)中得到的IK-05074株的粉碎固体培养物的培养皿作为实施例66，按照与上述同样的方法进行邱氏艾美耳球虫防除试验。另外以加入了AOK 1006s株的固体培养物的培养皿作为比较例25，同样进行试验。
结果如表27所示。
[表27]
1)第7天残留的卵囊中的比例。
如实施例66所示，IK-05074株的固体培养物与比较例25所示的AOK 1006s株的固体培养物相比，邱氏艾美耳球虫的卵囊数目明显减少，并且显示高的卵囊溶解变性活性。
产业实用性 将动物用饲料添加剂与饲料混合，使动物摄取，由此可以促进营养吸收，提高饲料效率。其中所述动物用饲料添加剂含有本发明的曲霉菌和含该菌所生产的酸性酶的培养物。动物肠道内，由于曲霉菌菌体浓度增加，肠内菌群平衡得到改善。并且可以抑制病原菌或球虫的增殖，预防并改善动物的肠道感染症。本发明的饲料也适用于鸡、猪、牛等家禽家畜的饲养。
权利要求
1.动物用饲料添加剂，该动物用饲料添加剂含有选自酱油曲霉(Aspergillus sojae)、塔木里氏曲霉(Aspergillus tamarii)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、黑色曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)的至少一种菌，以及由这些菌生产的含酸性酶的培养物。
2.权利要求1的动物用饲料添加剂，其中，上述菌是酱油曲霉和/或米曲霉。
3.权利要求1或2的动物用饲料添加剂，其中，上述米曲霉是保藏号为FERM BP-10622的米曲霉IK-05074株或者具有与之相同的生产酸性酶的能力的该菌株的突变株。
4.权利要求1-3中任一项的动物用饲料添加剂，其中，上述酸性酶是酸性淀粉酶。
5.权利要求1-4中任一项的动物用饲料添加剂，其特征在于上述菌对于引起动物肠道感染症的病原菌具有抗菌活性和/或具有针对球虫的杀原生动物活性。
6.权利要求1-5中任一项的动物用饲料添加剂，其中，上述培养物含有植物性营养源。
7.权利要求6的动物用饲料添加剂，其中，上述植物性营养源是糙米。
8.饲料，该饲料含有权利要求1-7中任一项的动物用饲料添加剂。
9.饲料的制备方法，其特征在于在含有使菌增殖的营养源的固体培养基中培养选自酱油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉、米曲霉的至少一种菌，使饲料中含有所得培养物。
全文摘要
为了辅助动物的消化活动、提高饲料效率、预防并改善炎症性肠道障碍等动物肠道感染症，可以将选自酱油曲霉、塔木里氏曲霉、臭曲霉、黑色曲霉、米曲霉的至少一种菌与这些菌所生成的酸性酶组合，使动物摄取。
文档编号A23K1/16GK101312657SQ200680043368
公开日2008年11月26日 申请日期2006年8月1日 优先权日2005年9月20日
发明者门田明彦, 铃木源士, 伊藤真治, 杉本康明, 望月正己 申请人:出光兴产株式会社