专利名称：家畜胚胎在金属表面玻璃化冷冻法的制作方法
技术领域：
本发明涉及胚胎生物技术领域，特别是涉及家畜胚胎玻璃化冷冻法。
背景技术：
随着超数排卵技术、体外受精、胚胎移植技术以及动物克隆技术的发展，家畜胚胎已成为商品化产物。胚胎冷冻保存技术对于胚胎的商业化应用和克隆技术的推广极为重要，家畜胚胎冷冻技术已成为胚胎工程技术中的研究热点。近几年胚胎的冷冻保存技术特别是玻璃化冷冻法得到了迅速的发展，玻璃化冷冻技术是快速冷冻与高浓度冷冻保护剂相结合的结果。高浓度冷冻保护剂在快速冷却过程中形成透明的玻璃状固体，冷却过程中黏度很高，但无冰晶形成，避免了冷冻过程中冰晶对细胞脂质膜及细胞骨架结构的损伤，保留细胞内外液体正常的分子和离子分布。玻璃化冷冻操作步骤简单，包括高浓度的冷冻保护剂置换细胞内外的溶液，快速降温，使溶液黏稠度极度提高并固化，放置液氮保存。影响玻璃化冷冻效果的因素主要包括(1)冷冻保护剂。同一种组织细胞，冷冻保护剂的浓度和种类是最重要的一个影响因素。细胞外冷冻保护剂一般采用大分子物质，如多糖(蔗糖、海藻糖)聚乙二醇、胎牛血清白蛋白(BAS)和Percoll等；细胞内冷冻保护剂为具有良好穿透性的小分子物质，如二甲基亚砜、乙二醇和甘油。(2)温度下降速度。降温速度越快越好，可直接投入液氮的方法即微滴法，其降温速度约为2500℃/min。(3)胚胎载体。对胚胎载体的要求是胚胎周围的冷冻保存剂体积应尽量小，与液氮间隔尽量少，操作简便且不易丢失胚胎。
目前的玻璃化冷冻主要采用微管法和微滴法(MICRO-DROP VITRIFICATION，MDV)。微管法中由于微管的存在，使得胚胎的冷冻速度降低，影响了冷冻保存的效率。而微滴法常规的操作是将胚胎液滴直接浸入液氮中，由于液氮中可能含有某些病原微生物，所以胚胎液滴直接与液氮接触会造成胚胎的污染，同时胚胎液滴滴入液氮中，由于温差的关系，胚胎液滴周围的液氮容易气化而形成气团，从而影响了冷却速度。在胚胎冷冻过程中，低温会对胚胎的细胞骨架造成一定的损害，这在一定程度上减弱了胚胎的抗冻能力。
发明内容
针对上述领域的缺陷，本发明提供一种胚胎金属表面玻璃化冷冻法(Metal SurfaceVitrification，MSV)，可以极大的提高胚胎冷却速度，同时在冷冻液中加入细胞骨架保护剂——细胞松弛素B，增强了胚胎的抗冻能力，提高玻璃化冷冻效果。本发明用于家畜胚胎冷冻，可使体外受精囊胚冷冻解冻后的恢复率96％以上，孵化率80-85％。
家畜胚胎金属表面玻璃化冷冻法，包括冷冻保护剂置换胚胎细胞内外液体和冷冻胚胎液滴的快速冷冻步骤，其特征在于快速冷冻是将冷冻胚胎液滴滴在一金属块的上表面，所述金属块浸泡或悬浮在液氮中，且其上表面露出于液氮表面。
所述金属块的材质优选铜块。
所述冷冻保护剂置换胚胎细胞内外液体在39℃的恒温台上进行，采用如下步骤(1)将胚胎放入平衡液中平衡10-20分钟，(2)将胚胎移入VS1液中3-5分钟，(3)将胚胎移入VS2液中20-30秒，然后将2ul的VS2和经冷冻保护剂处理过的胚胎吸入玻璃吸管中形成冷冻胚胎液滴；所述平衡液是DPBS基础液中加入了5μg/ml的细胞松弛素B；所述VS1液是在平衡液中加入了体积百分含量为7.5％DMSO、7.5％乙二醇；所述VS2液是在平衡液中加入了体积百分含量为16.5％DMSO、16.5％乙二醇和终浓度为0.5M蔗糖。
所述平衡液中还添加了体积百分含量为20％的血清和1％抗菌素。
所述家畜胚胎为牛体外受精囊胚或体细胞核移植囊胚。
所述冷冻胚胎的解冻方法在39℃的恒温台上进行，采用如下步骤(1)将冷冻胚胎放入添加了0.25M蔗糖的DPBS基础液中1-3分钟，(2)将胚胎移入添加了0.15M蔗糖的DPBS基础液中5-10分钟，(3)将胚胎移入DPBS基础液中5-10分钟即可。
本发明采用金属表面玻璃化冷冻法(Metal Surface Vitrification，MSV)，将经过冷冻保护液置换后的胚胎液滴直接滴在浸入液氮的金属表面(如图1所示)。由于金属浸入在液氮中，它保持有液氮溶液的低温特点，同时又有金属材料传热快的特性，当冷冻胚胎液滴直接滴在金属表面时，它没有穿过液氮溶液，不会形成液氮气化时的气团，这样就极大的提高了冷冻速度。同时液氮中的杂质如细菌、悬浮颗粒物等不易处理干净，易使胚胎的冷冻环境受污染，从而降低了胚胎冷冻解冻后的存活，同时也影响了胚胎的商业化应用。而金属块表面是很好处理干净的。金属块不管是浸入液氮中或是悬浮在液氮中只要其上表面露在液氮外即可。金属块优选铜块，其传热速度最快。
本发明中冷冻保护剂置换胚胎细胞内外液体步骤分成三步，首先在平衡液中平衡后，再加入低浓度抗冻保护剂二甲基亚砜(DMSO)和乙二醇中置换，然后在高浓度抗冻保护剂二甲基亚砜(DMSO)和乙二醇与细胞外液抗冻保护剂蔗糖中快速置换。本发明还在平衡液中添加有细胞骨架稳定剂细胞松弛素B，进一步提高胚胎的抗冻能力，同时还可添加血清及抗菌素。
冷冻胚胎液滴滴在金属表面后快速冷却形成玻璃化小珠，然后可以将这些小珠装入冷冻管中液氮保存。
本发明的冷冻置换及解冻程序均在39℃的恒温台上完成，这一均一不变的温度条件，使操作简便易行。实验证明，经本发明方法冷冻后的牛体外受精囊胚，解冻后的恢复率96％以上，孵化率80-85％；牛体细胞克隆囊胚冷冻解冻后的恢复率达94.2％，孵化率80.7％，大大提高了胚胎冷冻解冻后的成活率，为家畜胚胎的冷冻保存提供了一个新的方法和思路，从而进一步促进了家畜胚胎的商业化应用，以及家畜克隆技术在生产中的应用，提高了家畜胚胎的经济效益。
图1本发明家畜胚胎在金属表面玻璃化冷冻法示意图1-冷冻胚胎液滴，2-金属块，3-液氮，4-液氮容器。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
以冷冻十枚牛囊胚为例说明本发明的冷冻过程1.冷冻液的配制1.1所用各试剂药品的生产厂家和货号如下DPBS(Gibco，15240-013)DMSO(Sigma，D-5879)乙二醇(Sigma，E-9129)细胞松弛素B(Sigma，C-6762)抗菌素(Gibco，15240-062)蔗糖(Sigma，S-1888)血清FBS(Hyclone，SH30070.03)1.2DPBS基础液将39.5ml DPBS，10ml FBS和0.5ml抗菌素混匀后过滤，冷藏4℃备用平衡液将10ml DPBS基础液和50μg的细胞松弛素B混匀后过滤，冷藏4℃备用VS1将8.5ml DPBS基础液、0.75mlDMSO、0.75ml乙二醇和50μg细胞松弛素B混匀后过滤，冻存于-20℃备用VS2将6.7ml DPBS基础液、1.65mlDMSO、1.65ml乙二醇、1.7115g的蔗糖和50μg细胞松弛素B混匀后过滤，冻存于-20℃备用0.25M蔗糖的DPBS基础液将0.8558g的蔗糖和10ml DPBS基础液混匀后过滤，冷藏于4℃备用0.15M蔗糖的DPBS基础液将0.5135g的蔗糖和10ml DPBS基础液混匀后过滤，冷藏于4℃备用
2.冷冻过程2.1.将恒温台打开，并将恒温台温度设定为39℃，将DPBS基础液，平衡液，VS1，VS2，0.25M蔗糖的DPBS基础液和0.15M蔗糖的DPBS基础液置于培养皿中在恒温台上预热；2.2.在显微镜下选择形态正常的牛囊胚十枚；2.3将十枚牛囊胚在39℃的恒温台将胚胎放入平衡液中平衡10分钟；2.4将胚胎移入VS1液中3分钟；2.5将胚胎移入VS2液中20-30秒，然后将2μl的VS2和经冷冻保护剂处理过的十枚牛囊胚滴到浸在液氮表面的铜块上，形成冷冻颗粒；2.6将含有十枚牛囊胚的冷冻颗粒保存于液氮中，直至解冻。
3.解冻过程3.1在39℃的恒温台，将含有十枚牛囊胚的冷冻颗粒放入添加了0.25M蔗糖的DPBS基础液中1分钟；3.2将十枚牛囊胚移入添加了0.15M蔗糖的DPBS基础液中5分钟；3.3将十枚牛囊胚移入DPBS基础液中5分钟；3.4观察牛囊胚恢复情况，并进行胚胎移植。
从2006年1月至2007年1月，我们在内蒙古和北京分别进行了牛体外受精囊胚和体细胞克隆囊胚的玻璃化冷冻实验，实验结果如下表一牛体外受精囊胚和体细胞核移植囊胚的金属表面玻璃化冷冻效果
图1为本发明家畜胚胎在金属表面玻璃化冷冻法示意图，冷冻胚胎液滴1滴在金属块2上表面，该金属块2浸泡在液氮3中，且液氮贮存在泡沫塑料容器4中，该冷冻胚胎液滴迅速冷冻形成玻璃化小珠。
权利要求
1.家畜胚胎在金属表面玻璃化冷冻法，包括冷冻保护剂置换胚胎细胞内外液体和冷冻胚胎液滴的快速冷冻步骤，其特征在于快速冷冻是将冷冻胚胎液滴滴在一金属块的上表面，所述金属块浸泡或悬浮在液氮中，且其上表面露出于液氮表面。
2.根据权利要求1所述的家畜胚胎在金属表面玻璃化冷冻法，所述金属块的材质为铜块。
3.根据权利要求1所述的家畜胚胎在金属表面玻璃化冷冻法，所述冷冻保护剂置换胚胎细胞内外液体在39℃的恒温台上进行，采用如下步骤(1)将胚胎放入平衡液中平衡10-20分钟，(2)将胚胎移入VS1液中3-5分钟，(3)将胚胎移入VS2液中20-30秒，然后将2ul的VS2和经冷冻保护剂处理过的胚胎吸入玻璃吸管中形成冷冻胚胎液滴；所述平衡液是DPBS基础液中加入了5μg/ml的细胞松弛素B；所述VS1液是在平衡液中加入了体积百分含量为7.5％DMSO、7.5％乙二醇；所述VS2液是在平衡液中加入了体积百分含量为16.5％DMSO、16.5％乙二醇和终浓度为0.5M蔗糖。
4.根据权利要求3所述的家畜胚胎在金属表面玻璃化冷冻法，所述平衡液中还添加了体积百分含量为20％的血清和1％抗菌素。
5.根据权利要求4所述的家畜胚胎在金属表面玻璃化冷冻法，所述家畜胚胎为牛体外受精囊胚或体细胞核移植囊胚。
6.冷冻胚胎的解冻方法，在39℃的恒温台上进行，采用如下步骤(1)将权利要求1-5任一方法得到的冷冻胚胎放入添加了0.25M蔗糖的DPBS基础液中1-3分钟，(2)将胚胎移入添加了0.15M蔗糖的DPBS基础液中5-10分钟，(3)将胚胎移入DPBS基础液中5-10分钟即可。
全文摘要
本发明涉及“家畜胚胎在金属表面玻璃化冷冻法(Metal Surface Vitrificatiom，MSV)”，属胚胎生物技术领域。家畜胚胎在金属表面玻璃化冷冻法，包括冷冻保护剂置换胚胎细胞内外液体和冷冻胚胎液滴的快速冷冻步骤，其特征在于快速冷冻是将冷冻胚胎液滴滴在一金属块的上表面，所述金属块浸泡或悬浮在液氮中，且其上表面露出于液氮表面。本发明可以极大的提高胚胎的冷却速度，避免液氮杂质污染胚胎；同时在冷冻液中加入细胞骨架保护剂——细胞松弛素B，增强了胚胎的抗冻能力，提高玻璃化冷冻效果，用于家畜胚胎冷冻，使体外受精囊胚冷冻解冻后的恢复率96％以上，孵化率80－85％。
文档编号A01N1/02GK101066052SQ20071011900
公开日2007年11月7日 申请日期2007年6月18日 优先权日2007年6月18日
发明者张家新 申请人:北京锦绣大地农业股份有限公司